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Revista Cubana de Pediatría

versión impresa ISSN 0034-7531versión On-line ISSN 1561-3119

Rev Cubana Pediatr v.69 n.2 Ciudad de la Habana Mayo-ago. 1997

 

HOSPITAL PEDIÁTRICO DOCENTE "JUAN MANUEL MÁRQUEZ"

Cuantificación de inmunoglobulinas mediante el espectrofotómetro Shimadzu 160-A

Dra. Martha Leonor Paradoa Pérez,1 Lic. Armando Néstor Montoto Lima2 y Dra. Rosa María Marrero Rodríguez3

RESUMEN

Se realizó la adaptación al espectrofotómetro Shimadzu 160-A para cuantificar inmunoglobulinas (IgG, IgA e IgM) por el método turbidimétrico Fixed time para sistemas Hitachi. El control de calidad se realizó con productos de referencia nacionales e internacionales para precisión y exactitud. Los resultados de las medias (IgG = 12,31, IgA = 2,13 e IgM = 1,38) y desviaciones estándar (IgG = 0,3885, IgA = 0,155 e IgM = 0,129) muestran una dispersión pequeña, y aseguran la validez de nuestro trabajo. Con este estudio se abre la posibilidad de realizar dicha técnica mediante un método rápido y eficaz en un equipo mucho menos costoso que el Hitachi y ampliamente difundido en Cuba.

Descriptores DeCs: IGG/sangre; IGA/sangre; IGM/sangre; CONTROL DE CALIDAD; NEFELOMETRÍA Y TURBIDIMETRÍA/instrumentación.

La inmunología se hace cada vez más importante en el campo de la práctica clínica, y no escapa de este hecho, por supuesto, la pediatría. Numerosas enfermedades en el niño están asociadas a desórdenes inmunológicos (ejemplo: procesos infecciosos) y/o mecanismos inmunológicos forman parte de su patogenia (ejemplo: inmunodeficiencias primarias, autoinmunidad).1-5

Una de las pruebas obligatorias para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades inmunológicas o enfermedades asociadas a desórdenes del sistema inmune, es la cuantificación de inmunoglobulinas en el suero,6-10 que se realiza

fundamentalmente por 2 métodos: inmunodifusión radial7 y turbidimetría.10 Las ventajas del método turbidimétrico para la asistencia clínica y la posiblidad de contar con reactivos para este fin, hizo que nuestro grupo encaminara su trabajo a desarrollar este método.

El inconveniente de no poseer un autoanalizador bioquímico nos hizo plantear además la adaptación al espectrofotómetro Shimadzu 160-A, no diseñado para cuantificar inmunoglobulinas y lograr así su utilización para el desarrollo de esta técnica por turbidimetría.

MÉTODOS

Reactivos:
  • Sueros anti IgG, IgA e IgM (Boehringer Mannheim).
  • Tampón concentrado: tampón fosfato (90 mmol/L, ph 7,4).
  • Polietilenglicol (PEG) 4 %.
Muestras:
  • Suero humano control (Behring).
  • Precinorm U (Boehringer Mannheim).
Patrón:
  • Precimat IgG, IgA e IgM (Boehringer Mannheim).
Método. Determinación cinética de la reacción antígeno por el método fixed-time, descrito para autoanalizadores bioquímicos multicanales (sistemas Hitachi),11, y ajuste a los modos del Shimadzu 160-A.

Las muestras, sueros controles y patrón se diluyen 1 + 20 con solución de cloruro de sodio al 0,9 %.

En las cubetas del equipo, a 1 mL de la mezcla de reacción (antisuero específico más polietilenglicol) se le añaden:

  • 10 m L de muestra o patrón para la IgG.
  • 25 m L de muestra o patrón para la IgA.
  • 100 m L de muestras o patrón para la IgM.
Los cálculos se realizaron mediante la fórmula: C = K * ABS + B, donde:

C: Concentración (g/L).
K: Constante.
ABS: absorbancia (diferencia entre la absorbancia a los 5 min menos la obtenida al minuto).
B: intercepto.

El control de calidad se efectuó:

  1. Mediante productos de referencia internacionales de exactitud (Preci-norm Proteínas, Boehringer Mannheim) y precisión (Precinorm UPX, Boehringer Mannheim).
  2. Mediante sueros de referencia de nuestro laboratorio que cumplieron los objetivos del control en cuanto a su precisión: se analizó un suero humano de un donante de sangre repetidamente (10 veces) para cada inmunoglobulina (IgG, IgA e IgM) con el fin de observar la repetibilidad12 y exactitud: con el empleo de una de las vías recomendadas por la Sociedad Americana de Microbiología.13 El suero se cuantificó por otros centros que cuentan con el método y el equipo Hitachi. Las medias de estos resultados se emplearon como los valores reales de esta muestra por nuestro laboratorio.
Estadística. Se calculó la media de los valores de repetibilidad y de los valores para la exctitud. También se calculó la desviación estándar de los valores de repetibilidad.

Consideraciones metodológicas. Puesta en marcha del Shimadzu 160-A:

Se realizó un ajuste en la manipulación de los modos que muestra el menú del equipo. Dicho menú cuenta con el modo número 5 para la cuantificación de proteínas, pero no para cuantificar inmunoglobulinas por el método para sistemas Hitachi. El programa de este modo no permite obtener diferencias de absorbancia entre 2 tiempos establecidos,14 por lo que impide la realización del método.

Para resolver este inconveniente se seleccionó el modo número 9 por la facilidad para la manipulación de datos por el operador, que permitía la obtención de los valores de absorbacia en los 2 tiempos fijados y calcular la diferencia entre ellos por el operario. El valor de esta diferencia para el patrón se introduce en los datos del programa del modo número 5 y se logra así la obtención de la constante (K) que nos permite realizar la cuantificación de las muestras al aplicar la fórmula.

Según lo establecido para el control de calidad en laboratorios de inmunoserología, el contar con productos de referencia internacionales para precisión y exactitud, valida completamente nuestro trabajo. Sin embargo, el hecho de utilizar un método para sistemas Hitachi en un equipo diferente, indujo a desarrollar un

programa de control en caso de ausencia de estos productos, al utilizar la repetibilidad de un suero en el caso de la precisión y para la exactitud, el valor de un suero medido por el mismo método que nos ocupa y en equipos Hitachi en laboratorios autorizados.12,13

RESULTADOS

La figura muestra el ajuste de modos del equipo para la realización de la técnica de cuantificación de inmunoglobulinas con lo que se logra imprimir la curva de calibración para el día de trabajo y se obtiene el valor de la constante (K) para la realización de los cálculos.
Figura 1
FIGURA. Diagrama de trabajo del equipo SHIMADZU 160-A para cuantificar inmunoglobulinas.

Los valores replicados del suero, así como la media y desviación estándar para cada inmunoglobulina se exponen en la tabla 1. Como podemos observar, la dispersión de los datos del valor central es muy pequeña.

TABLA 1. Precisión: Demostración de la repetibilidad. Valores de un suero de donante de sangre, testado 10 veces para cada inmunoglobulina

 
IgG
IgA
IgM
 
12,5
2,1
1,45
 
12,2
2,36
1,5
 
11,96
2,3
1,3
 
12,8
1,92
1,15
 
11,9
2,18
1,19
 
12,3
2,0
1,38
 
12,9
2,24
1,4
 
12,7
1,9
1,48
 
11,88
2,11
1,45
 
12,0
2,2
1,52
Medias:
12,31
2,13
1,38
Desviación estándar:
0,3885
0,155
0,129
En cuanto a exactitud, se muestran las medias de los valores de cuantificación de inmunoglobulinas del suero

enviado a los otros laboratorios que realizan estas determinaciones por el sistema Hitachi con equipos Hitachi. La media para cada inmunoglobulina pasa a ser el valor de referencia nacional.

Además se muestran los valores de ese suero obtenidos en el equipo Shimadzu 160-A (tabla 2).

TABLA 2. Exactitud: Valores de un suero de donante de sangre testado en 2 laboratorios mediante equipos Hita-chi

 
IgG
IgA
IgM
1
12,8
2,11
2,83
2
13,1
2,16
2,65
1: Medias de los valores obtenidos por los laboratorios de referencia.
2: Valores obtenidos por nuestro laboratorio.
 
Los valores de los productos de referencia se mantuvieron dentro de los límites referidos.

DISCUSIÓN

En el presente trabajo se logró poner en marcha un equipo no programado para cuantificar inmunoglobulinas, que puede así contribuir a una asistencia más calificada de nuestros pacientes.

Con el método que contamos para la realización de la técnica, así como los controles y productos de referencia nacionales e internacionales, aseguramos la validez de nuestros resultados, que proporcionan la calidad requerida.

El programa del laboratorio para el control de calidad de la técnica de cuantificación de inmunoglobulinas cumple sus objetivos, tanto para el estudio de la exactitud como para la precisión, según las normas establecidas internacionalmente.

El resultado de nuestro trabajo abre la posibilidad de cuantificar inmunoglobulinas por turbidimetría, con el empleo del método del Hitachi en un equipo mucho menos costoso y ampliamente difundido en Cuba, que asegura la calidad de los resultados.12,13

SUMMARY

The fixed time turbidimetric procedure for Hitachi system was adapted to the spectrophotometer Shimadzu 160-A. The quality control was carried out with products of national and international reference to check precision and accuracy. The results of the means (IgG=12.31, IgA=2.13 and IgM = 1.38) and standard deviations (IgG=0.3885, IgA=0.155 and IgM=0.129) show a little dispersion and ensure the validity of our method. With this study, it is possible to put into practice this technique by a fast and efficient method in an equipment that is widely used in Cuba and much cheaper than the Hitachi.

Subject headings: IGG/blood; IGA/blood; IGM/blood; QUALITY CONTROL; NEPHELOMETRY AND TURBIDIMETRY/instrumentation.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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  2. Lachamann PJ, Walport MJ. Deficiency of the effector mechanisms of the immune response and autoimmunity. En: Autoimmunity and autoimmune diseases. Chichester: Wiley, 1987:149-171. (CIBA Foundation Symposium; 129).
  3. Carson DA, Chen PP, Kipps TJ, Radoux V, Jirik F, Goldfien RD, et al. Molecular basis for the crossreactive idiotypes on human anti-IgG autoantibodies (rheumatoid factors). En: Autoimmunity and autoimmune diseases. Chichester; Wiley, 1987: 123-34. (CIBA Foundation Symposium; 129).
  4. Cooper MD. Normal B cell development and antibody deficiency diseases. En: Alt FW, ed. Immunology in the twenty-first century, St. Louis: Sigma Chemical, 1992:29-40.
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  6. Johnson AM. Immunoprecipitation in gels. En: Rose NR, Fiedman H, Fahey JL, eds. Manual of clinical laboratory immunology. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1986:14-24.
  7. Fahey JL, McKelvey EM. Quantitative determination of serum immunoglobulins in antibody-agar plates. J Immunol 1965;94: 84-90.
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  11. Neumann U, Kretzier D, Munz E, Schrappe KH, Ziegenhorn J. Measurement of antigen/antibody reaction by the fixed-time procedure. Lab Med 1978;2:62.
  12. Palmer DF, Cavallaro JJ. Some concepts of quality control in immunoserology. Precision. En: Rose N.R, Fiedman H, Fahey JL, eds. Manual of clinical laboratory immunology. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1986:906-7.
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  14. Shimadzu. Quantitative measurement mode. En: Manual for recording spectrophotometer UV-160A Edition Shimadzu 1989: 43-53.
Recibido: 30 de octubre de 1995. Aprobado: 21 de marzo de 1996.

Dra. Martha Leonor Paradoa Pérez. Hospital Pediátrico Docente "Juan Manuel Márquez". Avenida 31 y 76, municipio Marianao, Ciudad de La Habana, Cuba.

1 Especialista de II Grado en Inmunología.
2 Licenciado en Ciencias Biológicas.
3 Especialista de II Grado en Laboratorio Clínico.

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