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Revista Cubana de Pediatría

versión impresa ISSN 0034-7531versión On-line ISSN 1561-3119

Rev Cubana Pediatr v.77 n.1 Ciudad de la Habana ene.-mar. 2005

 

Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana. Centro de Investigaciones Biomédicas (CIBIOMED)

Correlación entre el genotipo y el fenotipo bioquímico en pacientes cubanos con hiperfenilalaninemias

Lic. Reinaldo Gutiérrez,1 Lic. Enna Gutiérrez,2 Dra. Bárbara Barrios3 y Dra. Ligia Marcos4

Resumen

La fenilcetonuria es una enfermedad autosómica recesiva causada por mutaciones en el gen de la enzima fenilalanina hidroxilasa. Posee un amplio espectro fenotípico, que depende principalmente de la actividad residual de la enzima. Objetivos: Determinar la correlación genotipo-fenotipo bioquímico en pacientes a los que se les conoce su genotipo, de acuerdo con la actividad residual de la enzima mutada expresada in vitro, según la base de datos del gen (http://www.mcgillca/pah/db). Métodos: Evaluamos los datos bioquímicos y moleculares de 23 hiperfenilalaninémicos. Se tomó en cuenta la concentración de fenilalanina al nacimiento y la tolerancia a la fenilalanina a los 5 años de iniciado el tratamiento, así como la actividad residual in vitro , de cada una de las mutaciones. Resultados: De acuerdo con la base de datos del gen de la enzima fenilalanina hidroxilasa y los parámetros mencionados anteriormente, 12 pacientes resultaron tener mutaciones severas, 10 intermedias y 1 benigna. Nuestro estudio mostró que existe coincidencia genotipo-fenotipo bioquímico en el 78,2 % de los individuos con fenilcetonuria estudiados. Se demostró que las mutaciones en el gen de la fenilalanina hidroxilasa son el factor principal en la determinación del fenotipo metabólico en los pacientes con hiperfenilalaninemia.

Palabras clave: Hiperfenilalaninemia, fenilcetonuria, genotipo, fenotipo, fenilalanina hidroxilasa.



Las hiperfenilalaninemias son un grupo de alteraciones en el metabolismo del aminoácido fenilalanina (Phe) que presentan gran heterogeneidad genética, clínica y bioquímica. Se define como la elevación de los niveles de fenilalanina en sangre por encima de 2 mg/dL (120 µmol/L) (Online Mendelian Inheritance in Man [Base de datos] Disponible en: http://www.ncbi.nlm.gov/OMIM), se hereda de forma autosómica recesiva y es causada por la deficiencia de la enzima fenilalanina hidroxilasa hepática.1 La disfunción de esta enzima provoca la hiperfenilalaninemia, una enfermedad monogénica que ocurre, principalmente, por mutaciones en el gen de la enzima fenilalanina hidroxilasa, las que en diferentes combinaciones pueden explicar el amplio espectro fenotípico que abarca desde la fenilcetonuria clásica (FCU), hasta la hiperfenilalaninemia benigna, que no necesita tratamiento. Hasta el año 2004 se habían reportado más de 450 mutaciones.2

En Cuba, desde 1984 se inició el Programa Nacional de Prevención de la Fenilcetonuria, según el cual se estudian a todos los recién nacidos mediante el método de Guthrie.3 Los niveles de expresión in vitro de la actividad enzimática residual, obtenidos para las distintas mutaciones, han sido muy útiles para examinar la severidad de las encontradas en Cuba.4

En este trabajo nos propusimos determinar el grado de coincidencia entre el fenotipo bioquímico esperado y el observado en 23 pacientes cubanos con FCU. A estos se les pudo determinar las mutaciones en los alelos, teniendo en cuenta la actividad de la enzima fenilalanina hidroxilasa in vitro y la reportada en la base de datos para este gen (http://www.mcgillca/pah/db).


MÉTODOS

Los pacientes fueron 23 niños y adolescentes con cifras de fenilalanina superior a los 3,5 mg / dL (210 µmol / L), atendidos en el Hospital Pediátrico de Centro Habana y el Hospital Pediátrico de Holguín, y fueron caracterizados molecularmente, mediante una colaboración entre el Centro Nacional de Genética Médica y el Centro de Biología Molecular de la Universidad Autónoma de Madrid.

Se utilizó la metodología PCR-Broad Range DGGE (electroforesis en geles de gradientes desnaturalizantes de rango amplio) y luego secuenciación con un equipo ALF Express Sequencer de Amersham y estuche de reactivos de PROMEGA.5

Para el estudio de correlación genotipo-fenotipo bioquímico, se utilizaron los parámetros siguientes: niveles de fenilalanina al diagnóstico, la tolerancia a la fenilalanina después de 5 años de iniciado el tratamiento, la actividad residual predictiva de la enzima mutada y el tipo de mutación.


RESULTADOS

El estudio de mutaciones del gen de la fenilalanina hidroxilasa en los 23 pacientes cubanos seleccionados, ha sido realizado con anterioridad.6

Clasificación fenotípica de los pacientes

A los 23 pacientes a los que se les pudo completar la caracterización molecular, se les clasificó, como muestra la tabla 1, en 3 grupos fenotípicos: FCU clásica, FCU intermedia e Hiperfenilalaninemia persistente .

Tabla 1. Distribución de los pacientes estudiados según el fenotipo bioquímico

 

Fenilalanina plasma

No. de casos

Porcentaje

FCU severa

> 1200 µmol / L

12

52 %

FCU intermedia

600 - 1200 µmol / L

10

43 %

Hiperfenilalaninemia persistente

< 600 µmol / L

1

4,3 %


Correlación genotipo-fenotipo bioquímico

Al grupo de hipefenilalaninémicos cubanos a los cuales se les determinó el genotipo mediante la técnica de PCR-Broad Range DGGE y secuenciación, se les analizó la correlación genotipo-fenotipo bioquímico, de acuerdo a la base de datos del gen de la fenilalanina hidroxilasa y de la expresión in vitro de la enzima mutada, al fenotipo resultante en homocigóticos y heterocigóticos y a la propia naturaleza de la mutación. Se encontró un porcentaje de coincidencia entre lo esperado y lo observado del 78,2 % (tabla 2).

Tabla 2. Fenotipos metabólicos esperados y fenotipos observados en 23 pacientes con hiperfenilalaninemias

Fenotipo

Esperados

Observados

% de coincidencia

Clásico

> 1 200 µmol / L

17

12

70

Intermedio

> 480 < 1 200 µmol / L

5

10

50

Benigno

> 180 < 480 µmol / L

1

1

100

Total de coincidencia

18 de 23 para el 78,2 %

El 74 % de los hiperfenilalaninémicos cubanos estudiados son heterocigóticos compuestos para dos mutaciones diferentes; el 26 % restante corresponde a homocigóticos. En las tablas 3 y 4 se recogen los datos del genotipo y el fenotipo bioquímico de ambos grupos.

Tabla 3. Relación entre genotipo y fenotipo bioquímico en pacientes cubanos homocigóticos para una mutación

Alelo 1

Alelo 2

ARP (%)

Fenilalanina al diagnóstico (µmol/L)

Tolerancia a la fenilalanina (mg/día)

Fenotipo

R261Q

R261Q

27

991

442

Intermedio

E280K

E280K

1

1 750

338,8

Clásico

I65T

I65T

26

1 114

625,4

Intermedio

R176X

R176X

?

1 083

489

Intermedio

E280K

E280K

1

988,6

388,8

Intermedio

E280K

E280K

1

739,2

No tto.

Intermedio

ARP: Actividad residual predicha de la enzima in vitro; No tto.: No tratamiento


Tabla 4. Relación genotipo-fenotipo bioquímico en pacientes cubanos heterocigóticos compuestos

Alelo1

Alelo 2

ARP (%)

Fenilalanina al diagnóstico (µmol/L)

Tolerancia a la fenilalanina (mg/día)

Fenotipo

R158Q

IVS10

?/0

1 548

ND

Clásico

IVS10

R176X

0/?

84

ND

Intermedio

R261Q

IVS10

27/0

1 452

360

Clásico

V388M

S349P

43/?

1 824

ND

Clásico

R261Q

R68S

27/98

1 248

135

Clásico

R261Q

R252W

27/0,5

1 320

350

Clásico

F39L

R408W

?/2,7

1 413

335

Clásico

R252W

IVS12 nt1g-a

0,5/1

840

358

Intermedio

R261Q

E280K

27/1

852

308

Intermedio

R261Q

E280K

27/1

1 041

182

Intermedio

IVS10

V388M

0/43

1 488

332

Clásico

R252W

R68S

0,5/98

945

340

Intermedio

V388M

E280K

43/1

1 554

330

Clásico

A403V

R68S

100/98

291

No tto.

Benigna

R243X

V388M

1/43

1 500

No tto.

Clásico

R261Q

R408W

27/2,7

1 200

588,3

Clásico

R408W

R68S

2,7/98

2100

355,2

Clásico

ND: No hay datos; ARP: Actividad residual predicha de la enzima in vitro; No tto.: No tratamiento


DISCUSIÓN

Se encontró un porcentaje de coincidencia del genotipo y el fenotipo del 78,8 %, lo que coincide con estudios realizados por otros autores. Ello pone en evidencia que existen otros factores que intervienen en la expresión fenotípica de la mutación.

En los hiperfenilalaninémicos homocigóticos se puede deducir el fenotipo resultante de acuerdo a la severidad de las mutaciones, las cuales han sido descritas con anterioridad. La mutación R176X no ha sido expresada in vitro, pero podemos predecir que producirá una proteína con alguna actividad, ya que el paciente presenta un fenotipo bioquímico intermedio. En los heterocigóticos se puede deducir, en muchos casos, el efecto de una mutación. Por ejemplo, la mutación F39L debe de ser nula o intermedia, ya que en combinación con otra mutación conocida por su actividad casi nula el fenotipo que se observa es clásico, mientras que la S349P debe ser nula, pues en combinación con otra intermedia, el fenotipo se comporta como clásico. Aunque se sabe que existen inconsistencias en cuanto a determinadas mutaciones que en ocasiones no tienen el mismo comportamiento y al parecer hay que tener en cuenta las interacciones entre subunidades que pueden influir en las manifestaciones fenotípicas.7

Se puede observar que los parámetros bioquímicos de los enfermos a quienes se les determinó el genotipo no coinciden en algunos casos con lo esperado. De acuerdo con las mutaciones encontradas, como la E280K, está reportado que en homocigosis debe dar un fenotipo clásico y en dos de ellos se comporta como un fenotipo intermedio. No ocurre así en el paciente con esta misma mutación, donde el fenotipo bioquímico coincide con el genotipo y la tolerancia a la fenilalanina. Cuando analizamos los niveles de tolerancia de acuerdo al fenotipo durante los primeros 5 años de vida, no hay suficiente correspondencia, pues realmente estos valores fueron transgredidos en muchos enfermos y se sabe la importancia de llevar una dieta correcta para mantener los niveles de fenilalanina en concentraciones terapéuticas.8,9

De esta manera se puede predecir el fenotipo bioquímico en la mayoría de los casos (78,2 %): según la combinación de mutaciones estudiada en cada caso y la base de datos del gen de la fenilalanina hidroxilasa de forma similar a como se realiza en otros laboratorios.8,9

Por lo general según la base de datos del gen de la fenilalanina hidroxilasa, la combinación de dos mutaciones severas resulta siempre en fenotipo clásico, dos mutaciones intermedias producen un fenotipo intermedio, y la presencia de una mutación de hiperfenilalaninemia resulta siempre en un fenotipo benigno; por lo que en estos casos se pueden distinguir los pacientes que van a recibir tratamiento dietético y los que no.

Cuando se combinan una mutación severa y una intermedia el resultado debería ser un fenotipo clásico, pero en la población cubana existen inconsistencias en esta relación, como con la mutación R261Q o la V388M que en combinación con mutaciones nulas produce fenotipos clásicos o atípicos. Estos resultados han sido descritos en otras poblaciones para las mutaciones (I65T y R261Q) así como (V388M, Y414C, R158Q).10,11 Todas ellas tienen en común que, al expresarlas in vitro, muestran proteína mutante inmunorreactiva.

Existen cada vez más evidencias que apoyan la hipótesis de que la estabilidad de las proteínas mutantes puede variar, en función de las condiciones celulares y otros factores externos, lo cual puede modular también su actividad residual.12-15

En conclusión, podemos decir que aunque la fenilcetonuria puede considerarse como un rasgo complejo, las mutaciones en el gen de fenilalanina hidroxilasa son el determinante principal del fenotipo metabólico en estos pacientes y hay que señalar que un acercamiento multidisciplinario es la mejor vía para la comprensión y el control individual.

 

CORRELATION BETWEEN THE GENOTYPE AND THE BIOCHEMICAL PHENOTYPE IN CUBAN PATIENTS WIHT HYPERPHENYLALANINEMIAS

Phenylketonuria is a recessive autosomal disease caused by mutations in the gene of the phenylalanine hydroxylase enzime. It has a wide phenotypic spectrum that depends mainly on the residual activity of the enzyme. Objectives: To detemine the genotype-chemical phenotype correlation in patients whose genotype is known, according to the residual activity of the mutated enzime expressed in vitro in accordance with the gene's database (http://www.mcgillca/pah/db). Methods: We evaluated the biochemical and molecular data of 23 hyperphenylalaninemic individuals. The concentration of phenylalanine at birth and the tolerance to phenylalanine at 5 years of the beginning of the treatment, as well as the residual activity in vitro of each of the mutations, were taken into account. Results and conclusions: According to the data base of the PAH gene and of the above parameters, 12 patients had severe mutations, 10 intermediate and 1 benign. Our study showed that there is a genotype-biochemical phenotype coincidence in 78.2 % of the subjects with phenylketonuria that were studied.It was proved that mutations in the PAH gene are the main factor in the determination of the metabolic phenotype in patients with hyperphenylalaninemia.

Key words: Hyperphenylalaninemia, phenylketonuria, genotype, phenotype, phenylalanine hydroxylase.

 

Referencias bibliográficas

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Recibido: 10 de noviembre de 2004. Aprobado: 15 de enero de 2005.
Lic. Reinaldo Gutiérrez. Centro de Investigaciones Biomédicas. Instituto de Ciencias Médicas de La Habana. Ave. 31 No. 3 102, esquina a 146, Playa. Ciudad de La Habana. C.P. 11600.
E-mail: rey@infomed.sld.cu

 

1 Licenciado. en Ciencias Farmacéuticas. Máster en Genética Médica.
2 Licenciado en Ciencias Biológicas. Investigador Auxiliar.
3 Doctora en Ciencias Biológicas. Profesora Titular.
4 Especialista de I Grado en Pediatría. Máster en Nutrición.

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