Instituto Superior de Ciencias Médicas, Villa Clara

Diagnóstico prenatal en células de sangre materna: de la imaginación a la realidad

Dr. Alfredo Gutiérrez Maydata,¹ Dr. Hansjürger Köhler² y Dr. Orlando Pérez González³

1. Especialista de I Grado en Bioquímica Clínica. Asistente. Facultad de Medicina. Villa Clara.
2. Doctor en Ciencias. Director del Instituto de Inmunología. Universidad de Rostock. RFA.
3. Especialista de I Grado en Genética Clínica. Jefe del Laboratorio de Citogenética del Centro Provincial de Genética. Villa Clara.

RESUMEN

Los avances obtenidos en las técnicas de separación de células y en las de la genética molecular, han permitido que comience a vislumbrarse la posibilidad del diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas en células fetales obtenidas de sangre materna, como una alternativa ante los procedimientos actuales que requieren de instrumentación intrauterina y que, por tanto, implican un grado de riesgo, tanto para la madre como para el feto. El estudio citogenético de células fetales, combinado con el uso de anticuerpos monoclonales y procedimientos como la citometría de flujo, separación de células mediante microesferas inmunomagnéticas, PCR e hidratación in situ, son algunos de los métodos actuales que se llevan a cabo en este esfuerzo investigativo creciente que contribuirá a extender los beneficios del diagnóstico prenatal a la mayoría de la población en un futuro no lejano.

Palabras clave: ERITROCITOS/patología; MARCADORES GENETICOS; CITOMETRIA DE FLUJO/métodos; SEPARACION CELULAR/métodos; DIAGNOSTICO PRENATAL/métodos; CITOGENETICA; FETO/citología.

INTRODUCCION

Desde que se introdujo en el mundo la amniocentesis en los inicios de los años 70, la toma de sangre fetal por fetoscopia, más tarde por cordocentesis, y finalmente la toma de muestras de vellosidades coriónicas a mediados de la década del 80, ha hecho posible el diagnóstico de enfermedades genéticas durante la gestación.¹

El programa de diagnóstico prenatal citogenético comenzó en Cuba en 1984, y hasta 1990 se había logrado en el país la prevención de 187 niños afectados.²

Sin embargo, el diagnóstico prenatal citogenético suele restringirse sólo a mujeres con un riesgo mayor de anomalías fetales y cuyo principal criterio de indicación es la edad materna avanzada. Una de las principales razones por las que este estudio no se realiza masivamente se debe a que con las técnicas actuales para obtener el cariotipo fetal a través de la amniocentesis transabdominal en el segundo trimestre del embarazo, o con la biopsia coriónica en el primer trimestre, se expone a la mujer al riesgo de la pérdida o daño fetal.

Esta restricción en el número de gestantes con acceso al estudio prenatal deja un significativo porcentaje de pacientes sin detectar y expone a una población determinada con fetos normales, a los riesgos del procedimiento.

Así, en la provincia de Villa Clara desde 1986 y hasta 1993, el 82,6 % de los niños que nacieron con aberraciones cromosómicas eran hijos de madres jóvenes, a quienes no se les realizó el diagnóstico prenatal por no tener la edad materna avanzada que es el requisito principal; esto significó que en este período (8 años) nacieron vivos 76 niños con síndromes cromosómicos pertenecientes a madres menores de 35 años; de ellos, 57 con Síndrome de Down. [Herrera Martínez H. Enfoque de riesgo en la salud materno infantil. Experiencias de un registro perinatal de cromosomopatía en Villa Clara. Tesis Doctoral Santa Clara, 1994 (En proceso).]. Por otra parte, entre 1988 y 1993 en más del 97 % de las gestantes sometidas al método, los resultados fueron normales, lo que implicó que corrieron un determinado riesgo, aún sin tener un feto afectado.³

Internacionalmente hay una gran motivación para lograr el desarrollo de una tecnología, que tenga entre sus características la de ser lo menos invasiva posible y lo ideal sería lograr el aislamiento y el análisis de las células fetales a partir de una muestra de sangre materna, como la que se obtiene para cualquier estudio de rutina. Ello permitiría extender los beneficios de los estudios prenatales a una población mucho más amplia de embarazadas, limitada sólo por el costo del procedimiento, sin riesgos ni para el feto ni para la madre.

Sin embargo, la frecuencia de células fetales en la circulación materna es extraordinariamente baja. Ahora bien, si a las células con frecuencia de alrededor de 1 % se les ha reservado la categoría de "extraordinariamente raras"⁴ ?cuál utilizar en este caso?, pues la mayoría concuerda con que su incidencia, aunque variable es del orden de una célula fetal en un millón de maternas,⁵ lo que al decir de algunos "el asunto de buscar uno en un millón se mueva hoy del campo de la imaginación a la realidad".⁶

METODO

Para lograr entonces un diagnóstico prenatal exitoso mediante la utilización de células fetales en sangre materna deben seguirse 3 etapas, como ya señalaran Chueh y Golbus.⁷

1. Identificación de las células fetales entre las maternas, mucho más numerosas mediante marcadores celulares específicos.
2. Enriquecimiento de las células a causa de su pequeño número.
3. Estudio genético de las células fetales por técnicas suficientemente sensibles y específicas.

Se han utilizado 3 tipos de células fetales que pueden entrar en circulación materna para obtener el diagnóstico prenatal: linfocitos, células trofoblásticas y eritrocitos nucleados.⁸

Los linfocitos tienen entre sus características una vida media de 4 a 5 años,⁹ lo que constituye la desventaja de la posible persistencia desde embarazos anteriores. Además, la presencia de antígenos HLA en su superficie, aunque permite un medio de identificación para las células de origen fetal, requiere una valoración paterna previa para la distinción entre marcadores de ambos progenitores, lo que limita el procedimiento.⁵

La células trofoblásticas, aunque expresan antígenos de transplantación, no son fácilmente demostrables, debido a que son suprimidos por una capa de mucoproteínas que cubre estas células, lo que dificultaría su identificación.⁹

Los eritrocitos nucleados (normoblastos) parecen ofrecer el mayor potencial para el diagnóstico prenatal,¹⁰ y en lo adelante nos referiremos fundamentalmente a ellos.

1. Identificación de células fetales mediante marcadores celulares específicos: Los normoblastos tienen entre sus ventajas la de ser las células nucleadas que se encuentran en mayor cantidad en la sangre fetal temprana, momento más propicio para llevar adelante la interrupción del embarazo si fuera necesario. Hay alrededor de 50, 10⁹/L (50 000/mm³) en la semana 12 y decrecen hasta 11,10⁹/L (11 000/mm³) en la mitad del embarazo, donde se mantienen hasta el final⁹. Otra característica importante es que están virtualmente ausentes en la sangre de adultos normales, además de que pueden distinguirse del resto de las células maternas por su tamaño, núcleo, tipo de hemoglobina (HbF) y marcadores de superficie.⁵

El receptor de transferrina (antígeno CD71) presente en las membranas de los eritrocitos fetales ha sido utilizado como marcador primario para su identificación en sangre materna,^12,13 mediante el uso de anticuerpos específicos (aunque también se encuentra en linfocitos T y B activados y macrófagos). Se han empleado además, como marcadores, la glicoforina¹³, el antígeno de células progenitoras hematopoyéticas CD34¹⁴ y la HbF¹⁰, en sistemas que usan uno o varios marcadores simultáneamente.

2. Enriquecimiento de las células fetales: Una vez identificado el antígeno de superficie celular y logrados los anticuerpos correspondientes con la avidez y afinidad necesarias, se requiere definir la metodología de enriquecimiento óptima de las células fetales, dada su rareza en el fondo de células maternas. Uno de los métodos empleados con este fin ha sido el uso de la citometría de flujo mediante FACS (fluorescence -activated cell sorting).¹⁵ FACS es utilizado para analizar y separar células en suspensión, sobre la base de que identifica antígenos en la superficie de células vivas.

Cuando una suspensión de células marcadas se coloca en el citómetro de flujo, las células pasan a través de una cámara donde son iluminadas individualmente por un haz de rayos láser. Para cada célula la máquina mide el tamaño, granulosidad, así como la intensidad de fluorescencia, de acuerdo con los antígenos de superficie presentes y los anticuerpos utilizados. Las células son entonces separadas bajo control computadorizado según los parámetros medidos, lo que permite colectar las diferentes poblaciones celulares.

Actualmente FACS es uno de los medios que más se ha utilizado para separar células fetales, y varios investigadores lo han empleado^13,14 con el fin de enriquecer eritrocitos fetales en sangre materna; sin embargo, es un método lento y complicado, que requiere de equipos costosos y operadores con alta especialización, lo que limita su uso en gran escala, cuestión ésta que se requiere para la práctica rutinaria del diagnóstico prenatal.

Recientemente han ocurrido nuevos avances en la tecnología de separación de células, como es el caso del separador de células activadas por magnetismo (MACS)¹⁶ (figura 1).

Fig. 1

MACS fue desarrollado en 1988 en el Instituto de Genética de la Universidad de Colonia, RFA, y permite el aislamiento de subpoblaciones celulares a partir de mezclas complejas, de acuerdo con sus marcadores de superficie. Entre las ventajas del MACS se encuentran la de ser un método rápido, de fácil manipulación y de mucho más bajo costo¹¹ cuando se compara con el FACS.

Las células que se van a enriquecer se identifican con anticuerpos conjugados a ultrimicroesferas magnetizables (anticuerpo-magnetic microbeads), logradas por precipitación de microcristales de ferrita sobre Dextran T-40.¹⁶)

Después del marcaje de las células que van a ser separadas, se hacen pasar a través de una columna que contiene en su interior una matriz magnetizable (lana de acero inoxidable cubierta con un material plástico) que se magnetiza sólo cuando está colocada en el separador MACS, equipo que crea un campo magnético de elevada potencia. La columna trabaja como un filtro extremadamente sensible para las células "magnetizadas",las cuales se unen a la matriz, así son separadas del resto, y eluidas como fracción negativa.

Cuando la columna es removida del campo magnético, la matriz y las microesferas se desmagnetizan totalmente, y las células dejan de estar adheridas, por lo que serán eluidas como fracción positiva.

Un método de enriquecimiento muy efectivo para eritrocitos nucleados en la literatura especializada, utiliza centrifugación en gradiente de densidad discontinuo.¹⁷ La sangre total se coloca en un triple gradiente de histopaque, y después de la centrifugación los normoblastos son eficientemente separados de los linfocitos en una banda distintiva.

En nuestra experiencia en el Instituto de Inmunología de la Universidad de Rostock, RFA, con la separación de normoblastos de sangre de cordón umbilical (3 % de las células nucleadas), combinamos el preenriquecimiento por centrifugación en triple gradiente y el uso a continuación de MACS.

La sangre fue diluida en PBS y la mezcla pipeteada en tubos de centrifugación. En cada tubo se depositaron 2 mL de Ficoll-Histopaque 1 077, 1 110 y 1 119 en capas sucesivas. Después de la centrifugación se hicieron visibles 3 anillos celulares; el intermedio contenía predominantemente normoblastos, entre otras células. Este anillo fue removido y las células incubadas con anti CD71. A continuación se añadieron 20m L de anti IgG(2a+b)--magnetic microbeads (Miltenyi Biotech, RFA) para el marcaje magnético de los eritrocitos nucleados.

A continuación se procedió, como ya se ha descrito, a realizar la separación celular mediante la utilización de MACS. Se obtuvieron los normoblastos en la fracción positiva.

Para el control de calidad de la separación se tomaron muestras de las fracciones positivas y negativas. Las células fueron analizadas mediante un citómetro de flujo FACScan de la firma Becton-Dickinson (figura 2) y por extensiones, teñidas para microscopio óptico (figura 3).

Figs. 2 y 3

El análisis microscópico de la fracción positiva reveló que más del 70 % de las células nucleadas eran normoblastos, los que se encontraban además en un número elevado, suficiente para el estudio genético.

3. Estudio genético de las células fetales: Las técnicas de la citogenética clásica están limitadas para el estudio de las células fetales de sangre materna, debido a la necesidad de células en división y, por ende, de cultivo, por lo que se dirigen pocos esfuerzos en esta dirección.⁵ Dos recientes avances están ya teniendo aplicaciones con ese fin: la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)¹⁸ y la hibridación in situ fluorescente (FISH).¹⁹

Con el advenimiento de la PCR, que permite la amplificación de secuencias específicas de ADN en muestras tan pequeñas como una sola célula, se han obtenido algunos resultados;^9,20 sin embargo, debido al alto número de células maternas que caracterizan las muestras obtenidas, aún después de ser enriquecidas, hay un considerable riesgo de contaminación del ADN. Por ello, su uso está siendo limitado a la determinación del sexo (detección de secuencias del cromosoma Y) o trastornos autosómicos, donde el padre sea el único portador, pues no hay forma de detectar específicamente los cromosomas de origen materno heredados por el feto entre los de las células maternas de fondo.²⁰

No obstante, pudiera esperarse que el perfeccionamiento de esta técnica en el futuro constituye una vía para el diagnóstico de trastornos de un gen único, no posible mediante FISH.

FISH es una técnica que permite determinar el número de copias de un cromosoma dado en muestras de tejidos y frotis de células en interfase mediante el uso de sondas y sistemas de detección fluorescente. La sonda es un fragmento de ácido nucleico de secuencia conocida y caracterizada como propia para un cromosoma determinado. La forma de conocer si hubo hibridación o no se realiza marcando ciertos nucleótidos en la sonda, la cual puede marcarse con biotina.

Posteriormente a la hibridación, la preparación es tratada con un complejo avidina-FITC, cuya emisión verde permite detectar el número de cromosomas para la sonda utilizada en un microscopio de fluorescencia.

El uso de FISH con sondas derivadas de los cromosomas 21, 18, 13, X y Y ha comenzado a dar resultados muy prometedores en el diagnóstico de aneuploidias de estos cromosomas. Ya de hecho, es posible a partir de eritrocitos fetales separados de sangre materna por FACS^21-23 o MACS.^10-12

Particularmente prometedores son los resultados de Gänshirt-Ahlert et al, quienes utilizaron para el enriquecimiento de las células fetales una combinación de gradiente en triple densidad, marcaje con anti-CD71 y separación por MACS, seguido de estudio genético con FISH, y lograron encontrar 5 pacientes con trisomía 18?, 10 de ellos con trisomía 21.

Con estas experiencias, se ha probado al menos que el diagnóstico prenatal no invasivo de enfermedades genéticas mediante la utilización de células fetales de sangre materna puede ser una realidad, y que unido a otros métodos de diagnóstico prenatal, también en sangre materna (determinación de los niveles de alfa-feto proteína, estriol conjugado y gonadotropina coriónica,²⁴ serán de gran valor en el pesquisaje prenatal masivo de alteraciones genéticas, lo que hará que se logre un índice muy superior de prevención, y permitirá que se reserven las manipulaciones intrauterinas con sus posibles consecuencias negativas para la madre y el feto, sólo para aquellas pacientes en que fuera necesario confirmar resultados alterados en estudios en sangre materna precedentes. Entonces la imaginación se habrá hecho realidad.

SUMMARY

The advances obtained in the cell separation techniques and in those of mollecular genetics, allow us to glimpse the possibility of making a prenatal diagnosis of genetic diseases in fetal cells obtained from maternal blood, as an alternative to present procedures that require intrauterine instrumentation and imply a risk, both for the mother and the fetus. The cytogenetic study of fetal cells combined with the use of monoclonal antibodies and procedures such as flow cytometry, cell separation by immunomagnetic microspheres, PCR and hydration in situ, are some of the present methods used as part of this increasing investigative effort, which will contribute to extend the benefits of prenatal diagnosis to the majority of the population in a near future.

Key Words: ERYTROCYTES/pathology; GENETIC MARKERS; FLOW CYTOMETRY/methods; CELL SEPARATION/methods; PRENATAL DIAGNOSIS/methods; CYTOGENETIC; FETUS/cytology.

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Dr. Alfredo Gutiérrez Maydata. Calle 8 edificio 5, apto. 7, entre 3 y 9. Reparto Escambray, municipio Santa Clara, Villa Clara. Cuba.