Hospital Militar Central "Dr. Carlos J. Finlay". Departamento de Microbiología

Nuevo medio de cultivo para el aislamiento de leptospira sp.

Mayor (SM) Idalia Ayala Rodríguez, Mayor (SM) Marta Elena Fors Cruz,¹ Téc. Juan Puentes Díaz y Lic. María Rosa Mas Camacho.

¹ Especialista de I Grado en Microbiología
² Técnico en Investigaciones Microbiológicas
³ Licenciada en Cibernética. Profesor Asistente

RESUMEN

Se muestran los resultados obtenidos en el Laboratorio de Microbiología del Hospital Militar Central "Dr. Carlos J. Finlay" con la utilización de un nuevo medio de cultivo para el aislamiento de cepas de leptospira sp. Se utilizó una muestra formada por todos los pacientes ingresados en el período de enero de 1993 a diciembre de 1994 en el centro antes referido, con el diagnóstico presuntivo de leptospirosis. El medio de cultivo fue ensayado en los Laboratorios de leptospiras del Centro Nacional de Epizootiología y Zoonosis, del Instituto "Finlay", respectivamente. En ambos centros se constató la viabilidad, baja contaminación y buen crecimiento de las cepas en el medio. Para demostrar su efectividad ante cualquier tipo de cepa de leptospira sp. se realizó la identificación de las mismas por serogrupos.

Descriptores DeCS: LEPTOSPIRA/aislamiento & purificación; LEPTOSPIRA/clasificación; SEROTIPIFICACION; MEDIOS DE CULTIVO; LEPTOSPIROSIS/microbiología.

La leptospirosis es una zoonosis causada por espiroquetas del género leptospira.^1,2 Esta enfermedad fue reconocida por primera vez por Weill en 1866, quien la diferenció de otras entidades que producen fiebre o íctero.^3,4 La especie L. interrogans patógena para el hombre, cuenta con más de 170 serogrupos. Entre los más frecuentemente identificados están: L. icterohaemorragiae, L. canícola, L. pomona, L. bataviae y L. ballium.^2,3 En Cuba se aislan con más frecuencia los 3 primeros serogrupos mencionados. (Programa Nacional de Control de leptospirosis. Ciudad de La Habana, Cuba: MINSAP,1981).

En los años 1966- 67, Pérez Carril y Sokolov estudiaron un brote de esta entidad en la región norte de la antigua provincia de Oriente y confirmaron el diagnóstico mediante la observación por microscopía directa en campo oscuro y cultivo en el medio Werwor-Wolff, modificado por Tarasov.⁵

En la actualidad, la microscopía directa es poco utilizada pues por lo regular no se observan casos con altas leptospiremias, ya sea por atención precoz, tratamientos previos o tomas tardías de las muestras. Las pruebas serológicas, más empleadas actualmente por ser rápidas y efectivas, en ocasiones no se concluyen por no acudir el paciente a la toma del segundo suero.^6,7

A partir de 1990 se reportó un alza de la leptospirosis en Cuba según datos del Viceministerio de Higiene y Epidemiología del Ministerio de Salud Pública. La tendencia de la enfermedad es ascendente y acentuada por las condiciones actuales del período especial que afronta el país, dada la existencia de parcelas de autoconsumo, cría de animales, mayor asistencia de personal transitorio a la agricultura, etcétera. En el año 1994 hubo 2 829 casos confirmados de leptospirosis nacionalmente y aumentó la letalidad en Ciudad de La Habana y provincia La Habana con respecto al resto del país en el año 1993 ("Estado actual de la leptospirosis". XII Conferencia Científíca del CIMEQ. Ciudad de La Habana, marzo 1995)

El Hospital Militar Central "Carlos J. Finlay" es una de las instituciones que ha contribuido al conocimiento de las cepas de leptospira sp. circulantes en la Ciudad de La Habana, según datos aportados en conferencia impartida en el I Taller Nacional de leptospirosis que se desarrolló en el Hospital Clinicoquirúrgico "10 de Octubre" en mayo de 1995. Esto se logró gracias a la utilización de un nuevo medio de cultivo idóneo para el aislamiento de esta bacteria.

Los medios de cultivo que utilizaron los centros de referencia e investigaciones de la entidad objeto de estudio son importados o preparados con productos como: suero de conejo, tween albúmina, tween 80, suero bovino, medio libre de proteínas, L-asparagina o peptona,¹ productos todos de importación y muy costosos.

En el presente trabajo se muestran los resultados obtenidos en el cultivo de cepas de leptospira sp con un nuevo medio, así como su viabilidad, baja contaminación y buen crecimiento, lo que permitió la clasificación hasta serogrupo de las cepas en él aisladas.

MÉTODOS

Se estudiaron 135 cepas de cultivo de leptospira sp, 133 aisladas por hemocultivo y 2 de líquido cefalorraquídeo, que se inocularon en el medio de cultivo creado y fue ensayado en el Laboratorio de Microbiología del Hospital Militar Central "Dr. Carlos J. Finlay". El hemocultivo se obtuvo asépticamente antes de la administración de antibióticos y preferentemente durante el estado febril del paciente.

El medio de cultivo ensayado está compuesto esencialmente por sales de sodio e hidróxido de potasio, así como suero de carnero en sustitución del de conejo, tradicionalmente empleado. No se utilizaron otros productos que convencionalmente contienen los medios de cultivo para leptospira, como son: peptona bacteriológica, vitaminas, cloruro de potasio y antibióticos.

La base contenida en frascos de 100 mL con tapa, a razón de 95 mL por frasco, se esterilizó durante 15 min a 121 EC y se guardó hasta su utilización a temperatura ambiente. Para efectuar la siembra se adicionó a la base un pull de sueros de carneros jóvenes en proporción de 5:100 (5 %) y se mantuvo en baño de María durante una hora por 3 días consecutivos, a 56EC y posteriormente se distribuyó en tubos de 5 mL. Se inocularon 3 tubos por paciente con 1,2 y 3 gotas de sangre respectivamente en cada tubo. Comenzó la observación al 5to día y no se descartó su positividad hasta pasados los 30 días de la inoculación. Se observó el cultivo cada 3 ó 5 días, con microscopía de campo oscuro, 16 x 10 aumentos.

Para la identificación de las cepas se utilizó la técnica de microaglutinación en placas, luego de enfrentar la cepa problema a sueros hiperinmunes de serogrupos conocidos. Se identificó la cepa perteneciente al serogrupo en que se observó un mayor título de aglutinación.

RESULTADOS

Durante el período analizado se aislaron un total de 135 cepas de leptospira sp. correspondientes a 54 pacientes ingresados durante el año 1993 y 81 a los ingresados en el año 1994, todas inoculadas en el nuevo medio de cultivo.

De las cepas correspondientes al año 1993, 14 se enviaron a clasificación y de éstas 11 se identificaron dentro de los serogrupos pertenecientes a L interrogans, 1 no fue identificada y 2 resultaron "no viables".

De las cepas aisladas en el año 1994, 78 fueron enviadas a clasificación. De este grupo solo resultaron "no viable" 9 cepas y contaminadas 5 (tabla 1).

TABLA 1. Identificación de cepas de leptospira sp. (1993-1994).

	1993		1994
Cepas	Total	%	Total	%
Identificadas	11	78	64	82
No identificadas	1	7	0	0
No viables	2	15	9	11,5
Contaminadas	0	0	5	6,5
Total	14	100	78	100

Fuente: Registros Laboratorio de Microbiología. HMC "Dr. Carlos J. Finlay"

Los resultados de la clasificación mostraron que el serogrupo pomona fue responsable del mayor porcentaje de casos infectados en ambos años, seguido en orden de importancia por los serogrupos canícola e icterohaemorragiae (tabla 2).

TABLA 2. Identificación de cepas de L. interrogans (1993-1994)

	1993		1994
Cepas	Total	%	Total	%
Pomona	4	36,5	32	50
Canícola	3	27,3	25	39
Ictero	3	27,3	6	9,4
Ballium	1	8,9	0	0
Bataviae	0	0	1	1,6
Total	11	100	64	100

Fuente: Registros Laboratorio de Microbiología. HMC "Dr. Carlos J. Finlay"

DISCUSIÓN

Al analizar los resultados, se observó un mayor número de cepas aisladas en el año 1994 (81) con respecto al año

1993 (54). Esto pudo estar en correspondencia con el alza de la enfermedad reportada en ese año por el Ministerio de Salud Pública, junto a una mayor indicación de hemocultivo de leptospira a los casos febriles ingresados en el Cuerpo de Guardia del Hospital Militar Central "Dr. Carlos J. Finlay", luego de algunos brotes ocurridos en Ciudad de La Habana y un mayor conocimiento de las características clínico-epidemiológicas de esta entidad.^1,4

El porcentaje de cepas "no viables" fue bajo, lo que habla a favor de las posibilidades del medio de cultivo para la conservación de cepas.^1,3,6 Asimismo, fueron pocas sus probabilidades de contaminación, pues no se reportó esta condición en ninguna de las cepas aisladas en el año 1993 y en sólo 5 del año 1994.^1,7 Si se toma en consideración que la mayor parte de los medios de cultivos tradicionalmente utilizados poseen antibióticos en su composición para evitar la contaminación,¹ el medio utilizado, en comparación con los ya conocidos, aporta confiabilidad; además de un ahorro ostensible dadas las dificultades de obtención de antibióticos bajo las condiciones actuales de la economía del país.

El resultado de la clasificación de las cepas evidenció que los serogrupos pomona, canícola e icterohaemorragiae fueron los que con mayor frecuencia afectaron a los pacientes, lo que coincidió con lo reportado en la literatura.^1,2,8 En el presente estudio fue el serogrupo pomona el causante del mayor porcentaje de la enfermedad en ambos años, con 36,5 % en 1993 y 50 % en 1994.

Con el envío de las cepas para su clasificación a los Laboratorios de Referencia del Centro Nacional de Epizootiología y Diagnóstico Veterinario del Instituto "Finlay" se contribuyó al conocimiento de las cepas circulantes en el país, hecho de gran importancia epidemiológica,² así como a otras investigaciones colaterales que complementan la información científica necesaria para la elaboración de la vacuna contra la leptospirosis, actualmente en fase de desarrollo en Cuba.⁸

Para concluir planteamos que mediante la utilización de este nuevo medio de cultivo se pudieron confirmar bacteriológicamente 135 casos sospechosos de leptospirosis ingresados en el Hospital Militar Central "Dr. Carlos J Finlay" durante los años 1993-1994.

El medio de cultivo para el diagnóstico de leptospirosis sp resultó de importancia económica por el ahorro que representó, ya que la sustitución de productos de importación por productos nacionales en su composición abarata el costo y facilita su preparación. Además no sólo permitió confirmar el diagnóstico de la enfermedad, sino que posibilitó conocer las cepas circulantes, elemento de gran importancia epidemiológica e investigativa.

Las cepas clasificadas por los laboratorios de referencia de leptospiras, fueron cultivadas y mantenidas en el medio creado, lo que demostró su viabilidad y baja contaminación.

SUMMARY

Results obtained in the Microbiology Laboratory of "Dr. Carlos J. Finlay" Central Military Hospital with the use of a new culture medium for the isolation of Leptospira sp. strains, are reported. A sample formed by all patients hospitalized during the period of January, 1993 to December, 1994 in the above mentioned center was used for the study. The culture medium was assayed in the laboratories of Leptospira of the National Center of Epizootiology and Zoonosis, and of the "Finlay" Institute. In both centers the viability, low contamination degree, and good growth of the strains in the medium were evidenced. In oder to demonstrate the effectiveness of the culture medium to any type of Leptospira sp. strain, the identification of them was performed by serogroups.

Subject headings: LEPTOSPIRA/isolation & purification; LEPTOSPIRA/ classification; SEROTYPING; CULTURE MEDIA; LEPTOSPIROSIS/microbiology.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Guideliness for the control of leptospirosis. Geneva: Who, 1982(67).

2. OPS. El control de las enfermedades transmisibles en el hombre. 13 ed. La Habana: Editorial Científico-Técnica, 1985:442.

3. Jawetz E, Melvick J, Adelberg E. Microbiología médica. 11 ed. México, DF: El Manual Moderno, 1985.

4. Fernández Mirabal J. Manual de procedimientos de diagnóstico y tratamiento en medicina interna. 29 ed. La Habana: Editorial Pueblo y Educación, 1981:247.

5. Pérez Carril R. Leptospirosis en Oriente Norte: estudio clínico-epidemiológico. Bol Hig Epidemiol 1967;(5):137-40.

6. OMS. Manual sobre procedimientos de laboratorio para Letospirosis. 1968:14-24. (Nota técnica; 9).

7. Suárez Hernández M. Vigilancia epidemiológica con sueros pareados de Leptospira en la atención primaria. Rev Cubana Med Gen Integr 1991;7(3):218-30.

8. Gutiérrez López O. Leptospirosis. Avan Med Cuba 1995;2(2):4-8.Recibido: 14 de marzo de 1996. Aprobado: 13 de julio de 1997.

My. Idalia Ayala Rodríguez. Hospital Militar Central "Dr. Carlos J. Finlay". Calle 114 y Avenida 31. Marianao, Ciudad de La Habana, Cuba.