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INTRODUCCIÓN
En el ámbito militar se han investigado procedimientos médicos para mejorar la salud y disminuir las infecciones tópicas de los lesionados en los enfrentamientos bélicos.1 El propóleo es mencionado en el papiro de Ebers, y en Egipto lo usaban como medicina para desinfectar las heridas.2,3 En Grecia lo utilizaban como recurso para tratar las afecciones de la piel; se usó en conflictos bélicos como ungüento tópico antiséptico;3 ha sido conocido por casi todas las civilizaciones y su uso se ha mantenido hasta la actualidad,2,3 en formulaciones en las áreas de la medicina, farmacia, odontología, entre otras.4,5,6,7
El propóleo es una resina compuesta, parda oscura, que se disuelve en etanol.2,6 Conformada por cera, resinas, etc.2,7 las cuales son acopiados de diversas plantas según su ubicación geográfica, diversidad de especies vegetales y trabajados por un equipo particular de abejas, con el propósito de restaurar las fisuras ubicadas en el panal;5,8,9 presenta una notable acción antibacteriana sobre todo frente a las bacterias grampositivas, a causa de la compleja mezcla de metabolitos secundarios que posee.7,8,9,10 Asimismo se le atribuyen características antinflamatorias, antiparasitarias, antimicóticas, cicatrizante, entre otras.6,10,11,12,13
Rifamicina forma parte de los macrocíclicos compuestos elaborados por Streptomyces mediterranei.14 Es un antibiótico semisintético, esta adscrito a las “ansamicinas”, del equipo de las rifamicinas, se consigue de la rifamicina B como rifamicina SV para uso tópico; tiene efecto bactericida e impide la fabricación del ADN inhibiendo la transcripción de la enzima ARN-polimerasa de las bacterias sensibles y, como resultado, el comienzo de la cadena polipeptídica del ADN.14,15,16 Actúa contra microorganismos grampositivos, posee moderada acción contra gramnegativos; se utiliza en caso de heridas infectadas, quemaduras, furúnculos, piodermitis, dermatitis infectadas, úlceras varicosas y diabéticas y en asociación con apósitos para tratar heridas postquirúrgicas infectadas.15,16 Presenta buena inserción sérica y tisular.15,17 Es exclusivo para uso intravenoso o tópico.16,17 La rifamicina espray comercial, se presenta en 20 mL, cada 100 mL de solución contienen rifamicina SV 1000 mg, equivalente a 1,03186 mg de rifamicina sódica; excipientes: edetato disódico, propilenglicol, ascorbato de sodio, alcohol etílico y agua purificada.16,17,18
Las infecciones bacterianas continúan siendo un importante problema de salud pública en el mundo entero,19,20 desde que se descubrieron los antibióticos, estos son utilizados de forma indiscriminada en los hospitales y clínicas, lo que ha provocado la génesis de cepas microbianas resistentes.19,20 La resistencia puede ser adquirida o transmisible.20
Un antibiótico es inhibido por variados mecanismos creados por distintos microorganismos.19,20 Por esta razón, en medicina militar se deben buscar alternativas de mezclas de antibióticos semisintéticos con productos naturales, que cuenten con estudios sistematizados y validados, de baja toxicidad,1,8,9,10 que no originen resistencia y que puedan erradicar los microorganismos causantes de las infecciones tópicas.10,21
El objetivo de la investigación es evaluar el efecto antibacteriano sinérgico de rifamicina en propóleo sobre bacterias grampositivas.
MÉTODOS
El trabajo de investigación es experimental, in vitro y comparativo. La recolección del propóleo fue artesanal,2 en los meses de junio a agosto del 2019 y aleatorizada, en 15 colmenas de la comunidad campesina de Pargay en Perú.22
Las muestras fueron clasificadas y estabilizadas en el laboratorio de investigación y desarrollo farmacéutico de la Universidad Inca Garcilaso de la Vega. El propóleo fue limpiado, pesado, sometido a una temperatura de 4 °C ± 2 ºC por 12 h, luego fue trozado en pedazos pequeños a manera de un polvo fino.7,8,9
Después se procedió a elaborar los extractos etanólicos con alcohol etílico al 96 % por 15 días, con movimiento cada 12 h; luego se realizó la filtración con papel Whatman Nº 40 y se dispuso en un horno a 40 °C ± 2 ºC hasta consumir el alcohol y lograr un peso seco constante; después se guardó en un envase de vidrio oscuro con tapa de rosca.7,9,11 Se conservó en refrigerador a 4 °C ± 2 ºC hasta su uso.9,10,11
Los metabolitos secundarios se reconocieron mediante la evaluación fitoquímica preliminar, por métodos químicos de reacción por coloración y precipitación, como: Molish (hidrato de carbono), ninhidrina (aminoácidos libres), Dragendorf (alcaloides), Shinoda (flavonoides), tricloruro férrico (compuestos fenólicos), gelatina - sal (taninos), Rosenheim (antocianinas), Lieberman - Burchard (esteroides y triterpenoides), Bornträger (antraquinonas), Legal y Baljet (lactonas sesquiterpénicas), KOH 0,5 M y UV (cumarinas) y el test de espuma (saponinas).23,24
La reactivación del Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Streptococcus pyogenes (ATCC 19615) se realizó según el Clinical and Laboratory Standards Institute,25 se utilizó el Agar Mueller - Hinton (Britania ®),26 se realizó la técnica de siembra por estría escocesa para obtener colonias bien separadas y se llevó a la incubadora en posición invertida a 37 °C por 24 horas.13,27 En la elaboración del inóculo, se utilizaron 5 colonias aisladas de la resiembra en Agar Mueller - Hinton suplementado con 5 % de sangre de carnero y detalladas con un hisopo estéril y se transfirieron en 3 mL de medio líquido infusión cerebro corazón (Britania ®),26 a 37 °C por 3 horas hasta alcanzar una opalescencia razonable.8,25
Se normalizó la densidad del inóculo por medio de espectrofotometría a 620 nm correlacionandola con la densidad estándar del tubo 0,5 del patrón Mc Farland en condición de esterilidad, se obteniene como producto una suspensión de 1-2 x 108 UFC/mL.8,25,27
Para la habilitación de los discos, con anticipación se preparon soluciones etanólicas de propóleo al 20 %, 40 % y rifamicina al 0,5 % (a partir de rifamicina espray comercial al 1 %); para el caso del grupo VI, se realizó una mezcla de rifamicina al 1 % en propóleo al 40 % (1:1); luego se tomó 1 mL de las soluciones de cada grupo y se llevaron a tubos de ensayo de 13 x 100 mm; después se dispuso dentro de los mismos discos de papel filtro Whatman N° 3 estériles de 6 milímetros de diámetro por 24 horas en refrigeración (4 °C ± 2 ºC), con agitación cada seis horas hasta su posterior uso.4,8,13
El ensayo in vitro se hizo en el laboratorio de investigación y desarrollo farmacéutico, se siguieron de manera metódica las directivas de bioseguridad.28,29 Se utilizaron placas de Petri que contenían entre 20 a 25 mL de Agar Mueller - Hinton, las cuales fueron preparadas y estandarizadas con antelación según las especificaciones de Britania®.26,27,28) Se realizaron
96 siembras (48 siembras para cada especie bacteriana) y se distribuyeron en 6 grupos de n = 8 placas, empleando hisopos estériles, los cuales se sumergieron en los inóculos estandarizados para cada cepa al 0,5 del patrón McFarland.25,27 El estriado se realizó de manera paralela y compacta, se rodea todo el diámetro del medio de cultivo, se repite la actividad girando el medio 60 ° dos veces más y se deja en reposo por 10 minutos antes de adicionar los discos.8,10,28
Se dispensaron los discos en los medios, empleando una pinza quirúrgica a 15 mm del borde de la placa de Petri, tocando con poca intensidad la superficie para facilitar su adhesión; se ubicaron 4 discos por placa y todo el proceso se desarrolló en un ambiente estéril.10,25,28,29
Distribución de las siembras en los grupos:
Grupo I: blanco, discos con agua destilada.
Grupo II: control negativo, discos con etanol al 96 %.
Grupo III: control positivo 1, discos con rifamicina al 0,5 %.
Grupo IV: control positivo 2, discos con rifamicina comercial al 1 % marca Rifocina®
Grupo V: experimental 1, discos con propóleo al 20 %.
Grupo VI: experimental 2, discos con rifamicina al 1 % en propóleo al 40 %.
En seguida, las placas que contenían el medio y los discos se colocaron de forma invertida en una incubadora a 37 °C por 24 h.8,30 Después del tiempo de incubación, las zonas sin crecimiento que se generaron en torno a los discos, se juzgaron como halos de inhibición y se evaluaron con calibrador Vernier.8,13,28
Para la valoración de tipo cuantitativa se utilizaron las medidas de los diámetros de los halos de inhibición y el porcentaje del efecto inhibitorio relativo respecto al control positivo.30,31) El efecto antibacteriano se considera alto cuando su porcentaje de inhibición relativo es > 70 %, intermedia entre el 50 - 70 % y baja cuando es < 50 % y para la interpretación de tipo cualitativa se utilizó como patrón la escala de Duraffourd.30,31 Nula (-) si es inferior o igual a 8 mm; Sensible = + de 9 a 14 mm; Muy sensible = ++ de 15 a 19 mm; Sumamente sensible = +++ si fue igual o superior a 20 mm.
Los datos de los halos de inhibición fueron expresados como media aritmética ± ES a un nivel de confianza del 95 % y un error relativo del 5 %; se aplicó la prueba de homogeneidad de varianzas de Hartley, Cochran y Bartlett; el ANOVA de una vía y el HSD de Tukey. Se contempló como nivel de significación (p < 0,05), mediante el software estadístico IBM SPSS Statistic for Windows versión 25.
RESULTADOS
La evaluación fitoquímica inicial detectó la presencia de compuestos fenólicos, taninos, flavonoides, alcaloides, triterpenoides y glicósidos cardiotónicos (tabla 1).
Tabla 1 Evaluación fitoquímica del extracto etanólico de propóleo
| Metabolito Secundario | Reactivo | Propóleo |
|---|---|---|
| Carbohidratos | Molish | + |
| Compuestos fenólicos | FeCl3 | +++ |
| Taninos | Gelatina | ++ |
| Flavonoides | Shinoda | ++ |
| Antocianinas | Rosenheim | - |
| Aminoácidos libres | Ninhidrina | - |
| Alcaloides | Dragendorff | ++ |
| Quinonas | Bornträger | + |
| Triterpenoides | Liebermann | ++ |
| Saponinas | Espuma | - |
| Glicósidos cardiotónicos | Baljet | ++ |
| Lactonas | Legal | - |
| Cumarinas | NaOH 10 % | - |
+++ Abundante, ++ Moderado, + Escaso, - No presenta
Los datos obtenidos a las 24 horas (tabla 2) indican que todos los promedios se ubican dentro de los límites establecidos, a un intervalo de confianza del 95 % y un error relativo del 5 %, por esta razón no se excluye ningún dato.
Tabla 2 Estadística descriptiva del promedio de los halos de inhibición en milímetros de los grupos de ensayo sobre S. aureus ATCC 25923 y S. pyogenes ATCC 19615
*Media ± E.S: media del halo de inhibición de 32 discos en 8 placas por grupo y error estándar para cada cepa bacteriana
En consecuencia, los datos obtenidos a las 24 horas (tabla 3) indican que el grupo VI, experimental 2, rifamicina 1 % en propóleo 40 % (1:1) alcanzó según la escala Duraffourd, muy sensible = ++ y un efecto antibacteriano sinérgico alto, según el porcentaje del efecto inhibitorio sobre S. aureus ATCC 25923 y S. pyogenes ATCC 19615.
Tabla 3 Escala Duraffourd y porcentaje del efecto inhibitorio de los grupos de ensayo sobre S. aureus ATCC 25923 y S. pyogenes ATCC 19615
*De la media del halo de inhibición de 32 discos por grupo.
Al efectuar el test de homogeneidad de varianzas de Hartley, Cochran y Bartlett, se hallaron para Staphylococcus aureus ATCC 25923 (p = 0,000) y Streptococcus pyogenes ATCC 19615 (p = 0,385); se observa que las varianzas son iguales, con excepción de S. aureus ATCC 25923.
En la tabla 4 y tabla 5, al realizar el ANOVA de una vía, se determinaron (p < 0,05), que indica diferencias significativas entre los grupos de ensayo sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
Tabla 4 Anova de un factor de los grupos de ensayo sobre S. aureus ATCC 25923
| Comparación | Suma de cuadrados | gl | Media cuadrática | F | Sig.* |
|---|---|---|---|---|---|
| Inter - grupos | 10531,672 | 5 | 2106,334 | 12517,750 | 0,000 |
| Intra - grupos | 31,298 | 186 | 0,168 | - | - |
| Total | 10562,970 | 191 | - | - | - |
*De 192 discos por 6 grupos de ensayo
Al aplicar el post-hoc T3 de Dunnett, se halló que todos los grupos presentan diferencias estadísticas significativas (p < 0,05), sobre S. aureus ATCC 25923.
Tabla 5 Anova de un factor de los grupos de ensayo sobre S. pyogenes ATCC 19615
| Comparación | Suma de cuadrados | gl | Media cuadrática | F | Sig.* |
|---|---|---|---|---|---|
| Inter - grupos | 10689,575 | 5 | 2137,915 | 16318,747 | 0,000 |
| Intra - grupos | 24,368 | 186 | 0,131 | ||
| Total | 10713,942 | 191 |
*De 192 discos por 6 grupos de ensayo
Al aplicar el post-hoc HSD de Tukey, se encontró que todos los grupos muestran diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05), sobre S. pyogenes ATCC 19615, con excepción del grupo III: control positivo 1 con grupo IV: control positivo 2 (p = 0,674); grupo III: control positivo 1 con grupo VI: experimental 2 (p = 0,584) que son estadísticamente iguales.
DISCUSIÓN
Por sus características geográficas y climáticas, Perú presenta una alta diversidad de recursos naturales, cultivos y plantas medicinales, los cuales aportan facilidades para el desarrollo de una apicultura sostenible.32 En la comunidad campesina de Pargay, distrito de Chuquibambilla, provincia de Grau, departamento y región de Apurímac en Perú, se promueve la siembra de distintas especies vegetales.22,32 Por ello que en la evaluación fitoquímica se detectaron abundantes compuestos fenólicos y mediana cantidad de taninos, flavonoides, alcaloides, triterpenoides y glicósidos cardiotónicos, responsables en conjunto del efecto antibacteriano.4,5,7,9
Al realizar la mezcla rifamicina al 1 % en propóleo al 40 % (1:1), no se apreciaron precipitados ni grumos, debido a que la rifamicina es soluble en alcohol etílico,16,18 y la prueba de solubilidad confirmó la amplia solubilidad del propóleo en el mismo solvente.3,10,13
Para Stepanović y otros,8Fernandes y otros,10 y Krol,21) la asociación del propóleo con algunos antibióticos tendría un uso potencial para el tratamiento de afecciones bacterianas resistentes a los antimicrobianos tópicos tradicionales y podría conducir a una nueva opción para combatir a estos patógenos.33 En los resultados de las tablas 2 y 3 se puede apreciar que la combinación de rifamicina al 1 % en propóleo al 40 % (1:1) mejoró el efecto antibacteriano del propóleo al 20 % alcanzando 19,316 ± 0,1202 mm (96,02 %) y 19,613 ± 0,0820 mm (98,58 %) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
Los resultados indican que rifamicina al 1 % logró 20,116 ± 0,0652 mm y 19,894 ± 0,0823 mm (100 %). Es ligeramente superior a la combinación de rifamicina al 1 % en propóleo al 40 % (1:1) sobre las cepas en estudio, de esta forma se verificó el efecto sinérgico.12,16 Sin embargo, se consideró como resultados preliminares y es necesario establecer la base molecular del efecto sinérgico sobre los microorganismos en estudio.
En el caso del S. aureus ATCC 25923, se utilizó el post- hoc T3 de Dunnett, al hallarse (p = 0,000) con Hartley, Cochran y Bartlett, indicando que las varianzas no son homogéneas. En relación al ANOVA de una vía y posterior HSD de Tukey se pudo apreciar que el efecto antibacteriano de la rifamicina al 0,5 % es similar a la rifamicina al 1 % y a la combinación de rifamicina al 1 % en propóleo al 40 % (1:1), sobre S. pyogenes ATCC 19615.
Oryan y otros,6 y Tito y otros,11 han demostrado la efectividad del propóleo en el tratamiento tópico de heridas complejas agudas o crónicas de diferentes etiologías, hasta su rehabilitación definitiva; disminuye el tiempo de cicatrización y puede ser aplicado solo o en asociación. Los resultados así como la de Oryan y otros,6) Nazeri y otros,9 y Tito y otros,11 son alentadores, para la elaboración de un preparado y por medio de pruebas clínicas estructuradas definir su eficacia real.
Estos estudios podrían determinar el potencial uso clínico del propóleo en combinación con ciertos antibióticos para tratar infecciones tópicas estafilocócicas y estreptocócicas. Dado que las bacterias pueden ser resistentes a diferentes fármacos antimicrobianos, el sinergismo descrito en la investigación es de relevancia y el propóleo puede constituir una alternativa para tratar dichas afecciones.
Se concluye que la combinación de rifamicina al 1 % unida al propóleo al 40 % presenta una mayor actividad antibacteriana in vitro sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Streptococcus pyogenes ATCC 19615 debido a su efecto sinérgico.
