Trabajo original

 

 

APLICACIÓN DE LA HEMOAGLUTINACIÓN EN HECES PARA EL DIAGNÓSTICO DE BROTES DE DISENTERÍA INVERNAL BOVINA

 

APPLICATION OF THE HEMOAGGLUTINATION TEST IN FAECES FOR DIAGNOSIS OF BOVINE WINTER DYSENTERY

 

 

Maritza Barrera*, A. Betancourt**, Damarys Relova*, Carmen L. Perera*, Dalia Rodríguez*** y Paulo E. Brandão****

*Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado. 10, San José de las Lajas, La Habana, Cuba; **Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Agraria de la Habana (UNAH), San José de las Lajas, La Habana, Cuba; ***Centro Nacional de Epizootiología y Diagnostico (CENEDI), Instituto de Medicina Veterinaria, Cuba; ****Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia- Universidad São Paulo, São Paulo, Brasil

 

 

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RESUMEN

La disentería de invierno es una enfermedad infecciosa del bovino, altamente contagiosa, de curso agudo producida por coronavirus bovino (BCoV), que se caracteriza por la producción de diarreas epizoóticas y la dramática disminución de la producción de leche de las vacas en ordeño. Después de diagnosticada por primera vez, en el país existía la necesidad de desarrollar una técnica sencilla, de bajo costo, y con la que se pudiera analizar un gran número de muestras. Se obtuvo un antisuero específico y se estandarizó el ensayo basado en la aglutinación de eritrocitos de hámster para detectar la presencia del virus en heces fecales de bovinos enfermos y su identificación mediante la inhibición de la hemaglutinación empleando el antisuero obtenido. La prueba resultó específica y capaz detectar 5.4 DICT₅₀/mL del virus en heces fecales. La especificidad diagnóstica fue de un 96.15%, mientras que la sensibilidad resultó ser de 79.13%. Durante el diagnóstico activo realizado dentro del programa de control de la enfermedad, la técnica fue aplicada a 480 muestras procedentes de 38 unidades bajo sospecha y permitió la confirmación del diagnóstico clínico epizootiológico de foco de WD en 36 unidades.

Palabras clave: disentería invernal; coronavirus bovino; prueba de hemoaglutinación; diagnóstico

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ABSTRACT

Winter dysentery is a highly contagious acute infectious disease in bovine, which is produced by bovine coronavirus (BCoV). It is characterized by the production of epizootic diarrheas and the dramatic diminution of milk production in milking cows. After being diagnosed for the first time in the country, it was needed to develop a simple and cheap technique for analysing a great number of samples. A specific antiserum was obtained, and the test based on the erythrocyte of hamster agglutination was standardized in order to detect the presence of the virus in faeces of diseased bovines and their further identification by means of the inhibition of hemagglutination using the antiserum obtained. The test was specific and it was able to detect 5,4 TCID₅₀/mL of virus on fecal extracts. The diagnosis specificity was of 96,15%, whereas sensitivity 79,13%. During the active diagnosis conducted in the control program of the disease, the technique was applied to 480 samples coming from 38 farms under suspicion and it allowed the confirmation of the clinic-epizootiologic diagnosis of the diseased herd in 36 farms.

Key words: bovine winter dysentery; bovine coronavirus; hemagglutination test; diagnose

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INTRODUCCIÓN

Las enfermedades gastroentéricas del bovino son una de las primeras causas de muerte o retraso en el crecimiento de terneros neonatos y provocan disminución en los parámetros productivos en bovinos adultos (1, 2). Entre estas se encuentra la disentería de invierno, una enfermedad infecciosa, altamente contagiosa, causada por Coronavirus bovino (BCoV) y que ocurre en el ganado bovino, generalmente en los meses más fríos del año (3,4).

El diagnóstico de la disentería de invierno, basado en elementos clínico-epizoóticos no resulta conclusivo, ya que enfermedades causadas por otros virus como rotavirus, rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR/IPV) y el de la diarrea viral bovina ( BVD) entre otras, pueden causar diarreas en el bovino (5), por lo que, para realizar un diagnóstico conclusivo es necesario demostrar en los animales afectados la presencia del virus y/o la seroconversión, más aún cuando la enfermedad se introduce por primera vez en un país o región (6). Se han empleado diversas técnicas para la detección de BCoV o alguno de sus componentes en heces fecales de bovinos enfermos, entre ellas la PCR (7,8,9), el aislamiento viral que es difícil de lograr y la prueba de hemaglutinación seguida de la comprobación de la especificidad de la reacción mediante la inhibición de la hemaglutinación (10).

En Cuba, esta enfermedad se consideraba como nunca constatada, y a pesar de que se realizaron investigaciones para esclarecer la etiología viral en el síndrome diarreico del ganado bovino, solo se encontró en terneros neonatos rotavirus (11, 12, 13), mientras que en bovinos adultos, se aisló el virus de la diarrea viral bovina (14). A finales del año 2003 se comenzaron a presentar en algunas vaquerías de la provincia Matanzas, una enfermedad con características clínico-epizoóticas, similares a las descritas para la disentería de invierno.

El diagnóstico de la presencia de BCoV por primera vez en Cuba fue realizado por RT PCR, aislamiento viral y la reproducción experimental de la enfermedad (15, 16), después de lo cual era necesario desarrollar una técnica sencilla, de bajo costo, y con la que se pudiera analizar un gran número de muestras, con el objetivo de confirmar el diagnóstico clínico-epizootiológico en rebaños afectados y monitorear la efectividad del programa de control a nivel nacional.

En el caso de BCoV, la Prueba de Hemaglutinación (HA) a partir de muestras de heces fecales - seguido de la inhibición de la HA (IHA) para determinar la especificidad de la reacción - ha sido una de las técnicas descritas para su diagnóstico. Este es un método adecuado para la realización de muestreos a gran escala, debido a que no consume mucho tiempo y es de fácil manipulación (8).

Se presentan los resultados de la obtención de un suero policlonal contra BCoV, la estandarización de las condiciones de la prueba en laboratorio de Virología Animal del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, su validación con muestras de una reproducción experimental y la aplicación en el programa de control que se realizó durante la epizootia.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas virales. BCoV: Kakegawa, donada por el Dr. Paulo Brandão, Universidad São Paulo, Brasil.; Virus de la diarrea viral bovina (BVDV): NADL y Oregón donadas por el Dr. Aynaud Estación Virología Porcina, Francia; Virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina: E8, aislado cubano caracterizado por Barrera (17).

Multiplicación de las cepas. Se utilizó la línea celular MDBK crecida en monocapa en frascos de 25 cm² con medio de cultivo D-MEM (MEM Dulbecco, SIGMA) suplementado con suero de ternero neonato 10%, 0.85 g/L de NaHCO₃, HEPES 0.01 M, penicilina 100 UI/mLy estreptomicina 100 µg/mL). Se inoculó 1 DICT₅₀ /célula de cada cepa y se mantuvieron en el mismo medio pero sin suero a 37^oC hasta que el efecto citopatogénico afectó entre el 80 y 90% de la monocapa celular. Simultáneamente se conservaron frascos sin inocular como control de células.

Titulación viral por punto final: Según el método estándar en microplacas de 96 pocillos estériles, sobre células recién sembradas de MDBK inoculando 50 µL de las diluciones logarítmicas seriadas de base 10. El título se calculó por el método de Reed y Muench y se expresó en dosis infectivas medias en cultivo de tejido (DICT₅₀/mL).

Obtención del suero policlonal. Una vez cosechado el sobrenadante de los cultivos celulares de MDBK infectados con la cepa de BCoV Kakegagua, fue clarificado por centrifugación a 2 500 g durante 20 min a 4ºC, se extrajo una alícuota para su titulación posterior. El virus fue concentrado 100 veces por ultracentrifugación a 33 000 g por 90 minutos. El sedimento se resuspendió en PBS y se conservó a -80^oC hasta su utilización para la inmunización de dos conejos con el siguiente esquema: 1º dosis.- 1 mL de la suspensión viral (con un título de 10^6.5 DICT₅₀/mL) por vía intravenosa. 2ºdosis: A los 7 días se aplicó por vía intramuscular 1 mL del virus concentrado por ultracentrifugación y adyuvado volumen a volumen con adyuvante completo de Freund. 3º dosis: IDEM pero con adyuvante incompleto de Freund a los 14 días de la segunda inoculación. Se realizó la extracción de sangre para serología en el momento de la inoculación y a los 7, 14, 21, 28, 35 y a los 42 días de la 1º inyección se realizó el desangrado final.

Seroneutralización. Se aplicó para la titulación de los anticuerpos específicos a BCoV en el suero de los conejos obtenidos en cada muestreo. Se empleó el método descrito para el virus de la gastroenteritis transmisible (18) enfrentando 25 µL de las diluciones base 2 de los sueros con 100 DICT₅₀ de Kakegagua sobre monocapas de MDBK. La lectura del título se realizó a las 48h.

Tratamiento de los sueros de conejo para IHA. Inactivación a 56°C por una hora seguido de tratamiento con igual volumen de kaolín al 25% en PBS a temperatura ambiente por 30 min y centrifugación a 2 500 g 30 minutos, colectándose el sobrenadante.

Procedencia de las muestras de heces fecales empleadas. Para la estandarización del ensayo y la validación se utilizó un panel de 245 muestras de heces fecales que llamaremos muestras de referencia. De estas, 115 fueron clasificadas como positivas pues procedían de terneros inoculados experimentalmente con BCoV (16) y 130 muestras de heces fecales moldeadas obtenidas de terneros de un rebaño sin historia de enfermedad diarreica o de vacas en ordeño tomadas antes de comenzar la epizootia. En todas se monitoreó la presencia de virus por aislamiento viral.

La técnica se aplicó a 480 muestras de bovinos enfermos que procedían de unidades de doce provincias del país con diagnóstico presuntivo de disentería de invierno, las mismas fueron recepcionadas entre noviembre de 2003 y enero de 2005, para su posterior procesamiento.

Preparación de los extractos fecales (EF) para HA: Se tomó 1g de cada muestra, se diluyó en 3 mL de PBS/AB (PBS 0.01M/BSA al 0,1% pH 7.2), se homogenizó por agitación en vortex un minuto y se centrifugó a 12 000 g durante 30 minutos a 4^oC para obtener el sobrenadante clarificado que constituyó el EF, los mismos se alicuotaban y se guardaban a -70ºC o se procesaban para HA en el momento. Las alícuotas destinadas a aislamiento viral (AV) eran filtradas por acetato de celulosa (0,45 mm) antes de su congelación o inoculación.

Metodología del aislamiento viral (AV). Se inoculaban EF clarificados y filtrados sobre monocapas de cultivo primario de riñón de ternero (CPRT) según la metodología establecida en un trabajo previo (19).

Obtención de glóbulos rojos para la HA (GR): Como parte del establecimiento de las condiciones del ensayo, se evaluaron GR de ratones, ratas y hámsteres (raza Dorado de Siria) machos, adultos procedentes de CENPALAB como fuente de obtención de GR. La extracción de sangre se realizó por punción del plexo venoso del ángulo interno del ojo hacia un tubo con ALSEVER como anticoagulante. Una vez obtenido el paquete de GR, se preparó una suspensión de GR al 0.4% de PBS/AB.

Prueba de HA seguida de IHA (HA/IHA). Se emplearon placas de poliestireno estériles, de fondo en U (Cooke Microtiter System F96). La técnica se desarrollóen volúmenes de 25 µL. de cada reactante, según describe Brandão et al. (10). Brevemente: Los EF fueron diluidas en base 2, en PBS/AB adicionándosele en todos los casos GR 0.4% a cada pocillo . En cada placa se empleó GR de hámster o de rata o ratón en la evaluación inicial y se dejó una fila de control de GR+ PBA/AB como control negativo de HA en la cual no se adicionó suspensión fecal; diluciones base 2 de la suspensión viral de la cepa Kakegagua se utilizaron como control positivo (C+). Se incubó 2 horas a temperatura ambiente (TA) y se leyó el título hemoaglutinante (el inverso de la última dilución donde hubo hemoaglutinación completa). Los EF con título de HA> 4 se consideraron positivas y se les realizó la IHA para determinar la especificidad de esta reacción, para lo cual estas y el control positivo fueron diluidas de igual forma en PBS/AB y se enfrentaron al antisuero de conejo específico tratado con Kaolin en una dilución que contenía 8 U IHA (determinada previamente frente a 8 UHA de la cepa homóloga). Se colocaron controles de HA del suero sin la muestra. Las placas se incubaron a 37^oC durante una hora. Finalmente, se adicionaron GR de hámster al 0.4% a todos los pocillos y se incubó 2 horas a TA. Se consideraron positivas aquellas muestras con reducción del título hemoaglutinante en dos o más logaritmos. El título se expresó como la última dilución que mostró inhibición completa de la hemoaglutinación.

Sensibilidad analítica: Se evaluó el límite de detección de antígenos hemoaglutinantes en EF de 10 muestras de referencia positivas. Se determinó el título infectivo que contenían y se expresó el límite de detección de la HA en DICT₅₀/mL.

Especificidad analítica: Tres alícuotas de c/EF procedentes de 10 muestras de referencia negativas fueron mezcladas vol/vol por separado con c/u de las cepas NADL, Oregón (ambas con un título de 10 ^8,96 DICT₅₀/mL) y E-8 (con un título de 10^7.66 DICT₅₀/mL) para producir 30 muestras, las cuales fueron diluidas seriadamente en base 2, en PBS/AB y examinadas por HA.

Repetibilidad: Los EF de 30 muestras de referencia positivas, y 30 muestras de referencia negativas se evaluaron por triplicado, en diferentes placas y durante tres días consecutivos.

Reproducibilidad: Para el cálculo de este indicador se emplearon EF de 30 muestras de campo que se dividieron en dos alícuotas y se evaluaron simultáneamente por HA/IHA en el laboratorio de virología animal del CENSA y en el laboratorio de virología animal del CENEDI. Ambos laboratorios realizaron la técnica según las condiciones estandarizadas en los protocolos descritos con anterioridad y como control positivo la suspensión de la cepa Kakegagua y el antisuero obtenido.

Sensibilidad y especificidad diagnóstica: Para esto fue empleado todo el panel de EF de las muestras de referencia que fueron analizados por HA y AV.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Desarrollo y estandarización de la HA

Esta prueba se basa en la capacidad de BCoV y otros miembros del subgrupo 2 del género Coronavirus por aglutinar eritrocitos de diferentes especies, en este caso hámster o rata, debido al enlace de la proteína S y la hemaglutinina esterasa de la envoltura con las terminaciones de ácido siálico de las mucoproteínas de la membrana del glóbulo rojo. Tanto la proteína S, como la proteína HE, se unen a residuos del 9-0-ácido acetil neuroamínico (20, 21), y contribuyen a la actividad de hemoaglutinación y hemoadsorción del virus (22).

Los EF de las 10 muestras de referencia positivas, evaluados para la estandarización de la técnica y el C+ Kakegagua, hemaglutinaron eritrocitos de hámster, los títulos HA se encontraban entre 16 y 4,096 y de 4096 para el C+. No se observaron hemaglutinaciones inespecíficas en los 10 EF de las muestras de referencia negativas. No se observaron diferencias en cuanto a los títulos HA de los EF positivos al utilizar GR de Ratón, Rata y Hámster. Esto concuerda con lo reportado por otros autores (23, 24), que no existen diferencias en relación a la capacidad de CBoV para aglutinar eritrocitos de estas tres especies. Finalmente, se seleccionaron los GR de hámster para el desarrollo de la técnica (25, 10) debido a que no hay otro virus (26) asociado a trastornos gastrointestinales en el ganado bovino que aglutine GR de esta especie.

Se obtuvieron sueros de conejo hiperinmunes específicos contra BCoV, después de la 3º dosis el título de anticuerpos neutralizantes alcanzó valores de 512 y 1024 para cada conejo respectivamente (Tabla 1). Los sueros de ambos conejos se mezclaron para obtener el antisuero final de título por IHA de 512, el cual en la dilución correspondiente a las 8 UHA inhibieron la HA de los10 EF positivos.

La repetibilidad del ensayo de HA/IHA resultó ser del 100%, ya que los EF evaluados mantuvieron su condición de positivos o negativos una vez que se evaluaron por triplicado y en tres días diferentes. En cuanto la reproducibilidad de la técnica los resultados concordaron en ambos laboratorios al clasificar 17 muestras como positivas debido a que mostraron reacción de HA específica comprobada por IHA y 13 muestras resultaron negativas; este resultado permitirá la extensión del diagnóstico de esta enfermedad a la red del laboratorios de veterinaria de Instituto de Medicina Veterinaria.

En la evaluación de la sensibilidad analítica, la HA detectó hasta 5.4 DICT₅₀/mL de BCoV, lo que resulta satisfactorio para la identificación de la enfermedad en condiciones naturales, en la que pueden aparecer según el reporte de Mebus (27) alrededor de 10 DICT₅₀/mL durante las primeras horas de las diarreas. En muestras de heces fecales obtenidas de terneros inoculados experimentalmente con BCoV (16), la HA fue capaz de detectar virus entre las 18-24 horas PI, lo que coincidió con la aparición de diarreas y la detección del virus por aislamiento viral en CPRT. Esto demuestra la capacidad de la HA para la detección temprana del virus en heces fecales de animales enfermos.

La prueba de HA resultó negativa cuando se realizó a partir de mezclas de EF negativos a BCoV con los suspensiones virales de BVD e IBR. La especificidad analítica demostrada, hace esta técnica confiable para la detección de BCoV, ya que no hay interferencia con los virus de bovino adulto más frecuentes en nuestro medio, y Rotavirus solo se ha encontrado en terneros recién nacidos. Según el reporte de Smith (5) ambos virus pueden causar un cuadro clínico con características similares a la disentería de invierno.

Otros agentes etiológicos capaces de producir un cuadro clínico similar al desencadenado por BCoV, y que además, poseen la propiedad de aglutinar GR son Parvovirus bovino, que aglutina hematíes de curiel y humano (tipo O), Reovirus bovino, que aglutina eritrocitos de humano (tipo O), Rotavirus bovino, donde la HA se realiza con glóbulos de mono (27) y Torovirus bovino, que aglutina hematíes de ratón, a diferencia de BCoV que puede aglutinar glóbulos de hámster (4, 24, 25).

Evaluación del desempeño diagnóstico

Cuando se comparó la detección de BCoV por HA y AV en muestras de heces provenientes de terneros inoculados experimentalmente, la coincidencia entre los resultados fue de 88.16% (216/245). Estos resultados se resumen en la Tabla 2.

La especificidad diagnóstica calculada fue de un 96.15%, mientras que la sensibilidad resultó ser de 79.13%. Esta discordancia entre la HA y AV en muestras provenientes de terneros inoculados experimentalmente, con presencia de signos clínicos (Tabla 2) se debió a que hubo cinco muestras que resultaron positivas por HA, sin embargo, provenían de animales sanos, con heces fecales moldeadas, negativos a BCoV por aislamiento viral. Podemos especular que la falta de una completa homogenización en este tipo de muestra puede crear artefactos que impidan la sedimentación de los glóbulos y se produzca una falsa aglutinación, por lo que se aconsejaría tomar siempre muestras de diarrea. También pudo interferir en estos resultados, el hecho de que se emplearon muestras provenientes de vacas lecheras sin antecedentes de la enfermedad, que a pesar de no mostrar afectaciones clínicas pudo haber circulación viral en estos rebaños y algunos animales encontrarse en periodo de incubación, que según Espinasse et al. (28) varía entre 2-8 días, con la posible excreción viral sin manifestaciones clínicas.

A pesar de que el ensayo de HA/IHA es considerado como altamente específico (29, 30), debido a que se desechan las reacciones de hemaglutinación falsas (que no son inhibidas por el antisuero), otro de los factores que pudo influir es la variación en la concentración de la suspensión de GR de hámster usada para la hemoaglutinación. Según Brandäo (30) las suspensiones de GR preparadas sin cuantificar por espectrofotometría pueden introducir variaciones en la lectura de los títulos hemoaglutinante, lo que contribuye a generar resultados falsos positivos.

Otra causa de la discordancia entre la HA y el aislamiento viral (Tabla 3) se debió a que en muestras que se logró aislar el virus, provenientes de animales inoculados experimentalmente con BCoV, en 24 de ellas la HA resultó negativa. Esta discrepancia, probablemente está más relacionada con el límite de detección de la HA. Según el reporte de Dinter (29), el ensayo de HA requiere alrededor de 6 DICT₅₀/mL para que sea visible la reacción, similar al observado en esta investigación 5.4 DICT₅₀/mL, lo que permite que escapen animales positivos, con valores de excreción de virus en heces fecales por debajo de esta concentración, los cuales son detectados por el AV, ya que el virus se multiplica en las células y aumenta la cantidad de partículas. Resultados similares han sido reportados por Brandäo et al. (7) quienes, al comparar la detección de BCoV por HA y RT-PCR, plantean la existencia de resultados falsos negativos, debido a bajas concentraciones de virus, insuficientes para ser detectada por HA, pero suficiente por RT-PCR.

El valor predictivo de positividad calculado para el ensayo de HA fue de 95.83%, mientras que el valor predictivo de negatividad fue 84.41%. La eficiencia de la HA, al calcular el índice de Kappa resultó ser de 0.76. Según Ochoa, (31) valores de Kappa entre 0.61 y 0.80 clasifican como buenos.

Estos indicadores reafirman el valor de la HA/IHA para investigaciones a nivel poblacional, donde lo más importante es el diagnóstico a nivel de rebaño (25, 30) para tomar medidas que impidan la diseminación del virus a otros rebaños con las consiguientes pérdidas económicas.

Aplicación de la HA/IHA en el programa de control de la disentería invernal

La aplicación de la HA permitió establecer el diagnóstico primario en el 66.87% (321/480) de las muestras de campo individuales evaluadas y un 94.73% (36/38) del número de unidades afectadas que se estudiaron (Tabla 3).

En el presente trabajo se amplían los resultados de un trabajo anterior (32), al realizar el diagnóstico por HA/IHA de un número mayor de muestras para confirmar a nivel poblacional la presencia de BCoV en todas la unidades donde se presentó la enfermedad en la fase aguda; esta técnica no detectó la existencia de virus en los casos de las provincias Villa Clara y Camaguey, donde los animales en el momento de tomarse las muestras, ya se habían recuperado de la enfermedad; sin embargo, en cinco muestras procedentes de Villa Clara y dos de Camaguey se logró aislar el virus en CPRT, lo que pudo estar relacionado con las bajas concentraciones virales debido a que resultó necesario darle más de cuatro pases en CPRT para lograr un ECP florido y la identificación como BCoV por seroneutralización. Además hay que subrayar que en estas unidades la toma de muestra no se realizó en el momento adecuado pues había transcurrido un mes del inicio del brote. La importancia de la toma de muestra en los primeros días después de comenzados los signos clínicos se demuestra aquí y en el trabajo de la reproducción experimental de la enfermedad (16), pues para poner en evidencia la presencia de antígenos virales de BCoV en las heces fecales es necesario que se encuentre una cantidad de virus de acuerdo con el límite de detección de la técnica que fue 5,6 DICT₅₀/mL

La HA mostró ser un ensayo adecuado para la realización del diagnóstico de la enfermedad a nivel de rebaño por su factibilidad, bajo costo y sencillez para el estudio de grandes cantidades de muestras, lo que concuerda con otros reportes (33, 10 ,25 ,34) mediante su empleo para la detección de los rebaños infectados se logró tomar medidas para impedir la diseminación de la enfermedad a todo el territorio nacional.

 

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(Recibido 7-11-2007; Aceptado 20-7-2008)