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Revista de Salud Animal

versión impresa ISSN 0253-570X

Rev Salud Anim. vol.33 no.3 La Habana oct.-dic. 2011

 

TRABAJO ORIGINAL

 

 

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE UNA MEZCLA PROBIÓTICA DE EXCLUSIÓN COMPETITIVA Y SU ESTABILIDAD EN EL TIEMPO

 

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF A COMPETITIVE EXCLUSION PROBIÓTICO MIXTURE AND ITS STABILITY IN TIME

M. Pérez*, Marta Laurencio*, Ana J. Rondón*, G. Milian*, R. Bocourt**, Fátima Arteaga***

*Universidad de Matanzas «Camilo Cienfuegos» Vía Blanca a Varadero Km 3 ½. Matanzas. Correo electrónico: manuel.perez@umcc.cu;**Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas. Mayabeque. La Habana;***Escuela Superior Politécnica de Manabí. Ecuador


RESUMEN

Se determinó la actividad antimicrobiana in vitro frente a bacterias potencialmente patógenas de una mezcla de exclusión competitiva (MEC) y se determinó la estabilidad de dicha mezcla en el tiempo. Para la obtención de la MEC se sacrificaron cinco pollos de ceba del híbrido H2 adultos y saludables de 45 días de edad. Para determinar la actividad antimicrobiana in vitro se emplearon diferentes cepas indicadoras y para evaluar la estabilidad durante el almacenaje se consideraron dos condiciones de temperaturas: ambiente (32 y 34 OC) y de refrigeración entre 4-8OC. Finalmente se realizó un análisis de la calidad microbiológica de la MEC. Se observó inhibición del crecimiento de todas las cepas indicadoras por la producción de ácido (variante 1), excepto para la cepa Lactobacillus salivarius. La MEC presentó una alta producción de ácido acético, propiónico y butírico. Se demostró una elevada capacidad de crecimiento y estabilidad durante el almacenaje por 30 días de la MEC en condiciones de refrigeración y ambientales, así como una buena calidad microbiológica.

Palabras clave: mezcla de exclusión competitiva; probiótico; actividad antimicrobiana; calidad microbiológica.


ABSTRACT

The in vitro antimicrobial activity against pathogenic potentially bacteria from a competitive exclusion mixture (CEM) and its stability in time were determined. To obtain CEM, five adult and healthy broilers from H2 hybrid of 45 days of age, were sacrificed. The in vitro antimicrobial activity of CEM against indicator strains and its stability during storage at different temperatures were determined. Finally, a microbial quality analysis of CEM was carried out. Growth inhibition of all indicator strains was observed by acid production (variant 1), except from Lactobacillus salivarias. CEM showed a high level of acetic, propionic and butiric acids. A high grow capacity and satiability was demonstrated during 30 days of CEM storage under refrigeration and environmental conditions,as well as a good microbial quality.

Key words: competitive exclusion mixture; probiótico; antimicrobial activity; microbial quality.

(Recibido 8-4-2011; Aceptado 20-10-2011)


INTRODUCCION

La producción avícola intensiva implica la no presencia de la madre junto al pollito en el momento de la eclosión, ni en su futuro desarrollo. Esta situación trae consigo el establecimiento tardío de la microbiota protectora del tracto digestivo de estos animales con la consecuente aparición de enfermedades entéricas, producto de la rápida colonización por microorganismos patógenos. En la actualidad, numerosos países utilizan en la avicultura las mezclas de exclusión competitiva (MEC); sin embargo, en Cuba, no se emplean estos productos, pero existe la experiencia biotecnológica necesaria para desarrollarlos con tecnologías económicamente viables y que a su vez, mejoren el rendimiento productivo y la salud de los animales (1, 2, 3).

Las mezclas de exclusión competitiva están constituidas por microorganismos autóctonos digestivos aislados del tracto digestivo de aves adultas saludables. Estos biopreparados ejercen su efecto probiótico, principalmente por la exclusión de microorganismos patógenos, por su efecto antimicrobiano y la producción de ácido láctico, creando un ambiente favorable para la respuesta inmunológica y la prevención de enfermedades infecciosas en animales y el hombre (4, 5, 6, 7, 8).

El objetivo del presente trabajo fue determinar la actividad antimicrobiana de una mezcla probiótica de exclusión competitiva, evaluar su estabilidad en el tiempo y su calidad microbiológica en frío y a temperatura ambiente.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material biológico

Para la obtención de los cultivos microbianos se sacrificaron cinco pollos de ceba del híbrido H2 adultos y saludables de 45 días de edad, por el método de dislocación cervical (9). Una vez que se pesaron 10 g de raspado de la mucosa en condiciones de esterilidad, se añadieron en 90 mL de caldo de Mann Rogosa Sharper (MRS) para el aislamiento de las bacterias ácido lácticas (BAL) y el cultivo se incubó en condiciones estáticas a 37ºC por 12 h. El aislamiento de las endosporas de Bacillus spp. se desarrolló a partir de la dilución de 10 g de contenido cecal en 90 mL de suero salino estéril (SSE). Esta dilución se sometió a un tratamiento térmico a 71ºC por 10 minutos para eliminar las formas vegetativas. Posteriormente se inocularon 10 mL de la suspensión de endosporas en 90 mL de caldo nutriente y se incubó durante 12 h a 37ºC en condiciones de zaranda a 150 rpm. Posteriormente estos caldos sirvieron de inóculos para la MEC elaborada con materias primas nacionales e incubadas por 24 h a 37ºC en condiciones estáticas.

Determinación de la actividad antimicrobiana in vitro de la MEC frente a cepas indicadoras.

Se empleó la técnica de difusión en agar propuesta por Chaveerach et al. (10). Se tomaron 10 mL de la mezcla y se centrifugaron a 15 000 rpm a 5ºC por 10 min en centrífuga refrigerada (P-selecta-Mixtasel). Seguidamente, se esterilizó el sobrenadante a través de filtros de acetato de celulosa con poros de 0,22 mm (Minisart, satorius 600 kPa max).

El sobrenadante se utilizó en tres variantes:

V1 - Sobrenadante.

V2 - Sobrenadante tratado con la adición de NaOH 0,5 N (hasta pH 7) y pronasa E (MercK) al 1 % para eliminar la acción de ácidos y de bacteriocinas, respectivamente.

V3 - Sobrenadante tratado con la adición de NaOH 0,5N (hasta pH 7) y catalasa (Merck) al 0,1 % para eliminar la acción de ácidos y el peróxido de hidrógeno, respectivamente.

Cepas indicadoras utilizadas.

Las cepas indicadoras que se utilizaron se describen a continuación:

Cepas salvajes de Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus spp. y Klebsiella spp., aisladas del hígado de pollos enfermos e identificadas en el Laboratorio de Investigación y Diagnóstico Aviar (LIDA) de Matanzas. Una cepa de Bacillus subtilis y otra de Lactobacillus salivarius, ambas pertenecientes a la colección de cultivos del Centro de Estudios Biotecnológicos de la Universidad de Matanzas y del Laboratorio de Producción de Alimentos del Instituto de Ciencia Animal.

Todas las cepas indicadoras se inocularon en caldo nutriente enriquecido y se incubaron en zaranda termostatada (MAXQ-600) durante 18 h a 37ºC, a excepción de la cepa de Lactobacillus salivarius que se cultivó en caldo MRS por 18 horas a 37oC, en condiciones estáticas.

Desarrollo de la técnica de difusión en Agar

De los cultivos de las cepas indicadoras se tomaron 200 mL, se inocularon en tubos con 20 mL de agar nutriente enriquecido (con 1 % de Ión-Agar, OXOID) a 45ºC, los que fueron vertidos en placas para su solidificación. En cada placa que contenía las cepas indicadoras se abrieron pocillos de 7 mm de diámetro, en los que se depositaron 20 mL de las variantes 1, 2 y 3 de la mezcla productora. Se realizaron además controles positivos con la mezcla M2 más ácido láctico 1N hasta alcanzar pH 3 y controles negativos con M2 a pH 7. Las placas se mantuvieron a 5ºC por un tiempo de 4 h para una mejor difusión de las sustancias en el agar. Luego se incubaron por 24 horas a 37ºC hasta detectar el crecimiento y la aparición de los halos de inhibición. El diámetro de los halos se midió con una regla milimetrada. A cada valor se le restó el diámetro de los pocillos.

Estabilidad de la MEC-M2 durante el almacenaje en dos condiciones de temperatura

Para caracterizar la estabilidad del biopreparado se utilizó la metodología que empleó Brizuela (11), quien evaluó indicadores de estabilidad de un biopreparado con fines probióticos.

Con este propósito, se desarrolló un ensayo por 28 días, con 10 momentos de muestreos (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 y 28 días). Para ello, se preparó la MEC, la cual se distribuyó en 120 frascos de cristal los cuales se sometieron a dos condiciones de temperatura: refrigeración, 4-8ºC y temperatura ambiente, 32± 2ºC, con tres repeticiones. Se determinó la viabilidad de las BAL y Bacillus sp. y el comportamiento del pH.

Análisis de la calidad microbiológica de la MEC-M2

Se determinó en el Laboratorio de Microbiología de la Planta Libertad de Colón, Matanzas, perteneciente a la Empresa Provincial de Alimentos. Este estudio se realizó diariamente durante la primera semana y después una vez por semana, hasta concluir a los 30 días. Todos los datos presentados son valores medios de dos determinaciones y tres réplicas por tratamiento. En cada uno de los muestreos se desarrolló el conteo de las BAL y Bacillus spp. por el método de las diluciones seriadas (12).

El conteo de microorganismos contaminantes se desarrolló a partir de las normas de Microbiología de los Alimentos para consumo humano y animal (13). Se realizaron diluciones seriadas de las muestras según NC-ISO. Se realizaron diferentes técnicas para determinar los microorganismos contaminantes las cuales se relacionan en la Tabla 1.

Determinación de ácidos grasos de cadena corta, totales y fraccionados

Para su determinación se centrifugaron 5 mL muestras a 10 000 g por 10 min. Se determinaron los contenidos de ácidos grasos de cadena corta, totales y fraccionados (acético, propiónico, butírico, valérico, isovalérico e isobutírico) por cromatografía gaseosa en cromatógrafo Perkin-Elmer Autosystem XL (EE.UU.) equipado con inyector automático, detector de ionización de llama (FID) y columna capilar TR-FFAP, de 30 m x 0,53 mm x 1 µm (Supelco, EEUU). Las condiciones de análisis fueron: temperaturas de 140, 200 y 250ºC en columna, inyector y detector respectivamente y flujo de Helio He (gas portador) de 13 mL.min-1. Se inyectó 1 µL de cada muestra y se empleó una relación de split de 1/3. Como estándar interno se utilizó el ácido crotónico (14).

Procesamiento estadístico

Para el análisis de los datos se utilizó el sistema INFOSTAT Versión 1 (12). Los análisis de varianza se realizaron para verificar diferencias entre medias, con un nivel de significación de P< 0,05. La prueba de Duncan (14) se utilizó para realizar las comparaciones múltiples entre las medias. Los conteos de microorganismos viables se transformaron a Log N, para garantizar las condiciones de normalidad en la curva de crecimiento.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Determinación de la actividad antimicrobiana frente a cepas indicadoras

En la Tabla 2 aparece la acción antimicrobiana de las MEC frente a diferentes cepas indicadoras.

Se observa inhibición del crecimiento de todas las cepas indicadoras por la producción de ácido (variante 1), excepto para la cepa Lactobacillus salivarius, que no fue inhibida. Según estos resultados, se aprecian diferencias (P<0,001) en el diámetro de inhibición que produce la MEC frente a las diferentes cepas indicadoras. En este sentido se observaron halos de inhibición de mayor diámetro cuando la MEC se enfrentó a la cepa de E. coli a las 12, 18 y 24 h. Se conoce que durante las primeras semanas de vida de las aves de granja en Cuba, el principal agente causal de las enfermedades diarreicas es Escherichia coli y aproximadamente el 70 % de las micosis respiratorias en pollitos se acompaña de infecciones por enterobacterias, destacándose la presencia de esta bacteria, como el microorganismo más comúnmente aislado (9,15).

En las variantes 2 y 3, (datos no mostrados) no se observaron halos de inhibición en los pocillos, lo cual demuestra que no se produjo la inhibición por bacteriocinas o peróxido de hidrógeno.

A medida que aumentó la fermentación de los carbohidratos del medio, el pH disminuyó y el halo de inhibición fue mayor. Un incremento del diámetro de los halos se produjo cuando el pH del sobrenadante estaba en 4, lo cual coincide con la hora 24. Resultados similares obtuvieron Reque et al. (16) cuando utilizaron una cepa de Lactobacillus fermentum LPB aislada del contenido intestinal de pollos, la que inhibió in vitro a E. coli, Staphylococcus aureus y Salmonella typhimurium, por la disminución del pH del medio.

La cepa indicadora Lactobacillus salivarius no mostró inhibición en ninguna de las variantes. Estos resultados indican que la disminución del pH hasta 4 no causó ningún efecto en los lactobacilos, lo cual confirma que esta bacteria tiene la capacidad de crecer a pH bajo y en presencia de altas concentraciones de ácidos (17). En el caso de Bacillus subtilis se observó inhibición del crecimiento a medida que disminuyó el pH, resultados que coinciden con lo expresado por Milián (18), quien refiere que las cepas de Bacillus subtilis en estado vegetativo son sensibles a la disminución del pH, efecto que provoca el cese del crecimiento y la formación de la endospora.

Según Van der Wielen et al. (19), Forestier et al. (20) y Nazef et al. (21) las BAL homo y hetero-fermentativas producen ácidos orgánicos tales como láctico, acético, butírico y propiónico, los cuales disminuyen el pH del intestino y previenen la colonización por bacterias indeseables que no proliferan ante tal efecto. Los ácidos orgánicos que producen las BAL actúan sobre las bacterias sensibles al penetrar sus paredes, con la condición de que la molécula de ácido este en forma no disociada. Una vez que estos ácidos traspasan esta barrera se disocian en sus dos componentes, el anión, que modifica el material genético de la célula y el catión, que acidifica el citoplasma, lo que somete a la célula a un alto desgaste energético para neutralizarlo (22).

En la Tabla 3 se muestran los resultados de la producción de ácidos grasos de cadena corta, totales y fraccionados, a las 24 horas de incubación. Los valores muestran que la MEC-M2 produce suficientes niveles de estos componentes antimicrobianos para ejercer su efecto sobre los enteropatógenos intestinales y favorecen un adecuado balance de la microbiota intestinal. Esta característica incide en la reducción del pH intestinal, lo cual se considera el principal factor en la inhibición del desarrollo de enteropatógenos como Salmonella spp., Escherichia coli y Campylobacter spp. (23,24). Además, la acidificación del lumen intestinal acelera las reacciones bioquímicas de la digestión (7, 8).

Se conoce que los AGCC (principalmente el ácido propiónico) pueden inhibir la síntesis de colesterol en el hígado (25). El uso continuo de probióticos favorece la producción de niveles apreciables de estos ácidos; esta pudiera ser una de las causas por las que su empleo reduce la producción de esta sustancia (26).

Estabilidad de la MEC durante el almacenamiento en dos sistemas de temperatura

En la Figura 1 aparecen los resultados del conteo de BAL y Bacillus spp. y la determinación del pH durante la primera semana y a los 14, 21 y 28 días. Se observa, que al cuarto día, tanto a temperatura ambiente como en refrigeración, la viabilidad de las BAL comienza a disminuir paulatinamente hasta el séptimo día y posteriormente se mantiene estable hasta los 28 días. En cambio, para Bacillus los valores se mantienen constantes. En condiciones de refrigeración el conteo de viables de BAL manifestó mejor estabilidad hasta las 72 h, mientras que a temperatura ambiente se produce una disminución paulatina de este grupo microbiano. Este resultado pudiera estar dado porque las BAL producen ácido láctico y AGCC (27, 17), lo cual provoca que disminuya el pH a niveles muy bajos y algunas células no resistan estas condiciones. De igual manera en el caso de las células de Bacillus se detiene el crecimiento y comienza la formación de las endosporas en esta etapa. Estas estructuras de resistencia permiten la viabilidad por largos períodos de tiempo (28).

El pH de la mezcla se mantuvo sin variaciones en condiciones de refrigeración hasta los 28 días. Sin embargo, a temperatura ambiente, a las 72 h se observa una disminución de estos valores, manteniéndose estable hasta los seis días. A partir de los siete días hasta los 14 se presenta un incremento, manteniéndose estable hasta el final.

Algunos autores consideran como aceptable que los cultivos con actividad probiótica presenten una concentración celular en el orden de 9 Log UFC. mL-1 (29). Los resultados que se muestran en el presente trabajo pueden considerarse estables hasta los 30 días para ambas temperaturas, ya que se obtienen conteos superiores a las dosis establecidas para emplearse como mezclas de exclusión competitiva. Brizuela (11), Rondón (17) y Milián (18), obtuvieron resultados similares en productos probióticos cuando evaluaron la estabilidad de BAL y Bacillus.

En relación al comportamiento del pH, en ambas mezclas hay un mejor comportamiento de estabilidad en condiciones de refrigeración. A temperatura ambiente, probablemente estos cambios se producen debido a las reacciones metabólicas que desarrollan los lactobacilos en la degradación de aminoácidos procedentes del medio o de la lisis de células muertas. Estos procesos ocurren cuando se agotan los carbohidratos del medio y las células utilizan a los aminoácidos como fuentes de carbono en el metabolismo celular. En estas reacciones, los grupos amino de los aminoácidos son removidos y el amoníaco puede aparecer como producto secundario, con lo cual el pH del medio tiende a aumentar.

Investigaciones futuras deberán dirigirse a evaluar otros métodos de conservación, como el secado, para mantener la viabilidad en el tiempo con mejor estabilidad.


Calidad microbiológica de la MEC a los 30 días

La observación al microscopio, a partir de la tinción de Gram, mostró que existen abundantes formas bacilares y estructuras esporuladas. En la Tabla 4 se observan los resultados de la caracterización microbiológica de la mezcla durante el almacenaje.

Se puede apreciar que la mezcla presenta niveles altos de lactobacilos y bacilos sin presencia de contaminantes. Las condiciones de asepsia a nivel de laboratorio y la acidez característica del cultivo, favoreció la no proliferación de agentes microbianos extraños durante todo el período de almacenaje. A los 30 días, presentó buena calidad sanitaria, ya que es un biopreparado libre de contaminantes. Resultados similares obtuvieron Rondón (17) y Milián (18) al evaluar biopreparados probióticos para uso avícola.



CONCLUSIONES

Se demostró que la mezcla de exclusión competitiva manifestó actividad probiótica in vitro, debido a su acción antimicrobiana frente a microorganismos potencialmente patógenos como E. coli y Salmonella.

Se confirmó que la MEC-M2 obtenida presentó estabilidad en la viabilidad microbiana hasta los 30 días, tanto a temperatura ambiente como en refrigeración.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue realizado con el financiamiento del Ministerio de Ciencia, Tecnología y Medio Ambiente de Cuba y la Escuela Superior Politécnica «Manuel Félix López» en Ecuador, además contó con el apoyo metodológico del Dr. Carlos Martín Medina de la Universidad de Matanzas «Camilo Cienfuegos» de Cuba.

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