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INTRODUCCIÓN
La infección por Salmonella spp. (salmonelosis) es un problema de gran atención para la Organización Mundial de la Salud (OMS), ya que constituye la segunda causa de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) a nivel mundial (1). En países desarrollados, como los miembros de la Unión Europea, la infección por cepas de Salmonella spp. tuvo una tasa de incidencia de 20,4 por cada 100 000 habitantes en 2016 (2), mientras que en Estados Unidos causa 1,2 millones de infecciones y 450 muertes anuales (3). En América Latina, en la región del Caribe las cepas de Salmonella spp. se encuentran dentro de las tres bacterias patógenas de mayor incidencia como ETAs, con un incremento en la información de casos en los últimos 20 años (4).
Existen más de 2 500 serovares de Salmonella enterica (5), con un amplio rango de hospederos (6); en su mayoría provocan afectaciones gastrointestinales en el ser humano, infección sistémica en el ratón y un cuadro crónico asintomático en aves (7). Además, pueden ser transportadas en frutas, hortalizas y vegetales (8). Se conoce que el serovar Typhimurium puede ser encontrado en el tracto gastrointestinal de varias especies de animales, e incluso, puede replicarse en tejidos de algunas plantas (9). El surgimiento de cepas de Salmonella spp. resistentes a una gama de antimicrobianos, y su capacidad de formar biopelículas, hacen que en la actualidad representen un grave problema de salud humana y animal en países desarrollados y en países en vías de desarrollo (10-12). Esta bacteria posee riesgo de adquirir y transferir factores determinantes de resistencia ante la exposición a antibióticos, lo que es específico de cada cepa y del lugar de procedencia (13).
En Cuba se han identificado cepas de Salmonella enterica subsp. enterica, aisladas de carnes de aves importadas, resistentes a antibióticos como la ceftriaxona y la tetraciclina, que son medicamentos de primera elección para el tratamiento de salmonelosis (14). Además, se han informado cepas de Salmonella aisladas de humanos, con elevados porcentajes de resistencia a la tetraciclina, ampicilina, doxiciclina, amoxacilina/ácido clavulánico y las sulfas (15). En el periodo de 2008-2009 se identificaron 178 cepas de S. enterica aisladas de alimentos en diferentes regiones de Cuba, que presentaron resistencia a antibióticos como la tetraciclina (70,7 %), ampicilina (22,7 %) y ácido nalidíxico (14,7 %) (16), por lo que se hace necesario mantener la vigilancia sobre este patógeno y, en especial, la búsqueda de alternativas para su tratamiento.
Los aceites esenciales, mezclas naturales usualmente formadas por numerosos metabolitos secundarios, poseen actividad como antifúngicos, antivirales y antibacterianos, incluyendo la actividad sobre cepas resistentes a antibióticos (17,18). Entre las plantas aromáticas, los aceites de las familias Lamiaceae y Verbenaceaeae han sido ampliamente estudiados por sus propiedades farmacológicas para el tratamiento de problemas respiratorios y desórdenes gastrointestinales (17). Además, se conoce que los aceites esenciales de Ocimum gratissimum L., Lippia graveolens (Kunth) y Thymus vulgaris L. poseen propiedades antimicrobianas sobre un gran número de bacterias, tanto Gram positivas como Gram negativas (19).
El desarrollo de nuevos antimicrobianos a partir de aceites esenciales requiere de investigaciones sobre sus potencialidades en las condiciones existentes en cada país; se deben tomar en consideración dos elementos principales: i) la variabilidad química de estos productos naturales, debido a la existencia de quimiotipos, diferencias en las condiciones edafoclimáticas y los métodos de obtención, entre otros factores (17) y ii) la variación en la susceptibilidad entre cepas de una misma especie de microorganismo, existente de manera intrínseca o asociada al desarrollo de resistencia adquirida (13). El objetivo de este trabajo fue determinar la actividad antibacteriana de aceites esenciales de plantas cultivadas en Cuba sobre cepas de Salmonella enterica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de aceites esenciales
Se utilizaron aceites esenciales obtenidos a partir de Piper aduncum subsp. ossanum (C. DC.) Saralegui, Piper aduncum L. subsp. aduncum, Mentha piperita L., Mentha spicata L., Ocimum basilicum var. genovese L. Ocimum gratissimum L., Rosmarinus officinalis L., Thymus vulgaris L., Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake, Eugenia axillaris L., Citrus sinensis (L.) Osbeck, Citrus paradisi Macfad, Curcuma longa L., Lippia graveolens (Kunth).Todos los aceites se extrajeron por el método de hidrodestilación durante tres horas, empleando un equipo Clevenger (20,21), excepto los aceites de Citrus obtenidos por el método de expresión (17).
Cepas
Se utilizaron las siguientes cepas: Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC14028 del cepario del Laboratorio de Ensayos para el Control de la Calidad e Inocuidad de los Alimentos (CENLAC), Salmonella enterica, del cepario de Bacteriología Animal del CENSA, aislada de muestra clínica de cerdo (Scl) y cinco cepas de Salmonella enterica subsp. enterica del cepario del CENLAC (S02, S04, S06, S08, S10); estas últimas resistentes a antibióticos como la ampicilina, cefazolina, y cefoxitina (datos no publicados). Las cepas se identificaron mediante técnicas morfológicas y bioquímicas.
Actividad antibacteriana de aceites esenciales
Las bacterias se sembraron en medio Agar Triptona Soya (Biocen) y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. A partir de las colonias obtenidas, se prepararon suspensiones bacterianas en solución salina estéril (NaCl (Merck), 8,5 mg/mL), a una concentración de inóculo de 21 x 109 ufc/mL, equivalente a una densidad óptica de 0,45 a una longitud de onda de 620 nm en un espectrofotómetro (T90 +UV/Vis Spectrometer PG Instruments Ltd), verificada por conteo de viables sobre Agar Triptona Soya.
La sensibilidad de estos microorganismos a cada aceite esencial se evaluó por el método de difusión en agar, según la técnica estandarizada por el Instituto de Estándares de Laboratorios y Clínicas (CLSI-2016) (22). Para ello, a partir de la suspensión bacteriana se tomaron alícuotas de 100 μL y se sembraron con espátulas de Drigalski en placas Petri estériles de 9 cm con 20 mL del medio cultivo Agar Triptona Soya.
Seguidamente, cuatro discos de papel de filtro (Whatman1) de 6 mm de diámetro se colocaron de forma equidistante sobre el medio inoculado con las suspensiones bacterianas; dos tratados con 10 μL del aceite y dos discos control (sin aceite) por placa. Las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo se midió el halo de inhibición del crecimiento y se clasificó la actividad antibacteriana en fuerte (diámetro del halo de inhibición > 20 mm), intermedia (12,0 < diámetro del halo de inhibición ≤ 20,0 mm) y débil (diámetro del halo de inhibición ≤ 12,0 mm) (23). Se seleccionaron como promisorios los aceites que provocaron una inhibición fuerte. La evaluación se realizó por cuatriplicado para cada tratamiento.
La actividad de los 15 aceites se determinó sobre las cepas ATCC14028 y Scl de Salmonella enterica. Los aceites que fueron efectivos en el primer ensayo se seleccionaron para la evaluación de su actividad a dosis de 10 y 5 μL sobre las cepas de Salmonella enterica subsp. enterica, resistentes a antibióticos β lactámicos. Se utilizó como control positivo ciprofloxacina (Liofilchem, 5 μg/μL)
Las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) y concentraciones mínimas bactericidas (CMB) se determinaron mediante el método de las diluciones seriadas en medio base caldo rojo fenol (Biolife) y maltosa (Merck) a 1 mg/mL. Al medio se le adicionó DMSO 4 % (Merck) para facilitar la solubilización del aceite. Las concentraciones de aceite evaluadas fueron 2 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL y 0,125 mg/mL. La prueba se realizó por triplicado y se incluyeron los siguientes controles: medio de cultivo, DMSO (40 µL/mL) en medio de cultivo, DMSO (40 µL/mL) y aceite (2 mg/mL) en el medio y el medio inoculado con la cepa correspondiente conteniendo DMSO (40 µL/mL). Los tubos con las diluciones de los aceites se inocularon con 100 µL y las suspensiones bacterianas con concentración de108 ufc/mL, para una concentración final por tubo de 105 ufc/mL. Se incubaron a 37°C y se determinó la concentración mínima inhibitoria del crecimiento (CMI) después de 24 h. La CMI se estableció como la mínima concentración del aceite que inhibió el crecimiento visible del microorganismo después de la incubación. En aquellos casos donde se observó inhibición, se tomó una asada y se sembró en una placa de Agar Triptona Soya, libre del agente antimicrobiano. La CMB fue la más baja concentración del aceite que resultó en un subcultivo negativo.
Análisis estadístico
Para el proceso de selección de los aceites promisorios, se agruparon los aceites según los valores de los halos de inhibición obtenidos con 10 µL de los aceites; para ello se realizó un análisis de conglomerados Jerárquico con distancia Eucledia por el método promedio (UPGMA). Los datos de 5 y 10 µL de los aceites promisorios y el antibiótico control se compararon estadísticamente mediante un análisis de varianza simple, y las medias se contrastaron con la prueba de comparación de rangos múltiples de Duncan a una probabilidad de error 5 %. Se empleó el paquete estadístico InfoStat/L, 2016.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los 15 aceites evaluados por difusión en agar mostraron diferentes halos de inhibición sobre las cepas de Salmonella ATCC14028 y Scl. El análisis de la actividad antimicrobiana de los aceites sobre las dos cepas evaluadas en conjunto, representado en un dendograma jerárquico como parte del análisis de conglomerados (Fig. 1), mostró la distribución de estos aceites en tres grupos (A, B y C), con grado de coeficiente cofenético de 0,973, lo que indica una buena representación.
Los grupos obtenidos se correspondieron con la clasificación de la actividad antibacteriana de estos aceites según la escala propuesta por Mazzarrino (23). Los aceites en el grupo A (aceite esencial de T. vulgaris y L. graveolens) evidenciaron una actividad antibacteriana clasificada como fuerte, en el grupo B (aceite esencial de O. gratissimum) intermedia y en el grupo C con actividad débil (P. aduncum subsp. ossanum, P. aduncum subsp. aduncum, M. piperita, M. spicata, R. officinalis, M. quinquenervia, y C. sinensis) o no inhibitaria (O. basilicum var. genovese, E. axillaris, C. paradisi y C. longa).
FIGURA 1 Agrupamiento jerárquico de quince aceites esenciales según halos de inhibición del crecimiento bacteriano de Salmonella enterica serovar Typhimurium (cepa ATCC14028) y Salmonella enterica (cepa Scl). Código de aceites esenciales: 1 Piper aduncum subsp. ossanum (C. DC.) Saralegui, 2 Piper aduncum L. subsp. aduncum, 3 Piper auritum (Kunth), 4 Ocimum basilicum var. genovese L., 5 Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake, 6 Thymus vulgaris L., 7 Ocimum gratissimum L., 8 Curcuma longa L., 9 Menthas picata L., 10 Eugenia axillaris L., 11 Citrus sinensis (L.) Osbeck, 12 Rosmarinus officinalis L., 13 Citrus paradise Macfad, 14 Mentha piperita L., 15 Lippia graveolens. /Hierarchical grouping of fifteen essential oils according to the inhibition halos of the bacterial growth of S. enteric serovar Typhimurium (ATCC14028 strain) and S. enterica (Scl strain). Code of essential oils: 1 Piper aduncum subsp. ossanum (C. DC.) Saralegui, 2 Piper aduncum L. subsp. aduncum, 3 Piper auritum (Kunth), 4 Ocimum basilicum var. Genovese L., 5 Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake, 6 Thymus vulgaris L., 7 Ocimum gratissimum L., 8 Curcuma longa L., 9 Mentha spicata L., 10 Eugenia axillaris L., 11 Citrus sinensis (L.) Osbeck, 12 Rosmarinus officinalis L., 13 Citrus paradisi Macfad, 14 Mentha piperita L., 15 Lippia graveolens.
Los halos de inhibición, que provocaron los aceites de R. officinalis y O. basilicum sobre la cepa ATCC14028, coinciden con los datos observados por Texeira et al. (24). El aceite esencial de M. piperita inhibió débilmente a las cepas de Salmonella utilizadas, mientras que C. paradisi no inhibió el crecimiento, lo que se corresponde con lo informado para el aceite esencial de M. piperita destilado en Turquía (25) y el aceite comercial de C. paradisi del Centro de Investigaciones de las Producciones de Cítricos en Italia (23).
La actividad antibacteriana de aceites esenciales de M. spicata, M. piperita, R. oficinalis y O. basilicum de plantas cultivadas en Colombia se evidenció sobre cepas de S. enterica subp. enterica serovar Typhimurium ATCC14028 y serovar Enteritidis ATCC13076; sin embargo, estos aceites no inhibieron el crecimiento de las cepas de Salmonella utilizadas en el ensayo de difusión en agar. Las diferencias pudieran deberse a que este efecto depende de los componentes de los aceites, que pueden variar en correspondencia con los quimiotipos de las especies vegetales de donde proceden (17), las condiciones edafoclimáticas en que se desarrollan las plantas y/o la susceptibilidad de las cepas de Salmonella spp.
Es conocida la actividad inhibitoria de los aceites de T. vulgaris de origen español, de O. gratissimum desarrollado en Brasil y de L. graveolens de plantaciones mexicanas sobre cepas de S. enterica (24,26,27). Los resultados demuestran que las esencias de estas plantas cultivadas en Cuba poseen una actividad inhibitoria fuerte sobre cepas de esta especie. No obstante, en la literatura no se encontraron datos de la actividad de estos aceites sobre cepas de S. enterica resistentes a antibióticos. La determinación de las potencialidades de aplicación práctica de los tres aceites bioactivos sobre cepas de Salmonella circulantes en el país requiere la evaluación de sus efectos sobre un grupo de cepas que mostraron resistencia a los antibióticos (β lactámicos).
Los tres aceites bioactivos seleccionados inhibieron el crecimiento de las siete cepas de Salmonella enterica subsp. enterica (Tabla 1); su espectro de acción incluyó cepas resistentes a β lactámicos. Las aplicaciones de 10 µL de los aceites provocaron halos superiores o similares a los obtenidos con 5 µL.
TABLA 1 Actividad antibacteriana de diferentes dosis de aceites esenciales de Thymus vulgaris, Ocimum gratissimum y Lippia graveolens sobre cepas de Salmonella enterica subsp. enterica. /Antibacterial activity of different doses of Thymus vulgaris, Ocimum gratissimum and Lippia graveolens essential oils on Salmonella enterica subsp. enterica strains.
| Cepas de Salmonella | Halo de inhibición (mm) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Ocimum gratissimum | Lippia graveolens | Thymus vulgaris | Ciprofloxacina | ||||
| 5 µL | 10 µL | 5 µL | 10 µL | 5 µL | 10 µL | (5 µg) | |
| ATCC14028 | 23,7 ± 1,2 C | 26,0 ± 1,2 BC | 22,0 ± 1,2 C | 44,0 ± 2,0 A | 45,3 ± 1,2 A | 46,0 ± 1,7 A | 31,0 ± 1,0 B |
| Scl | 16,7 ± 0,3 E | 21,7 ± 2,0 DE | 24,7 ± 0,9 D | 40,3 ± 1,6 B | 35,0 ± 1,7 BC | 47,3 ± 0,6 A | 34,0 ± 1,0 C |
| S02 | 33,7 ± 0,9 BCD | 37,3 ± 0,9B | 22,0 ± 1,5 E | 35,7 ± 0,7 BC | 28, ± 1,5 D | 53,0 ± 1,0 A | 30,5 ± 0,5 CD |
| S04 | 34,3 ± 1,2C | 56,7 ± 1,7 A | 24,3 ± 1,2 D | 43,3 ± 1,3 B | 50,3 ± 2,2 A | 50,3 ± 0,6 A | 25,5 ± 0,5 D |
| S06 | 31,7 ± 0,9CDE | 44,3 ± 1,9 B | 24,0 ± 1,5E | 37,3 ± 1,5 BC | 35,7 ± 0,7 CD | 60 ± 2,5 A | 28,0 ± 1,0 DE |
| S08 | 32,0 ± 0,6 C | 50,0 ± 0,6 A | 20,7 ± 0,7 E | 41,7 ± 0,3 B | 34,3 ± 2,2 C | 53,0 ± 0,6 A | 26,5 ± 0,5D |
| S10 | 35,7 ± 0,3 CD | 55,0 ± 0,6 A | 29,7 ± 2,2 E | 46,0 ± 1,5 B | 41,3 ± 2,2 BC | 57,3 ± 0,9 A | 32,0 ± 1,0 E |
Letras diferentes en la misma fila indican diferencias significativas (p<0,05).
El aceite de T. vulgaris con aplicaciones de 10 µL mostró halos de inhibición, en un rango de 46,0 a 60,0 mm, significativamente superiores a los obtenidos por la ciprofloxacina para todas las cepas evaluadas. A esta dosis, los aceites de O. gratissimum y L. graveolens también provocaron una mayor o similar inhibición del crecimiento bacteriano que el antibiótico empleado en el ensayo para todas las cepas, excepto O. gratissimum sobre la cepa proveniente de una muestra clínica de cerdo.
Ante la presencia de cepas de Salmonella resistentes a antibióticos β lactámicos, se hace recurrente el uso de flouroquinolonas como la ciprofloxacina (28), antibiótico sintético de segunda generación de amplio espectro de acción (29). La propuesta de desarrollo de un antibacteriano competitivo, basado en los aceites seleccionados, debe partir de que los niveles de actividad demostrados sean iguales o superiores a los antibióticos disponibles, como la ciprofloxacina. Además, sería de gran importancia si presentara un modo de acción novedoso, lo que estaría en correspondencia con la variedad de componentes presentes en cada aceite esencial y la posibilidad de que cada componente interactúe en diferentes sitios dianas, o uno mismo sobre varias dianas. Esto permitiría lograr un control efectivo de la enfermedad causada por cepas resistentes de este microorganismo.
Se conoce que los aceites esenciales pueden actuar sobre membrana citoplasmática, lípidos, complejos enzimáticos, ácidos nucleicos, provocan la pérdida de iones necesarios en el funcionamiento celular, modifican el pH intracelular, disminuyen ATP interno, incluso, pueden actuar sin afectar la morfología de la célula por sus características lipídicas (30,31). Los resultados responden a la necesidad de nuevos medicamentos con acción igual o superior a los disponibles. Estudios posteriores deberán profundizar en el modo de acción de estos aceites sobre las cepas de Salmonella.
En la determinación de la CMI y CMB (Tabla 2), el aceite de L. graveolens causó daño letal a las células, a la mitad de concentración que los aceites de O. gratissimum y T. vulgaris, sobre las siete cepas, coincidiendo los valores de CMI y CMB, con excepción de la cepa S04. En el caso del aceite de O. gratissimum, las CMI y CMB coincidieron en todas las cepas, siendo mayores para las bacterias resistentes a antibióticos que para las cepas S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 y S. enterica, muestra clínica de cerdo. Mientras que, el aceite de T. vulgaris provocó un efecto similar en todas las cepas, exceptuando a S. enterica muestra clínica de cerdo y a la cepa resistente S10 que fueron sensibles a concentraciones menores de este.
Los tres aceites evaluados provocaron la inhibición del crecimiento del 50 (CMI50) y 90 % (CMI90) de las cepas evaluadas a igual concentración; para L. graveolens fue 0,5 mg/mL, mientras que para O. gratissimum y T. vulgaris fue de 1 mg/mL. La esencia de T. vulgaris fue menos activa que las de O. gratissimum y L. graveolens sobre S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC14028; aunque la CMI (1 mg/mL), que se obtuvo para el aceite destilado a partir del material vegetal cubano, fue similar a la CMI (1,25 mg/mL) informada para la especie cultivada en Colombia (32) e inferior a la CMI (10 mg/mL) para el de la planta desarrollada en España (24). Estas diferencias en la actividad biológica pudieran estar asociadas a cambios en la composición química de este aceite y en las cepas evaluadas (33).
TABLA 2 Concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB) de los aceites de Thymus vulgaris, Ocimum gratissimum y Lippia graveolens sobre cepas de Salmonella enterica. / Minimumin hibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of the oils from Thymus vulgaris, Ocimum gratissimum and Lippia graveolens on Salmonella enterica strains.
| Cepas de Salmonella enterica | Ocimum gratissimum | Lippia graveolens | Thymus vulgaris | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| CMI (mg/mL) | CMB (mg/mL) | CMI (mg/mL) | CMB (mg/mL) | CMI (mg/mL) | CMB (mg/mL) | |
| ATCC14028 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | 1,0 |
| Scl | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| S02 | 1,0 | 1,0 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | 1,0 |
| S04 | 1,0 | 1,0 | 0,5 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| S06 | 1,0 | 1,0 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | 1,0 |
| S08 | 1,0 | 1,0 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | 1,0 |
| S10 | 1,0 | 1,0 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 1,0 |
De todas las cepas evaluadas, la cepa más susceptible a la acción de los tres aceites esenciales fue S. enterica aislada de una muestra clínica de cerdo, seguida de la cepa de referencia S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC14028. Entre las cepas resistentes a antibióticos, la más susceptible a los tres aceites bioactivos fue la S10.
En la literatura consultada no se refiere la acción antibacteriana de los aceites de O. gratissimum y L. graveolens sobre S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC14028. O. gratissimum inhibió el crecimiento de Salmonella enterica serovar Choleraesuis (Smith) CCT4296, a una concentración de 0,6 mg/mL (26), valor que se encuentra en el rango de CMI determinado para las cepas evaluadas, lo que indica que esta subespecie podría manifestar una susceptibilidad similar al aceite cubano; mientras que Hernández et al. (27) demostraron la actividad de la esencia de L. graveolens sobre Salmonella enterica serovar Typhi con valores de CMI (0,125 mg/mL) y CMB (0,250 mg/mL), inferiores a los obtenidos para las cepas evaluadas. A valores mayores de concentración es de esperarse mayor efecto inhibitorio; sin embargo, estos datos reflejan y reafirman la importancia de evaluar cada producto natural con diferente origen y método de obtención, con cepas microbianas que posean variabilidad en la susceptibilidad intrínseca de la especie y que, además, puedan adquirir nuevas susceptibilidades como la resistencia a antibióticos.
Al ser una mezcla de compuestos, los aceites esenciales tienen la capacidad de actuar sobre diferentes sitios dianas (30,34). El efecto antibacteriano puede deberse a que un mismo componente puede actuar por disímiles vías y/o a la acción aditiva o sinérgica de varios constituyentes sobre uno o múltiples sitios diana, lo que implica que los compuestos que se encuentren en concentraciones menores potencien la actividad de otros (35,36). Esto representa una ventaja para la utilización de estos compuestos como antibióticos, pues es menor la probabilidad de desarrollo de resistencia.
Aunque los tres aceites poseen actividad inhibitoria, al analizar entre métodos los resultados, el candidato más promisorio no coincide, ya que T. vulgaris es por difusión en agar y L. graveolens por el método de dilución seriada. La prueba por difusión en agar se utilizó como ensayo inicial, pues permite evaluar simultáneamente numerosos aceites que pueden ser aplicados directamente a los discos, utilizando pequeñas cantidades de muestra y sin necesidad de usar disolventes; sin embargo, posee limitantes asociadas a la poca capacidad de propagación en el medio agarizado de los componentes con baja polaridad, que en gran medida forman parte de los aceites esenciales. Además, la interpretación de los resultados se ve influenciada por factores relacionados con el disco de la sustancia a evaluar (tamaño, cantidad de compuesto impregnado, adsorción) (37). Los resultados indican las potencialidades de los aceites seleccionados de inhibir el crecimiento de cepas que circulan en Cuba, independientemente de sus capacidades para difundir en el agar.
Según la Farmacopea Europea, la prueba por dilución seriada para la determinación de la CMI es el ensayo recomendado para determinar actividad antimicrobiana de productos naturales. Su aplicación para el estudio de los aceites también tiene desventajas: mayor tiempo de duración del ensayo, mayor número de recursos y poca solubilidad del aceite en el medio acuoso (37). Para eliminar esta última desventaja, se incorpora un disolvente que permite una mayor homogeneidad de la concentración de la sustancia a evaluaren el medio de ensayo. El DMSO empleado como disolvente no interfiere en el ensayo de dilución. Por estas características, la técnica de dilución se utilizó para el estudio de los aceites que se seleccionaron como promisorios.
En el campo alimentario se están dando pasos para la incorporación de los aceites esenciales en el tratamiento de patógenos capaces de provocar ETAs. Estos productos naturales se han evaluado en carnes, leche, vegetales, frutas y jugos (8,38). Componentes como trans-cinamaldehído, carvacrol, eugenol y el ácido 2,4 dihidroxibenzoico reducen las poblaciones de Salmonella spp. en tomates cuando se introducen en el agua de lavado (39), y la presencia de alguno(s) de ellos en los aceites bioactivos estudiados pudiera asociarse al efecto observado. Aunque en Cuba se han realizado estudios de actividad antibacteriana de aceites esenciales, los trabajos consultados no abordan directamente su introducción en los modelos alimentarios, tema que deberá ser objeto de otros estudios.
Los aceites esenciales de O. gratissimum, L. graveolens y T. vulgaris de origen cubano mostraron actividad antibacteriana sobre cepas de Salmonella enterica, incluso sobre cepas resistentes a antibióticos β lactámicos. Este resultado constituye un criterio importante para la selección en la etapa inicial de investigación y continuar su desarrollo hasta la posible obtención de un producto antibacteriano para combatir la salmonelosis. La compleja composición química de estos aceites aumenta sus posibilidades de tener varios modos de acción y, por tanto, disminuir el peligro de aparición de resistencia en los organismos diana, elementos importantes para la obtención de antimicrobianos competitivos en el mercado.
