Artículo original

Evaluación in vitro del potencial probiótico de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77

In vitro evaluation of the probiotic potential of Lactobacillus acidophilus SS80 and Streptococcus thermophilus SS77

Juan Emilio Hernández-García¹ 

Laureano Sebastián-Frizzo^{2  3} 

Juan Carlos Rodríguez-Fernández¹ 

Gregory Valdez-Paneca¹ 

María Virginia-Zbrun^{2  3} 

Ibrahin Calero-Herrera¹ 

¹Universidad de Sancti Spíritus. “José Martí Pérez”. Departamento de Medicina Veterinaria-Facultad de Ciencias Veterinaria UNISS-FCA, Cuba.

²Laboratorio de Análisis de Alimentos, Instituto de Ciencias Veterinarias del Litoral, Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (ICIVET-CONICET/UNL). Argentina.

³Departamento de Salud Pública, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Litoral. UNL-FCV. Argentina.

RESUMEN

El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar in vitro las propiedades probióticas de las cepas de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77 para uso animal. Las cepas fueron caracterizadas mediante pruebas bioquímicas, de hemólisis, de resistencia a diferentes pH, a concentraciones de sales biliares, y prueba de antagonismo microbiano frente a cinco patógenos de animales y autoagregación, coagregación e hidrofobicidad. Los resultados mostraron que ambas cepas producen peróxido de hidrógeno, lipasa y lecitinasa. S. thermophilus SS77 fue positivo a proteólisis de la caseína; sin embargo, las cepas no produjeron aminas biógenas desde los aminoácidos Lisina, Tirosina y Triptofano. Además, S. thermophilus SS77 utilizó la Alanina a partir de las 36 h, mientras que L. acidophilus SS80 usó Histidina a partir de las 72 h. Las dos cepas resultaron negativas a la prueba de hemólisis y difieren significativamente en los valores de pH alcanzados en leche descremada en polvo a partir de las 2 h. Crecieron a pH 6,5 y 5,5 y resistieron al jugo gástrico simulado por 3 h, con porcentajes de supervivencia por encima de 98 %. La cepa de L. acidophilus SS80 creció solo con 0,3 % de bilis (% p/v), mientras que S. thermophilus SS77 con 0,3 %, 0 % y 1 % (% p/v). Se produjo inhibición del crecimiento sobre todas las cepas patógenas evaluadas; resultó más efectiva Lactobacillus acidophilus SS80. Ambas cepas resultaron positivas a la prueba de autoagregación, coagregación e hidrofobicidad con valores superiores a 48 %. Se concluye que ambas cepas tienen potencial para ser utilizadas como aditivos probióticos en la alimentación animal.

Palabras clave: aditivo zootécnico; bacterias acidolácticas; Lactobacillus acidophilus SS80; probiótico; Streptococcus thermophilus SS77

ABSTRACT

The objective of this work was to evaluate in vitro the probiotic properties of Lactobacillus acidophilus SS80 and Streptococcus thermophilus SS77 strains for animal use. Strains were characterized by biochemical tests, hemolysis, resistance to different pH, bile salt concentrations, microbial antagonism test against five animal pathogens, and auto-aggregation, co-aggregation and hydrophobicity tests. The results showed that both strains produce hydrogen peroxide, lipase and lecithinase. S. thermophilus SS77 was positive to casein proteolysis; however, the strains did not produce biogenic amines from the amino acids Lysine, Tyrosine and Tryptophan. In addition, S. thermophilus SS77 used alanine from 36 h on, whereas L. acidophilus SS80 used histidine from 72 h on. Both strains were negative to the hemolysis test and differed significantly in the pH values reached in skimmed milk powder after 2 h. They grew at pH 6.5 and 5.5 and resisted the simulated gastric juice for 3 h, with survival rates above 98 %. The strain of L. acidophilus SS80 grew only at 0.3 % bile (% w / v), while S. thermophilus SS77 did it at 0.3 %, 0 % and 1 % (% w / v). Growth inhibition occurred on all pathogenic strains evaluated, being Lactobacillus acidophilus SS80 more effective. Both strains were positive to the auto-aggregation, co-aggregation and hydrophobicity tests with values higher than 48 %. It is concluded that both strains have potential to be used as probiotic additives in animal feeding.

Key words: zootechnical additive; lactic acid bacteria; Lactobacillus acidophilus SS80; probiotic; Streptococcus thermophilus SS77

INTRODUCCIÓN

En los últimos años, el uso de microorganismos en la profilaxis y terapia de enfermedades es objeto de gran interés y controversia científica (¹). En la actualidad se reconoce la importancia y eficacia de la terapia biótica (probióticos y prebióticos) como herramientas en el tratamiento de diversas enfermedades en los animales y el hombre (²).

La morbilidad y la mortalidad en neonatos de las diferentes especies animales representan las mayores pérdidas financieras; dentro de las causas resalta el síndrome diarreico, el cual es más pronunciado en sistemas intensivos y condiciones tropicales donde los factores estresantes son más intensos (³). Estos efectos se han atenuado con el uso de antibióticos, pero a consecuencia de la antibiorresistencia que generan con su uso sistemático se han buscado diversas alternativas, entre ellas sobresale la utilización de los probióticos (⁴).

El término probiótico está definido como “microorganismos vivos que cuando son administrados en cantidades adecuadas confieren un papel benéfico en la salud del hospedero” (⁵). Estos microorganismos deben ser capaces de sobrevivir al paso por el tracto digestivo, resistiendo la acción de los jugos gástricos y la bilis; además, deben tener capacidad de colonizar y proliferar en este medio. Desde esas perspectivas, se evalúan diferentes bacterias ácido lácticas (BAL) y se incorporan en el alimento (⁶).

Dentro de las BAL, los géneros más utilizados para la obtención de alimentos y bebidas fermentadas son Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus y, del género Streptococcus, la especie S. thermophilus es la que con más frecuencia se emplea como microorganismo benéfico (⁷).

Se han descrito diversos mecanismos de acción como característicos de los probióticos: las propiedades de adhesión, la competencia por nutrientes y sitios de colonización, la producción de metabolitos antimicrobianos, los cambios en las condiciones del ecosistema intestinal y la modulación de la respuesta inmune del hospedero (⁸,⁹).

En Cuba se han desarrollado diversos ensayos in vivo para evaluar el efecto probiótico de BAL en animales (¹⁰). Algunos de estos trabajos se han desarrollado con las cepas de Lactobacillus acidophilus y Streptococcus thermophilus desarrolladas sobre medios naturales y con las que se han obtenido resultados positivos (¹¹).

También se han reportado en el país ensayos in vitro de BAL por otros autores(¹²). No obstante, no se han publicado experimentos in vitro con las cepas de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77. El objetivo del presente estudio fue evaluar in vitro propiedades probióticas de las cepas de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77, previamente utilizadas como aditivos en animales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Microorganismos

Las cepas de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77 pertenecen al cepario del Departamento de Veterinaria de la Universidad de Sancti Spíritus ¨José Martí Pérez¨. Los ensayos se realizaron en el laboratorio de Alimento del Departamento de Salud Pública Veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional del Litoral, Argentina (UNL). Los microorganismos mencionados previamente se obtuvieron inicialmente por aislamiento desde un preparado liofilizado del Instituto de Investigaciones de la Industria Alimenticia (IIIA) de Cuba en los medios Man Rogosa Sharpe (MRS), Lactobacillus Anaerobic MRS con Vancomycina y Verde de Bromocresol, (LAMVAB), y medio Streptococcus thermophilus (ST). Los cultivos puros se mantuvieron en caldo MRS. Los aislamientos se conservaron a -80^oC en caldo MRS con 20 % de glicerol estéril para ser conservado por largos periodos.

Producción de peróxido de hidrógeno (H₂O₂)

La capacidad de las cepas para producir H₂O₂ se determinó siguiendo la metodología descrita por McLean y Rosenstein (¹³). Los cultivos bacterianos se sembraron en duplicado por estría sobre agar MRS suplementado con 2,5 mg/mL de Tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma) y 0,01 mg/mL de Peroxidasa de rábano (HRP) (Sigma). Las placas fueron incubadas a 37°C durante 48 h en condiciones de anaerobiosis. En presencia de H₂O₂, la enzima HRP oxida al TMB (incoloro) para dar lugar a la formación de un pigmento azul. La tonalidad de la coloración azul se consideró una medida semicuantitativa de la cantidad de H₂O₂ producido y liberado al medio por la cepa (¹⁴). La intensidad de la coloración azul fue incluida dentro de una de las siguientes categorías: azul claro o azul oscuro y, por la rapidez en la aparición, en Rápido (+++), Intermedio (++), Lento (+) y Negativo (-).

Descarboxilación de aminoácidos

La actividad amino-descarboxilasa de las cepas se realizó mediante un método cualitativo (¹⁵), que consistió en un medio líquido base con la siguiente composición: Peptona de caseína 0,5 %, Extracto de levadura 0,3 %, D(+)Glucosa 0,1 %, Púrpura de bromocresol 0,0016 % (Mallinckrodt Baker, Inc). A 0,9 % del medio base se le agregó 0,5 % del aminoácido a testar, en este caso L Arginina, L Histidina, L Lisina, L Tirosina y L Triptofano (Biopack, Argentina). Luego se ajustó el pH del medio a 6,7 ± 0,1 a 25°C. Los tubos duplicados se inocularon con 10 µL de cultivo y se incubaron 72 horas a 37°C. El color del medio al momento de la siembra era de color púrpura. El medio inicialmente pasa a amarillo al acidificarse y retorna a púrpura si la cepa descarboxila los aminoácidos; el pH del medio aumenta. Prueba positiva: color del medio púrpura. Cepa productora de aminas biógenas. Prueba negativa: color del medio amarillo. La cepa no produce aminas biógenas con el aminoácido probado.

Hidrólisis de la caseína de la leche (proteólisis)

Para examinar la actividad proteolítica se siguió la metodología descrita por Harrigan (¹⁶) con algunas modificaciones. Se prepararon dos medios de cultivo: medio 1) agar leche descremada, que consistió en leche en polvo descremada al 5 % y agar al 1,3 % (Britania); medio 2) agar-leche que se preparó de la siguiente manera, se disolvió leche en polvo descremada al 2 % en agua destilada y agar (Britania) a una concentración de 1,3 % en agua de peptona; se esterilizaron por separado la leche y el medio peptonado, se dejaron enfriar a 60°C y luego se mezclaron y repartieron en placas Petri. Se prepararon placas con perforaciones de 6 mm de diámetro que se rellenaron con 20 µL de los cultivos y placas sin perforaciones que se sembraron por estrías. Se utilizó Staphylococcus aureus ATCC 25923 como control. Las placas se incubaron a 37°C durante 48 a 72 h. La presencia de un halo transparente alrededor de las colonias y pocillos se consideró como reacción positiva de proteólisis de la caseína. El ensayo se realizó por triplicado y en dos momentos diferentes.

Actividad lecitinasa y lipasa

Para examinar la producción de las enzima lecitinasa y lipasa de las cepas, se siguió la metodología descrita por MacFaddin (¹⁷). Se utilizó el medio de cultivo agar Tripteina de Soya (Britania®) enriquecido con 10 % de yema de huevo. Se prepararon dos placas con perforaciones de 6 mm de diámetro que fueron inoculadas con 20 µL de cultivos y se utilizaron placas sin perforaciones que se sembraron por estrías. Se utilizó la cepa Staphylococcus aureus ATCC 25923 como control. Las placas se incubaron a 37°C durante 48 a 72 h. Un halo opaco, opalescente (blanco lechoso) rodeando las colonias en perforación se consideró como prueba lecitinasa positiva; un brillo aceitoso, iridiscente, sobre las colonias y alrededor de ellas en la placa sembrada por estrías, se interpretó como actividad lipasa positiva.

Actividad hemolítica

La actividad hemolítica de las cepas se realizó sobre Agar Columbia con 5 % de sangre de Caballo (Biomérieux, Marcy l’Etoile, Francia), según el método estándar con ligeras modificaciones (¹⁸). La incubación se realizó a 37°C por 48 h. Las cepas fueron evaluadas según la zona de hemólisis alrededor de la colonia, como positivas o negativas y de acuerdo al tipo de hemólisis: β- hemolisis cuando apareció una zona clara de hemólisis alrededor de la colonia, α- hemólisis una zona verde alrededor de la colonia y gamma (γ) cuando la zona alrededor de la colonia no era clara. Se utilizó como control positivo la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Monitoreo de pH en leche descremada en polvo (LDP)

Para el desarrollo del ensayo (¹⁹), se prepararon en tubos Falcon de 20 mL de capacidad 10 mL de leche descremada en polvo con una concentración final de sólidos de 125 g/L. Posteriormente, se esterilizaron en calor fluido durante 20 min, dejando enfriar a 45°C y bajo flujo laminar, inoculándose con cultivo fresco de las dos cepas individuales y en simbiosis a razón de 250 µL. Los tubos se incubaron a 37°C, se realizaron lecturas a tiempo 0 y cada una hora, a partir de las dos horas, hasta observar estabilidad en el pH. El ensayo se realizó por triplicado y las mediciones se realizaron un pH metro Altronix TPX III (Taiwan).

Cinética de crecimiento a diferentes pH

Se prepararon tubos Falcon de 20 mL de capacidad con 10 mL de medio caldo MRS; se ajustóel pH con ácido fosfórico a pH 6,5, pH 5,5, pH 4,5 y pH 3,5. La esterilización de los medios de cultivo con diferentes pH se realizó en autoclave a 121°C durante 15 min. El ensayo de cinética de crecimiento se realizó en microplacas de 96 pocillos (Costar 3599, Corning). Para esto, se depositaron en cada pocillo 240 µL de los medios y 30 µL de inoculo de un cultivo de 18 h de cada cepa en estudio. El crecimiento microbiano se realizó a 37^oC durante 24 h. Las lecturas se realizaron cada 30 min a 630 nm mediante el Lector multimodal de microplacas Sinergy HT BioTEK (BioTEK Instrumentos-USA). Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

Tolerancia a jugo gástrico simulado (JGS)

El ensayo de tolerancia a los jugos gástricos se realizó con ajustes a la metodología descrita por Bao (²⁰). El JGS consistió en una solución de pepsina (Riedel-de Haën, Alemania) (0,35 % p/v) y NaCl (0,2 % p/v); una mitad (50 %) ajustada a pH 3 con ácido clorhídrico y la otra restante a pH 6,5. La esterilización se realizó por filtración (0,22 µM). Las suspensiones de JGS se inocularon a 1 % con cultivos de 18 h de cada cepa y mezclados durante 10 s. El JGS con pH 3 se incubó durante 3 h a 37^oC. Se realizaron recuentos de células viables en agar MRS a tiempo 0 (N₀), (JGS pH 6,5) y se repitieron los recuentos pasadas las 3 h (N₁). En ambos casos las placas se incubaron durante 48 h a 37ºC en atmósfera de anaerobiosis. Todas las determinaciones se hicieron por triplicado. El porcentaje de supervivencia se calculó mediante la siguiente ecuación: % SP = Log UFC N₁ / Log UFC N₀ x100. Donde N₁ representa el total de células viables después del tratamiento y N₀ el número inicial de microorganismos inoculados.

Crecimiento en bilis

La tolerancia a sales biliares se llevó a cabo de acuerdo con la metodología utilizada por Uriot et al. (²¹) en microplacas de 96 pocillos. Las cepas se multiplicaron en caldo MRS en presencia de 0,3 %, 0,5 % y 1 % de bilis bovina (Britania, Argentina); se adicionaron 240 µL en cada pocillo y 30 µL del cultivo de 18 h de las cepas en estudio. Los cultivos se incubaron a 37^oC durante 24 h y las lecturas se realizaron cada 30 min a 630 nm mediante el Lector multimodal de microplacas Sinergy HT BioTEK (BioTEK Instrumentos-USA). Todas las determinaciones fueron por triplicado.

Prueba de Antagonismo microbiano

Técnica de “mota en césped” (spot on the lawn)

La capacidad para inhibir el crecimiento de determinados microorganismos patógenos se valoró mediante el método denominado “mota en césped” “agar spot” (²²). Como cepas indicadoras se emplearon cepas patógenas del cepario del Laboratorio de Alimentos del Departamento de Salud Pública, FCV, UNL (Salmonella enterica serotipo Dublin 595, Listeria monocytogenes, Escherichia coli 289, Bacillus cereus y Staphylococcus aureus). Las cepas BAL se multiplicaron en caldo MRS por 18-24 h a 37ºC. Transcurrido este tiempo, se transfirieron10 µL del cultivo a tres puntos o spots (10 µL en cada spot) en una placa de agar MRS (Merk), incubando a 37ºC durante 24 horas en condiciones de anaerobiosis. Simultáneamente, se prepararon cultivos en medio líquido de cada uno de los microorganismos indicadores, inoculando 3-4 colonias en 50 mL de caldo BHI (Merck) e incubando 12-16 h. Al completar las 24 h de incubación, las placas con los spots de BAL se recubrieron con 7 mL de agar BHI semisólido, caldo BHI (Merk) suplementado con agar bacteriológico (Conda) al 0,7 %, atemperado a 40ºC y suplementado a 1 % con el cultivo líquido de cada uno de los microorganismos indicadores. Las placas se incubaron a 37ºC durante 24 h y en condiciones de aerobiosis. La medición de los halos de inhibición se realizó con una regla graduada. Se consideró que existía inhibición cuando el halo fue superior o igual a 10 mm.

Ensayo de autoagregación y coagregación con patógenos intestinales

Los ensayos de autoagregación y coagregación con patógenos intestinales se llevaron a cabo de acuerdo con la metodología descrita por Maldonado et al. (²³). Se emplearon los microorganismos patógenos Escherichia coli y Salmonella enterica serotipo Dublin. Las pruebas se consideraron positivas cuando se hizo visible la sedimentación de las células sobre el fondo del tubo en un periodo máximo de 2 h a temperatura ambiente. Se desarrollaron controles con suspensiones en PBS de las BAL y los patógenos utilizados.

Hidrofobicidad de la superficie celular

Para la determinación de la hidrofobicidad de la superficie celular, se empleó la técnica de partición en solventes orgánicos (²³,²⁴). Los valores de por ciento de hidrofobicidad obtenidos permiten clasificar a las cepas con una hidrofobicidad alta (51-100 %), media (30- 50 %) y baja (0-29 %) (²⁴).

Análisis estadístico

Los datos se tabularon y se analizaron con el programa estadístico SPSS 11.5. Se empleó un análisis de varianza de clasificación simple, una prueba T para grupos independientes y comparación de Proporciones, considerando en todos los casos un nivel de significación de 5 %.

Para el procesamiento estadístico de las variables discretas se utilizó la Prueba de hipótesis para proporciones y para las variables continuas un Análisis de varianza de clasificación simple (ANOVA) y la prueba de Rangos múltiples de Tukey. Previamente, se valoró la distribución normal de los datos mediante el test de Kolmogorov-Smirnov para la bondad de ajuste y se aplicó la prueba de Levene para evaluar la Homocedasticidad. Se utilizaron los software estadísticos SPSS 15.0.1 para Windows.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Producción de peróxido de hidrógeno

La Tabla 1 evidencia que las dos cepas resultaron positivas a la prueba de peróxido de hidrógeno; la cepa L. acidophilus SS80 fue superior por la intensidad de la coloración y rapidez con que apareció la reacción.

Descarboxilación de aminoácidos

En las primeras 12 horas las dos cepas no utilizaron los aminoácidos incluidos en el ensayo. La cepa Streptococcus thermophilus SS77 fue capaz de utilizar la Alanina a partir de las 36 h, mientras que la cepa de L. acidophilus SS80 lo hizo con la Histidina a partir de las 72 h. Las cepas evaluadas no usaron el resto de los aminoácidos en los tiempos evaluados (Tabla 2).

Tabla 1 Producción de peróxido de hidrógeno por las cepas evaluadas./Production of hydrogen peroxide by the strains evaluated. 

Cepas	Rapidez de aparición	Tonalidad	Resultados
Lactobacillus acidophilus SS80	+++	Azul oscuro	Positiva
Streptococcus thermophilus SS77	++	Azul claro	Positiva

Leyenda: +++ = Rápido; ++ = Intermedio; + = Lento; - = Negativo

Tabla 2 Utilización de aminoácidos por las cepas evaluadas. /Use of amino acids by the strains evaluated. 

	Lactobacillus acidophilus SS80								Streptococcus thermophilus SS77
Aminoácido	Tiempo de lectura (h)								Tiempo de lectura (h)
	12	24	36	48	60	72	84	96	12	24	36	48	60	72	84	96
Alanina	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+	+	+
Histidina	-	-	-	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
Lisina	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Tirosina	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Triptofano	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Leyenda: + resultado positivo a la utilización del aminoácido. - negativo a la prueba.

Actividad enzimática

S. thermophilus SS77 mostró actividad de las tres enzimas, L. acidophilus SS80 solo fue positivo a la lipasa y lecitinasa (Tabla 3).

Tabla 3 Presencia de enzimas proteolítica y lipolíticas./Presence of proteolytic and lipolytic enzymes. 

Cepas	Proteólisis	Lipasa	Lecitinasa
L. acidophilus SS80	-	+	+
S. thermophilus SS77	+	+	+

Leyenda: + actividad enzimática positiva; - actividad enzimática negativa

Monitoreo de pH en leche descremada en polvo (LDP)

La Tabla 4 muestra que la cepa L. acidophilus SS80 produjo a las 7 h un pH más bajo (pH 3,78) que S. thermophilus SS7 (pH 5,71), valores que difieren entre sí. Cuando se crecieron las cepas en simbiosis, el pH mostró valores intermedios (pH 4,17) y difirió significativamente (p<0,05) al alcanzado por las cepas independientes.

Tabla 4 Variación del pH en leche descremada en polvo (LDP) para las cepas L. acidophilus SS80 y S. thermophilus SS77. n=3./ pH variation in skimmed milk powder (SMP) for strains L. acidophilus SS80 and S. thermophilus SS77. n = 3 

Cepas	0h	2h	3h	4h	5h	6h	7h
L. acidophilus SS80	6,74^a ±0,032	5,78^ba ±0,025	4,44^b ±0,078	4,25^b ±0,050	4,02^b ±0,053	3,78^b ±0,184	3,78^b c ±0,178
S. thermophilus SS77	6,98^a ±0.010	6,91^ab ±0,100	6,75^b ±0,05	6,72^b ±0,042	6,68^b±0,057	6,43^b ±0,07	5,71^b a ±0.032
Simbiosis de cepas	6,77^a ±0,005	5,49^b ±0.081	4,60^b ±0,015	4,40^b ±0,046	4,21^b ±0,025	4,16^b ±0,011	4,17^b c ±0,015

Leyenda: Valores expresados en Media ± DS. Superíndices diferentes, en una fila, denotan diferencias significativas entre horas en una misma cepa(p<0,05), Toh vs T7h. Subíndices diferentes, en columna 7h, denota diferencias significativas entre cepas (p<0,05).

Cinética de crecimiento a diferentes pH y tolerancia a JGS

Las dos cepas fueron capaces de crecer a pH 6,5 y 5,5, no así en pH 4,5 y 3,5 (Tabla 5); sin embargo, toleraron el JGS donde enfrentaron un pH 3; se observó que no existen diferencias significativas entre los conteos y mostraron porcentaje de supervivencia de 98,9 % y 99,7 % para L. acidophilus SS80 y S. thermophilus SS77, respectivamente (Tabla 6).

Tabla 5 Resultado de crecimiento a diferentes pH de las cepas evaluadas ./ Growth results of the strains evaluated at different pH. 

	Crecimiento
Cepas	pH 6,5	pH 5,5	pH 4,5	pH 3,5
L. acidophilus SS80	+++	+++	-	-
S. thermophilus SS77	+++	+++	-	-

Leyenda: +++ Abundante crecimiento; ++ crecimiento medio; + poco crecimiento; - sin crecimiento

Tabla 6 Tolerancia a jugo gástrico simulado (JGS). n=3./ Tolerance to simulated gastric juice (SGJ).n=3. 

Cepas	Recuentos a tiempo cero (N0) Log10 UFC/mL	Recuentos después de 3 h de incubación (N1) Log10 ufc/mL	%SP
L. acidophilus SS80	6,43^a± 0,230	6,36 ^a± 0,317	98,9
S. thermophilus SS77	7,42 ^a± 0,120	7,40^a± 0,130	99,7

Leyenda: Valores expresados en medias± DS. Superíndices diferentes, en una fila, denota diferencias significativas entre ensayos (p<0,05).

Crecimiento en bilis

Solamente la cepa de S. thermophilus SS77 fue capaz de crecer en todas las concentraciones de bilis evaluadas (Tabla 7).

Tabla 7 Resultado de crecimiento a diferentes concentraciones de bilis./Growth result at different bile concentrations. 

	Crecimiento a diferentes concentraciones de bilis (% p/v)
Cepas	0,0	0,3	0,5	1,0
L. acidophilus SS80	+++	++	-	-
S. thermophilus SS77	+++	+++	+++	+++

Leyenda: +++ Abundante crecimiento; ++ crecimiento medio; + poco crecimiento; - sin crecimiento

Actividad antimicrobiana

La Tabla 8 muestra los resultados de la actividad antagónica de las dos cepas BAL frente a los cinco patógenos estudiados “mota en césped” (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica serotipo Dublin, Escherichia coli 289, Bacillus cereus y Staphylococcus aureus. El mayor efecto inhibitorio lo exhibieron ambas cepas sobre Listeria monocytogenes. Los valores de los halos de inhibición de L. acidophilus SS80 fueron mayores que los encontrados con la cepa S. thermophilus SS77; no obstante, de acuerdo a la clasificación ambas cepas son inhibidoras.

Tabla 8 Resultados de la actividad antagonista (medias de los halos de inhibición en mm) de L. acidophilus SS80 y S. thermophilus SS77 frente a diferentes cepas patógenos indicadoras. n=3./ Results of the antagonistic activity (inhibition halo averages in mm) of L. acidophilus SS80 and S. thermophilus SS77 against different pathogen strains. n=3. 

Cepas	Listeria monocytogenes	S. enterica serotipo Dublin 595	Escherichia coli 289	Bacillus cereus	Staphylococcus aureus
L. acidophilus SS80	18,33 ±0,404	18,07^a ±0,503	19,07^a ±0,305	16,00 ±0,755	16,70^a ±0,655
S. thermophilus SS77	18,06 ±0,503	16,20^b ±0,655	16,73^b ±0,305	15,30 ±0,624	15,13^b ±0,550

Leyenda: Valores expresados en medias ± DS. Diferentes letras superiores en una fila denota diferencias significativas entre ensayos (p<0,05).

En el cruzamiento de las cepas por el método de “mota en césped”, estas mostraron halo de inhibición inferior a los encontrados en el enfrentamiento a los patógenos, no existiendo diferencias significativas entre ellas (Tabla 9).

Tabla 9 Enfrentamiento entre las cepas (medias de los halos de inhibición en mm). n=3. / Confrontation between strains (inhibition halo averages in mm). n=3. 

S. thermophilus SS77 vs L. acidophilus SS80	L. acidophilus SS80 vs S. thermophilus SS77
12,50^a ±0,500	11,70^a±0,500

Leyenda: Valores expresados en medias ± DS. Diferentes letras superiores en una fila denotan diferencias significativas entre ensayos (p<0.05).

Prueba de autoagregación, coagregación e hidrofobicidad

Las cepas de S. thermophilus SS77 y L. acidophilus SS80 a los 120 min mostraron capacidad de autoagregar y coagregar; la coagregación para ambas cepas fue más compacta en el caso de la Escherichia coli 298. Las dos cepas utilizadas en el ensayo mostraron valores medio de hidrofobicidad y no existieron diferencias significativas entre ellas (Tabla 10).

Tabla 10 Resultados a la prueba de adherencia microbiana a hidrocarburos (ensayo de hidrofobicidad), autoagregación y coagregación. n=3./Results of the microbial adhesion to hydrocarbons (MATH) test, auto-aggregation and co-agregation. n=3. 

Cepas	Autoagregación	Coagregación		% Hidrofobicidad
		Escherichia coli	S. enterica serotipo Dublin
L. acidophilus SS80	+	+++	++	48,3^a ±0,361
S. thermophilus SS77	+	+++	++	48,53^a ±0,252

Leyenda: + Autoagregación positiva, ++ fenotipo coagregante no compacto, +++ fenotipo coagregante compacto. Valores expresados en medias ± DS. Diferentes letras superiores en una fila denotan diferencias significativas entre ensayos (p<0,05).

Producción de aminas

Las cepas de L. acidhophillus SS80 y S. thermophillus SS77 mostraron baja capacidad de producción de aminas biógenas (AB): de los cinco aminoácidos ensayados solo utilizaron uno, pasadas las 36 horas. Este es otro indicador de seguridad en la evaluación de cepas candidatas a probióticos, partiendo de que altas concentraciones de aminas en los alimentos, pueden ingresar en la cadena alimentaria y ser responsables de varios problemas toxicológicos en humanos (²⁵). No obstante, la formación de AB ha estado asociada a cepas de Lactobacillus spp., tales como L. plantarum, L. curvatus, L. alimentarius, L. reuteri, y L. sakei (²⁶). En productos cárnicos fermentados fueron descritos con baja actividad de producción de AB cepas de L. casei, L. fermentum y L. reuteri (²⁷). Tarrah et al. (²⁸) realizaron un estudio in vitro de cepas de S. thermophilus y estas manifestaron diferencias en la producción de AB, por lo que los autores concluyeron que es una característica dependiente de la cepa (²⁸).

Actividad enzimática

La cepa de L. acidophilus SS80 no mostró actividad proteolítica, correspondiendo con lo planteado por Peres Cátia et al. (²⁹), quienes reportaron cepas que exhibían baja actividad de la enzima. La variación encontrada entre cepas puede estar dada por componentes de la pared celular o del medio en que se desarrollan las cepas. La actividad proteolítica de las cepas es un indicador a tener en cuenta para evaluar su actividad probiótica, específicamente referente a la liberación de péptidos bioactivos, los cuales se generan durante la fermentación del alimento o en el proceso de la digestión (³⁰). Estos péptidos bioactivos incluyen algunas secuencias de aminoácidos que ejercen una actividad biológica específica en el consumidor (³¹).

Actividad hemolítica

Dentro de los indicadores recomendados por la FAO/WHO (³²) para evaluar los probióticos, la actividad hemolítica es uno de los criterios de seguridad debido a su relación con la virulencia de las cepas. Las dos cepas evaluadas no revelaron actividad hemolítica. Estos resultados coinciden con los encontrados por Kalui et al. (³³), quienes reportaron actividad hemolítica negativa en estudios del género Lactobacillus.

Monitoreo de pH en leche descremada en polvo (LDP)

Los resultados obtenidos en el monitoreo del pH cada 2 h difieren con lo planteado por Bauman y Longo (³⁴), pues estos encontraron un crecimiento más rápido de S. termophilus. La conversión de lactosa en ácido láctico se encuentra directamente relacionada con el descenso del pH y es provocado, principalmente, por L. acidophilus SS80. Los valores de pH del medio disminuyeron a valores por debajo de 5 en 18 h, lo que se corresponde con otros estudios donde las cepas de lactobacilos redujeron el pH a valores ≤ 5,5 en 24 h (³⁵,³⁶). Es de esperar que con estas características las cepas trabajadas ejerzan alguna acción benéfica, ya que se conoce que la mayoría de los enteropatógenos tienen inhibición del crecimiento a valores cercanos a pH 5,5 (³⁷,³⁸).

Tolerancia a condiciones de stress

La tolerancia a las sales de bilis y bajo pH son propiedades esenciales requeridas por las BAL para sobrevivir en el tracto digestivo y expresar sus propiedades benéficas (³⁹). En el presente estudio, las cepas de L. acidophilus SS80 y S. thermophilus SS77 crecieron en pH 6,5 y 5,5 y resistieron un pH 3 durante tres horas; sin embargo, las concentraciones de bilis 0,5 % y 1 % inhibieron el crecimiento de L. acidophilus SS80. En otros estudios se encontraron mejores crecimientos en el medio MRS cuando ajustaron el pH superior a 5; a pH 3 la mayoría de las cepas redujeron el crecimiento significativamente, incluso la cepa testigo de L. acidophilus LA5 que disminuyó en 2 log (⁴⁰). Concentraciones de 0,3 % de bilis es el punto crítico de resistencia para las cepas a evaluar, mientras que en la predicción de la supervivencia de probióticos, después de su administración vivos por vía oral, el pH del jugo gástrico a pH 2 durante 3 h es a menudo utilizado como una condición extrema para simular las condiciones en el estómago (⁴¹); límite muy similar al que las cepas evaluadas toleraron.

El nivel de supervivencia observado en el trabajo por las cepas de L. acidophilus SS80 y S. thermophilus SS77 es superior al observado en otros estudios (²⁹,⁴²). En pruebas de selección de BAL se reportaron también cepas resistente a sales biliares (0,5 %, 1 %, 2 % y 3 %), pH (2,5, 3,5 y 7,6) y temperatura de 38 a 45°C (³⁵).

Actividad antibacteriana

La producción de sustancias inhibidoras se ha reportado para todo el género Lactobacillus y otros géneros como Lactococcus, Estreptococo, Lactobacillus, Leuconstoc y Pediococcusas, así como Enterococcus (⁴³). En este estudio todas las cepas patógenas se inhibieron por L. acidophilus SS80 y S. thermophilus SS77, lo que demuestra la interacción de factores con efecto inhibidor (⁴⁴). En trabajo de caracterización, mediante pruebas in vitro de cepas BAL procedentes de fuente animal para considerar su posterior aplicación como probiótico en animales, se encontró que la mayoría de las cepas evaluadas exhibieron actividad antagónica contra los patógenos B. cereus, S. aureus, S. typhimurium y P. aeruginosa (²⁴,⁴⁵). Resulta significativo el efecto inhibidor sobre patógenos implicados en procesos diarreicos y casos de toxiinfecciones alimentarias, como lo son Salmonela, E. coli, L. monocytogenes y Staphylococcus aureus. No obstante, no se tiene un completo análisis de la naturaleza de las sustancias antagónicas que producen las cepas evaluadas. Se describe por varios autores que en esta actividad pueden estar presentes los ácidos orgánicos, como el ácido láctico, peróxido de hidrógeno, dióxido de carbono, diacetilo, acetaldehído y sustancias de naturaleza proteica antimicrobiana, llamadas bacteriocinas (³⁵,⁴³).

Pruebas de hidrofobicidad, agregación y coagregación

Otra propiedad importante de los probióticos que debe ser evaluada es su capacidad para permanecer y colonizar el tracto gastrointestinal. La hidrofobicidad se basa en la propiedad que presentan las paredes celulares de las bacterias de conjugarse a los hidrocarburos. En general, se sugiere que este método puede emplearse gracias a la naturaleza hidrofóbica que presentan las adhesinas de la superficie celular (³⁷). Los por cientos de hidrofobicidad que mostraron las cepas de L. acidophilus SS80 y S. thermophilus SS77, 48,4 % y 48,8 % respectivamente, fue de media según la clasificación utilizada (⁴⁶). En estudios de lactobacilos de productos fermentados se encontraron cepas que mostraron valores de hidrofobicidad y autoagregación <60 % (⁴⁰) y entre 55,03 % y 30 % para cepas de origen intestinal (³⁷): mientras que Sanchez y Tropms (²⁴) reportan valores de hidrofobicidad de cepas de Lactobacillus sp. y Streptococcus sp. por encima de 82 % y para Lactococcus sp. y Pediococcus sp. inferiores al 50 %. Resultados con rangos similares también reportaron Frizzo et al. (⁴⁷).

En los pasos iniciales de la adhesión microbiana es fundamental que exista una interacción hidrofóbica entre la célula bacteriana y el sustrato de contacto. Un valor bajo de hidrofobicidad no indica que la cepa tenga menores posibilidades de adherirse al epitelio intestinal, ya que los dominios hidrofílicos podrían también estar implicados en el proceso de adhesión. Los mecanismos de adhesión pueden requerir la participación de distintos constituyentes de superficie que interactúan, de manera secuencial, para vencer las fuerzas repulsivas (⁴⁸,⁴⁹). Según estos resultados, ambas cepas presentan posibilidades de adherirse a la mucosa intestinal y, por tanto, la ventaja de desplegar acciones como barrera intestinal frente a microorganismos patógenos, activar el sistema inmune y mejorar la salud del hospedero.

Las dos cepas estudiadas fueron capaces de autoagregar, por lo que, a pesar de no haber existido coagregación frente a los dos patógenos utilizados, ese comportamiento la distingue frente a otras por su potencial actividad frente a microorganismos patógenos. La capacidad de agregación es una característica que puede utilizarse para iniciar el estudio de las interacciones microbianas. Hay una asociación entre la habilidad de los lactobacilos para adherirse al epitelio intestinal, la actividad de agregación y la hidrofobicidad de su superficie (⁵⁰,⁵¹). Los resultados de agregación estuvieron dentro de los 120 minutos (2 h); rangos similares reportan Ehrmann et al. (⁵²), al evaluar diferentes cepas de Lactobacillus y Streptococcus, existieron algunos microorganismos que no coagregaron con los patógenos utilizados, serotipos de Salmonella y Escherichia coli, pues una fuerte actividad de agregación no siempre se corresponde con un comportamiento similar en la coagregación.

CONCLUSIONES

Las cepas de Lactobacillus acidophilus SS80 y Streptococcus thermophilus SS77 mostraron, in vitro, propiedades probióticas que sustentan su utilización como aditivo zootécnico.

AGRADECIMIENTO

Los autores expresan su agradecimiento al Laboratorio de Análisis de Alimentos, Instituto de Ciencias Veterinarias del Litoral, Consejo Nacional del Investigaciones Científicas y Técnicas (ICIVET-CONICET/UNL) y al Departamento de Salud Pública, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Litoral, Argentina, por poner a nuestra disposición los recursos y las tecnologías de laboratorio para el desarrollo de los ensayos en el marco del convenio de movilidad docente e investigativa existente entre la UNISS y la UNL.

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Recibido: 13 de Diciembre de 2018; Aprobado: 15 de Febrero de 2019

^*Autor para correspondencia: Juan Emilio Hernández-García. E-mail: [e-mail]