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INTRODUCCIÓN
Las abejas, Apis mellifera, son uno de los más importantes insectos en el ecosistema terrestre, no solamente por la producción de miel, dadas sus virtudes nutritivas y terapéuticas, sino además por su papel esencial como polinizadores de diferentes especies de plantas entomófilas (1-3). De ellas depende la supervivencia y evolución de más del 80 % de las especies vegetales (4), aunque este desempeño se puede alterar debido a la transformación de sus ecosistemas, como consecuencia de los cambios climáticos que se suceden en la actualidad (5).
La microbiota del tracto digestivo de las abejas es muy variada y está asociada al tipo de alimentación que se aplica en las colmenas, el sistema de explotación, la estacionalidad y el estado de salud (6). Otros autores han reportado que las abejas melíferas poseen una alta especificidad de la comunidad microbiana intestinal; se componen por alrededor de ocho filotipos (7) donde predominan tres grupos fundamentalmente en la comunidad intestinal, Snodgrassella alvi, Gilliamella apicola y Lactobacillus spp. (8).
En Pakistán reportaron el aislamiento e identificación de microrganismos desde el intestino de abejas de diferentes zonas del país y mostraron tres filos de bacterias: Firmicutes (60 %), Proteobacteria (26 %) y Actinobacteria (14 %) (9); mientras que Kwong y Moran (10) en su estudio refieren siete filos específicos de microorganismos identificados mediante secuenciación del gen ADNr 16S, en los que se incluyen cuatro filos de Proteobacteria, dos Firmicutes y uno Actinobacterium.
Las especies de bacterias ácido lácticas (BAL) predominantes en el estómago e intestino de abejas Apis mellifera, A. dorsata y A. bumble pertenecen al género Lactobacillus (11) e incluye alrededor de 174 especies (12). La carga microbiana intestinal de las larvas es más baja que en las abejas adultas, pero la composición taxonómica es similar (13); no obstante, la variabilidad está fuertemente influenciada por las condiciones ambientales (14).
Los lactobacilos son bacterias catalasa negativos, Gram positivos y usualmente en forma de bacilos. Los mismos se encuentran en gran variedad de hábitat de origen vegetal y el tracto gastrointestinal de los animales, incluyendo las abejas melíferas (15) y se emplean en la producción de varios alimentos fermentados de origen animal y vegetal.
La identificación y la diferenciación de la microbiota de BAL en abejas se orientan en los últimos años al uso de métodos con bases moleculares y se considera la secuenciación del gen ADNr 16S como el patrón estándar para la identificación y el análisis filogenético de BAL (16). Diferentes regiones de este gen se emplean para identificar especies de Lactobacillus (17-19). El empleo de la caracterización proteómica mediante MALDI TOF MS (Matrix - Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight MassSpectrometry), para identificar microorganismos patógenos y benéficos, se ha incrementado en los últimos años, aprovechando su rapidez y precisión para obtener resultados (20).
La utilización de especies de Lactobacillus como probióticos se continúa sugiriendo en la apicultura por la estimulación del sistema inmune innato de las abejas, debido a la producción de sustancias inhibidoras e intervención en acciones fisiológicas, ayudándolas a sobrevivir contra el efecto de patógenos (21,22) y así favorecer el estado de salud general de las mismas (23,24). De ahí la importancia de aislar cepas de estas especies y realizar su identificación acorde a estándares internacionales, para caracterizar su desempeño como probióticos en investigaciones futuras.
Los objetivos de este trabajo fueron aislar e identificar cepas de bacterias ácido lácticas (BAL) del tracto digestivo de abejas adultas A. mellifera.
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales
Las muestras de abejas Apis mellifera se colectaron entre los meses enero y marzo de 2017; se conformaron tres lotes de 25 abejas adultas cada uno, que representaban diferentes colmenas y unidades de producción apícola de la provincia Sancti Spíritus, Cuba. Para su transportación y conservación, se introdujeron en frascos estériles hasta su llegada al laboratorio (Laboratorios Novatec de Cuba).
Aislamiento de BAL del intestino de abejas
Las muestras se procesaron en el Laboratorio de Referencia para Investigaciones y Salud Apícola (LARISA). Se siguió el protocolo descrito por Engel (16); las abejas de cada uno de los lotes fueron previamente desinfectadas (Solución clorada al 1 %) y lavadas tres veces con solución salina peptonada estéril (SSPE) para eliminar contaminantes externos. A continuación, bajo condiciones de esterilidad se conformaron tres grupos que contenían fragmentos del abdomen de las abejas (20 a 25 abejas cada uno). Finalmente, se transfirieron a 25 mL de SSPE en bolsas estériles y se maceraron durante tres minutos en un equipo Biomaster Seward Stomacher 80.
La siembra de las muestras maceradas se realizó en los medios de Man Rogosa Sharpe (MRS), Lactobacillus Anaerobic MRS con Vancomicina y Verde de Bromocresol, (LAMVAB) y Streptococcus thermophillus (ST). Para ello se realizaron diluciones seriadas 1:10, tomando 1 mL para 9 mL en solución Ringer estéril y se sembraron en placas, utilizando 0,1 mL por cada dilución (10-1,10-2 y 10-3). Los medios inoculados se incubaron a 37°C durante 72 h bajo condiciones anaeróbicas (H2:CO2=90:10) en jarras de anaerobiosis con vacuomanómetro OXOID HP0011 (Oxoid, UK). Se realizaron dos réplicas.
A partir de los cultivos en los medios MRS, LAMVAB y ST, se procedió por observación macroscópica a la selección de las colonias que cumplían con las características presuntivas a los géneros en estudio: colonias elevadas, de superficie gruesa y brillante, bordes elevados, coloración blanquecina y cremosa (25).
La Tinción de Gram y la prueba de catalasa (26) se realizaron como tamizaje inicial de las colonias con características culturales presuntivas del género Lactobacillus spp. La presencia de forma bacilar, cocobacilos, Gram positivo y catalasa negativo se consideraron como parámetros para la selección. Los aislamientos se conservaron en el banco de cepas del laboratorio a -80oC en caldo MRS (Britania) suplementado con glicerol estéril al 20 % (Merck, Darmstadt, Germany) para los futuros análisis.
Extracción del ADN bacteriano, amplificación del ADNr 16S y secuenciación del fragmento amplificado
Las cepas se identificaron en el Laboratorio de Análisis de Alimentos, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Litoral, mediante la secuenciación del ADNr 16S. Primeramente se procedió a la extracción del ADN genómico de las cepas mediante el uso de un kit de purificación de ADN comercial DNAzol® (Molecular Research Center, Inc). El gen ADNr 16S se amplificó mediante PCR con un termociclador (MJ Research®) usando los cebadores 27F (5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´) y 1492R (5´-GGYTACCTTGTTACGACTT-3´) (Lane, 1991). Cada tubo de PCR contenía una mezcla de reacción de 10 μL de buffer 5X (Promega®), 1,5 mM de MgCl2, 200 μM de cada desoxinucleótidotrifosfato (Promega®), 0,4 μM de cada primer y 2U de Taq polymerasa (Promega®) en un volumen final de 50 uL. Se utilizó el siguiente programa de amplificación: 94ºC durante 5 min; 30 ciclos de 94ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min; y una extensión final de 72ºC durante 7 min. Los productos de PCR de aproximadamente 1500 pb se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % p/v, con tinción de GelRed® bajo luz UV. Los productos de PCR obtenidos de 13 cepas fueron purificados con el juego de reactivos Wizard PCR SV Gel & PCR Clean- Up System (Promega®) y luego secuenciados (Macrogen, Korea del Sur). Las secuencias obtenidas se compararon con otras depositadas en la base de datos GenBank (National Centre for Biotechnology Information, Rockville Pike, Bethesda, MD), usando el algoritmo de BLAST (disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Caracterización proteómica utilizando MALDI TOF MS
La identificación de los aislamientos mediante MALDI TOF MS (Matrix - Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) se realizó directamente a partir de una colonia aislada adhiriendo la misma a la placa metálica de MALDI. Las placas con las tarjetas MALDI se introdujeron en el espectrómetro de masa MALDI TOF para las mediciones automatizadas y la interpretación de datos. Los perfiles del espectro de masa MALDI TOF fueron importados con el software MALDI Biotyper 3.0 y procesados automáticamente después de las mediciones. La comparación con la base de datos arrojó un resultado de identificación mostrando género y especie bacteriana y su porcentaje de precisión.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A partir de los cultivos de muestras de abdomen de abejas en los medios MRS, LAMVAB y ST, se procedió por observación macroscópica a la selección de las colonias que cumplían con las características que permitían considerarlas como pertenecientes a los géneros en estudio.
Se obtuvieron 35 aislamientos a partir del tracto digestivo de las abejas A. mellifera en los medios MRS, LAMVAB y ST por observación macroscópica de las colonias y de ellas 13 cepas se consideraron como posibles BAL por la morfología, coloración Gram positiva en la tinción y prueba catalasa negativa. El análisis de las secuencias obtenidas reveló 98 y 99 % de identidad con los siguientes géneros y especies (Tabla 1).
En la caracterización proteómica utilizando MALDI TOF MS, solo dos cepas (Lactobacillus rhamnosus y Lactococcus garvieae) pudieron ser identificadas mediante esta técnica (Tabla 1), debido a que el resto de las cepas correspondieron a especies que aún no estaban incorporadas en la base de datos empleada.
Tabla 1 Bacterias ácido lácticas (BAL) aisladas a partir del tracto digestivo de abejas e identificadas mediante secuenciación del ADNr 16S y MALDI TOF MS./ Lactic acid bacteria (LAB) isolated from the digestive tract of bees and identified by 16S rDNA and MALDI TOF MS sequencing.
| Aislamiento | Gram | Catalasa | Identificación bacteriana | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Secuenciación ADNr 16S | MALDI TOF MS | ||||||
| Especie bacteriana | Querycover (%) | Ident (%) | Especie bacteriana | Ident (%) | |||
| SS66 | + | - | Fructobacillu sfructosus | 99 | 99 | No encontrada | - |
| SS67 | + | - | Weissella paramesenteroides | 100 | 98 | No encontrada | - |
| SS68 | + | - | Fructobacillus fructosus | 100 | 99 | No encontrada | - |
| SS69 | + | - | Weissella paramesenteroides | 100 | 98 | No encontrada | - |
| SS70 | + | - | Lactobacillus kunkeei | 100 | 99 | No encontrada | - |
| SS71 | + | - | Lactobacillus kunkeei | 100 | 99 | No encontrada | - |
| SS72 | + | - | Fructobacillus fructosus | 99 | 99 | No encontrada | - |
| SS73 | + | - | Lactobacillus rhamnosus | 100 | 99 | Lactobacillus rhamnosus | 99,90 |
| SS74 | + | - | Lactobacillus kunkeei | 100 | 99 | No encontrada | - |
| SS75 | + | - | Lactobacillus kunkeei | 100 | 99 | No encontrada | - |
| SS76 | + | - | Fructobacillus fructosus | 100 | 98 | No encontrada | - |
| SS78 | + | - | Weissella paramesenteroides | 99 | 99 | No encontrada | - |
| SS79 | + | - | Lactococcus garvieae | 100 | 99 | Lactococcus garvieae | 95,90 |
Cuando los aislamientos se agruparon (Tabla 2), se apreció la existencia de cuatro géneros de BAL, predominando Lactobacillus spp. (38,4 %) y Fructobacillus spp. (30,8 %) y, en el análisis por especies (Fig. 1), destacan L. kunkeei (31 %) y F. fructosus (31 %).
Tabla 2 Porcentaje de aislamiento de los diferentes géneros encontrados en el tracto digestivo de abejas melíferas./ Percentage of isolation of the different genera found in the digestive tract of honey bees.
| No. | Géneros | % |
|---|---|---|
| 1 | Lactobacillus ssp. | 38,4 |
| 2 | Fructobacillus ssp. | 30,8 |
| 3 | Weissella ssp. | 23,1 |
| 4 | Lactococcus ssp. | 7,7 |
Figura 1 Cepas predominantes (%) de bacterias ácido lácticas obtenidas a partir del tracto digestivo de las abejas Apis mellifera en Cuba./ Predominant strains (%) in the isolation of lactic acid bacteria obtained from the digestive tract of Apis mellifera bees in Cuba.
Las bacterias ácido lácticas son abundantes en el estómago de las abejas melíferas, predominan las del género Lactobacillus y Bifidobacterium (27). El género Lactobacillus es el grupo más importante dentro de los BAL y usualmente se encuentra como parte de la microbiota del tracto digestivo de humanos y animales, siendo utilizado como probióticos en estas especies (16).
Los Lactobacillus spp. aislados de la miel y del tracto digestivo de las abejas melíferas pueden ser seleccionados y usados para la preservación de alimentos, para su enriquecimiento y como suplemento probiótico en el consumo humano o para su uso en las propias abejas para mejorar su estado de salud (28).
De igual forma, se ha asociado la fortaleza de la colonia con la taxonomía del tracto intestinal de las abejas; se ha podido comprobar a los Lactobacillus spp. dentro de los géneros predominantes en colmenas fortalecidas, sugiriéndose que el perfil de la microbiota podría usarse como una herramienta de diagnóstico en las prácticas de apicultura y predecir la salud de las colmenas y guiar el manejo de las mismas (19).
Un estudio comparativo de BAL aisladas desde el intestino de abejas melíferas y desde flores (mediante estudios filogenéticos y de plásmidos) mostró el predominio de bacterias ácido lácticas y Bifidobacterias y, dentro de ellas, las especies Lactobacillus kunkeei y Fructobacillus fructosus (29).
Históricamente, muchos ensayos para aislar e identificar BAL empleaban métodos basados en el cultivo de las cepas (30). Ensayos más recientes han aplicado la amplificación de cultivos independientes mediante la secuenciación del gen ADNr 16S para estudiar esa comunidad basado en el polimorformismo de cada cepa (16,31). En el presente estudio, el método de cultivo clásico fue combinado con la secuenciación de ADNr 16S para describir la diversidad bacteriana y su relación filogenética con Lactobacillus spp. presentes en el tracto digestivo de las abejas adultas A. mellifera.
El estudio se dirigió al aislamiento de BAL dominantes en el tracto digestivo de las abejas más explotadas en Cuba (A. mellifera), las cuales se someten a un nuevo y complejo ecosistema (4). Los resultados del análisis filogenético mostraron que en las muestras estudiadas existen cinco géneros diferentes de Lactobacillus. Las cepas dominantes de lactobacilos totalizaron el 31 % y fueron más cercanas a las especies previamente descritas (L. kunkeei y F. fructosus). Estas especies son generalmente reconocidas como seguras (GRAS) y varias cepas de L. kunkeei y F. fructosus se han aislado desde diferentes nichos ecológicos, vinculados con el entorno apícola (32). En un estudio sobre lactobacilos fructófilos (LABF) en abejas melíferas, Endo y Salminen (33) reportaron como grupos predominantes los pertenecientes a L. kunkeei y F. fructosus. Otros autores hacen idéntica consideración cuando aíslan cepas desde el tracto intestinal de abejas y señalan que las cepas de Lactobacillus kunkeei son las especies predominantes durante las estaciones de hambruna (34).
Un estudio sobre diversidad de bacterias ácido lácticas, asociadas con abejas melíferas y su posible uso como probióticas para manejar condiciones estresantes (25), reportó que de los 42 aislamientos siete fueron los géneros predominantes Enterococcus spp. (23,8 %), Micrococcus spp. (18,8 %), Streptococcus spp. (13,8 %), Pediococcus spp. (13,8 %), Lactobacillus spp. (10,0 %), Lactococcus spp. (10,0 %) y Leuconostoc spp. (10,0 %).
En el mismo sentido, Ribière et al. (19), con el uso de técnicas de aislamiento selectivas y la secuenciación de ADNr 16S de Lactobacillus spp. de muestras de flores e intestino de abejas, identificaron, en ambos casos, dentro de las especies más frecuentes Lactobacillus kunkeei y Fructobacillus fructosus. Además, en un estudio filogenético y de plásmidos, los resultados mostraron el predominio de las bacterias ácido lácticas de las especies Lactobacillus kunkeei y Fructobacillus fructosus (29).
Las otras especies de BAL encontradas en el tracto digestivo de las abejas fueron W. paramesenteroides y L. rhamnosus, reportadas en estudios y ambientes vinculados a las abejas (19,35,36).
En la provincia Tucuman, Argentina, se aislaron diferentes bacterias ácido lácticas desde frutas y flores y caracterizadas genotípicamente; las 21 especies encontradas pertenecían a seis géneros: Enterococcus, Fructobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc y Weissella. Dentro de las especies se encontraron L. rhamnosus y F. fructosus (37); ambas cepas también se hallaron en el presente estudio de la microbiota intestinal de las abejas. Estos hallazgos hablan de la relación que existe entre la microbiota de las flores y la de las abejas y que ha sido reportada en un estudio reciente (38), aunque las abejas suelen tener una comunidad microbiana diversa en número y metabólicamente (39) y estar asociadas a las condiciones medioambientales en que se desarrollan (14).
Se ha encontrado también en estudios de aislamiento y caracterización por secuenciación de ADNr 16S de BAL, en hojas de plantas y frutas, especies de W. paramesenteroides junto con L. plantarum, E. faecalis y Lactobacillus paraplantarum (19,40); por lo que no es inusual que esta especie pueda aparecer en la microbiota intestinal de las abejas, también se refiere en estos casos de comunidades intestinales erráticas que consisten en bacterias ambientales que varían ampliamente entre los individuos (41).
La otra especie identificada, Lactococcus garvieae, es menos reportada en ambientes asociados a las abejas; no obstante, se halló en la valoración de la microbiota del pequeño escarabajo (Aethina tumida) que presenta relación con las abejas melíferas como huésped (42). Este mismo autor asoció L. kunkeei y L. garvieae en las abejas, aunque ubicó a L. garviae como un microorganismo patógeno. En estudio de identificación de la microbiota intestinal de abejas A. mellifera, se reportan las familias Lactococcaceae, Micrococcaceae y Staphylococcaceae en el recuento de bacterias Gram positivas; dentro de las especies, estos autores identificaron Lactococcus garvieae por MALDI TOF MS (43); resultado que se corresponde con el presente estudio.
Generalmente, las cepas de Lactococcus garvieae son aisladas desde productos fermentados y en rebrotes de plantas; ambientes con los cuales las abejas pueden tener contacto; especies de L. garvieae también se vinculan a procesos patológicos en peces y se han evaluado como benéficos en otros casos (44,45). L. garvieae LG34 aislado desde pepino fermentado chino produjo una bacteriocina de Clase II con un amplio espectro inhibidor y mostró que tenía el potencial para su utilización como biopreservador de alimentos (46); no obstante, se necesitan estudios adicionales para dilucidar su presencia en la microbiota de las abejas y las flores.
Nueve de las especies de BAL encontradas se han reportado como posibles agentes benéficos en abejas, aunque las mismas suelen tener una comunidad microbiana diversa en número y metabólicamente (39) y esta hay que verla contextualizada, tanto ecológica como ambientalmente. La investigación sobre el empleo de probióticos es de gran utilidad para incidir positivamente en la salud de esta especie, evitar el uso de antibióticos en su crianza y eliminar efecto residual en la miel y otros productos apícolas que constituyen una de las ramas exportables más importantes del país (47).
CONCLUSIONES
Este estudio confirma el predominio del género Lactobacillus dentro de las bacterias ácido láctico (BAL) del tracto digestivo de las abejas. Las especies de BAL dominantes fueron Lactobacillus kunkeei y Fructobacillus fructosus. Las principales especies de BAL encontradas se han utilizado como agentes probióticos, por lo que deben continuarse los ensayos a nivel de laboratorio para evaluar su comportamiento. Esta investigación es la primera en informar aislamiento e identificación molecular de BAL del tracto digestivo de abejas melíferas en Cuba.
