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INTRODUCCIÓN
La población mundial crece a un ritmo acelerado y demanda disponibilidad de suficientes alimentos nutritivos e inocuos, y la mastitis bovina es una enfermedad que aún causa grandes pérdidas económicas, además de otros riesgos a la salud de los rebaños y el público en general, pese a los avances tecnológicos y la profundización en el conocimiento de factores decisivos en su comportamiento, dependientes tanto de hospederos, como de los patógenos involucrados y del ambiente donde su interación tiene lugar (1-5).
También la mastitis constituye un problema de salud pública, porque la leche puede ser vehículo de microorganismos zoonóticos, y otros resistentes a los antimicrobianos, que pueden diseminarse a través de la cadena alimentaria (6,7).
Mycoplasma bovis (M. bovis) es uno de los patógenos más frecuentes en las infecciones de la glándula mamaria; responsable de episodios esporádicos de alta contagiosidad y serias pérdidas económicas en las explotaciones (8) y se considera uno de los principales patógenos emergentes del ganado bovino en países industrializados, en tanto, su diseminación se atribuye al comercio de animales (9-11).). También otras especies de micoplasmas han sido reportadas en procesos de mastitis bovina, como M. californicum, M. bovigenitalium, M. alkalescens, M. bovirhinis y M. dispar (12-14).
En Zamora-Chinchipe, Ecuador, fue reportado por primera vez Mollicutes en leche de tanque de rebaños bovinos (15), por lo que se precisa profundizar acerca de su asociación con los procesos de mastitis bovina que afectan con significativo impacto económico a los productores de esa provincia.
MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio
El estudio se realizó en la provincia Zamora Chinchipe, Ecuador, con una superficie de 10 556 Km2 y políticamente dividida en nueve cantones: Zamora, Chinchipe, Nangaritza, Yacuambi, Yantzaza, El Pangui, Palanda, Paquisha y Centinela del Cóndor. La temperatura promedio oscila entre los 18 y 22ºC; la humedad relativa alcanza hasta un 92% (Gobierno Provincial de Zamora Chinchipe, 2010).
Selección de rebaños para el estudio
El número de rebaños seleccionados para el estudio se determinó mediante el programa EpiData (16). Se asumió una prevalencia de 50%, debido a la falta de conocimiento a priori sobre la prevalencia en la región, con un intervalo de confianza de 95% y una precisión de 10%. La prevalencia se calculó a través de una aproximación Bayesiana basado en la distribución Beta, beta (s + 1; n-s + 1), donde: s = positivos; n = número de fincas testadas.
Se realizó una zonificación en bloques de 25 km2 de la provincia, de acuerdo con sus condiciones ecológicas (conglomerados). En cada uno se seleccionó aleatoriamente la cantidad de fincas a muestrear del total en existencia (15,17).
Como criterios de inclusión en el estudio se consideró que las fincas tuvieran el consentimiento de sus propietarios para participar en el estudio y que abastecieran de leche cruda el centro de acopio. Las que no cumplían con estos criterios no se incluyeron.
Determinación de Mollicutes en muestras de leche
De las vacas en ordeño, en los rebaños seleccionados, se colectó en tubos estériles un pool de 10mL de leche proveniente de todos sus cuartos, previa su limpieza exhaustiva y la desinfección con etanol al 70 % de las puntas de los pezones, en tanto los primeros chorros de leche se descartaron (18). Los muestreos se realizaron en el período comprendido entre 2015 y 2016.
Diagnóstico de Mycoplasma spp.
Todas las muestras de leche colectadas se refrigeraron (2-8 oC) para su traslado al Laboratorio de Sanidad Animal y Zoonosis, de la Universidad Técnica Particular de Loja, donde se conservaron a 4ºC para posteriores análisis.
El diagnóstico de Mycoplasma spp. se realizó mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), en MYCOLAB (Laboratorio Acreditado por la ISO/IEC: 17025, y de Referencia de la Organización Mundial de Salud Animal (OMSA) para el diagnóstico de Mycoplasmas), del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Cuba.
Extracción de ADN a partir de muestras de leche
La muestra de leche se centrifugó (3000 rpm por 10 minutos) y el sobrenadante se decantó. Posteriormente se tomaron 50 µL del sedimento y se le adicionó 200 µL de buffer de ruptura (Tris HCl, 0,1M, pH 8,5, Tween 20, 0,05% y proteinasa K 0,24mg/mL). La mezcla se incubó durante 1 hora a 60 ºC y luego de ese periodo se incubó a 95ºC durante 15 minutos con el objetivo de lograr la desnaturalización del ADN (19).
Diagnóstico de Mollicutes
Para la determinación de Mollicutes por PCR, se utilizó una pareja de cebadores (MGSO y GPO-1), que amplifican un fragmento de 270 pb correspondiente a la región conservada del ARN ribosomal 16S (ARNr 16S) (20) (Tabla 1). Los cebadores se sintetizaron en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB), La Habana, Cuba. Como control positivo se utilizó ADN de Mycoplasma arginini.
Tabla 1 Secuencia nucleotídica de los cebadores utilizados en la amplificación de un fragmento del ARNr 16S de la clase Mollicutes. / Nucleotide sequence of the primers used in the amplification of a 16S rRNA fragment of the class Mollicutes.
| Cebador | Secuencia | Producto | Referencia |
|---|---|---|---|
| GPO-3 | 5’-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3’ | 270 pb | Van Kuppeveld y col., 1998 |
| MGSO | 5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’ |
Preparación de la mezcla, condiciones de corrida y visualización de los PCR
La preparación de la mezcla para la amplificación se realizó en un volumen final de 25 μL. Esta mezcla se compuso de 5 µL del ADN de la muestra, 1,5µL de cada cebador (20 pmoles) y 17 µL de Master mix (Promega). Las reacciones se desarrollaron en un equipo Termociclador de ADN REACTOR ThermoHyBaidTM, con el empleo del programa de amplificación específico para cada cebador, según lo descrito por los autores antes mencionados.
Los productos de PCR se aplicaron en gel de agarosa al 2 % (v/v). Se utilizó un marcador de peso molecular de 100 pb (Promega, Madison, EE.UU.). El gel se tiñó con Bromuro de Etidio (0,5 μg/mL) durante 15 minutos y los resultados se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta.
Diagnóstico de Mycoplasma bovis
El diagnóstico de M. bovis se realizó a las muestras que resultaron previamente positivas a Mollicutes. Se utilizaron los cebadores MboF y MboR que amplifican un segmento 360 pb del gen que codifica para el ARNr 16S (21) (Tabla 2). Como control positivo se utilizó ADN de M. bovis (cepa Donetta Pg45 de M. bovis ATCC 25524). La preparación de la mezcla, condiciones de corrida y visualización del PCR se realizó como se describe anteriormente para la clase Mollicutes.
Tabla 2 Secuencia nucleotídica de los cebadores utilizados en la amplificación de un fragmento del ARNr 16S de Mycoplasma bovis. / Nucleotide sequence of the primers used in the amplification of a 16S rRNA fragment of Mycoplasma bovis.
| Micoplasma | Cebador | Secuencia | Producto | Diana | Referencia |
|---|---|---|---|---|---|
| MboF | 5´- GGC TCT CAT TAA GAA TGT C - 3´ | 360 pb | uvrC gen | Hotzel y col., 1996 | |
| MboR | 5´- TTT TAG CTC TTT TTG AAC AAA T - 3´ |
Prueba de California para mastitis
Luego del despunte del pezón se depositó un pool de 2 ml de leche de todos los cuartos en los pocillos de la paleta indicada para esta prueba, a los que se agregó igual volumen del reactivo para la Prueba de California para Mastitis (CMT, de sus siglas en inglés, Lauril sulfato de sodio al 4% Diagnóstico Mastitis Nocar, Medick). Se homogenizó la muestra con movimientos circulares por un tiempo aproximado de 10 a 20 segundos, e inmediatamente se interpretaron los resultados de acuerdo al grado de gelificación observado en la mezcla (22).
Se consideró como resultado negativo (-) cuando no hubo formación de gel. Mastitis subclínica grado 1 (+) o débilmente positiva, cuando en el fondo de la paleta se formó el gel que desapareció rápidamente. Mastitis subclínica grado 2 (++) o positiva, cuando hubo presencia de grumos consolidados. Mastitis subclínica grado 3 (+++) o muy positiva, cuando se formó un gel robusto que no desapareció al dejar de girar la paleta.
Análisis estadístico
Mediante comparación de proporciones (23) se analizaron los resultados del diagnóstico de Mollicutes y a CMT en vacas por cantones y las frecuencias de los diferentes patógenos identificados en las vacas positivas a Mollicutes. A través de Chi Cuadrado se evaluó la relación entre los resultados del diagnóstico de Mollicutes y CMT, así como con los patógenos identificados en el estudio bacteriológico.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se investigaron 386 muestras de leche de vacas individuales, de 99 rebaños distribuidos en los 10 cantones de la provincia Zamora-Chinchipe; 126 resultaron positivas a Mollicutes (32,6 %) (Tabla 3). La Figura 1 muestra el resultado del PCR para la detección de mollicutes en muestras de leche.
Figura 1 Electroforesis de los productos de PCR en gel de agarosa al 2 %. Línea 1: Patrón de peso molecular 100 pb (Promega), líneas 2-11: muestras en estudio, línea 12: control negativo PBS; línea 13: control positivo, ADN de Mycoplasma arginini. / Electrophoresis of PCR products at 2 % agarose gel. Lane 1: 100 bp molecular weight marker (Promega), lanes 2-11: test samples, lane 12: PBS negative control; lane 13: positive control, Mycoplasma arginini DNA.
A CMT resultaron positivas con una, dos o tres cruces, 75 (19.4%), 232 (60.1%) y 33 (8.5%) vacas respectivamente; solo 46 (11.9%) fueron negativas (Tabla 3).
Prácticamente no existen diferencias entre cantones respecto a los resultados de la Prueba de California, y en cuanto al diagnóstico de mollicutes, solo Palanda con todas sus muestras positivas (4/4), difiere del resto de los cantones.
Tabla 3 Resultados de la Prueba de California y el diagnóstico de Mollicutes en vacas de rebaños lecheros en cantones de la provincia Zamora-Chinchipe. / California test results and Mollicutes diagnosis in cows from dairy herds in cantons of the Zamora-Chinchipe province.
| Cantones | Total | Prueba California | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Neg. | + | ++ | +++ | Total Post. | Posit. | Neg. | ||
| 70 | 0 | 38 (54,3) | 32 (45,7) | 0 | 70 (18,1)a | 20 (28,6)b | 50 (71,4) | |
| 8 | 2 (25,0) | 0 | 6 (75,0) | 0 | 6 (1,6)abc | 0 | 8 (100,0) | |
| 77 | 8 (10,4) | 23 (29,9) | 43 (55,8) | 3 (3,9) | 69 (17,9)b | 30 (39,0)b | 47 (61,0) | |
| 6 | 0 | 5 (83,3) | 1 (16,7) | 0 | 6 (1,6)a | 0 | 6 (100,0) | |
| 37 | 8 (21,6) | 2 (5,4) | 23 (62,2) | 4 (10,8) | 29 (7,5)c | 15 (40,5)b | 22 (59,5) | |
| 6 | 2 (33,3) | 0 | 4 (66,7) | 0 | 4 (1,0)abc | 3 (50,0)b | 3 (50,0) | |
| 21 | 1 (4,8) | 3 (14,3) | 16 (66,2) | 1 (4,8) | 20 (5,2)ab | 6 (28,6)b | 15 (71,4) | |
| 4 | 0 | 2 (50,0) | 2 (50,0) | 0 | 4 (1,0)a | 4 (100,0)a | 0 | |
| 2 | 0 | 2 (100,0) | 0 | 0 | 2 (0,5)a | 0 | 2 (100,0) | |
| 155 | 25 (16,1) | 0 | 105 (67,7) | 25 (16,1) | 130 (33,7)c | 48 (31,0)b | 107 (69,0) | |
| 386 | 46 11,9) | 75 (19,4) | 232 (60,1) | 33 (8,5) | 340 (88,1) | 126 (32,6) | 260 (67,4) | |
En sentido general es elevada la frecuencia de vacas cuyas muestras de leche resultaron positivas a ambos métodos de diagnósticos, 32,6 % positivas a mollicutes y 88,1% a CMT, en alguna de las categorías. Estos resultados son más desfavorables respecto a otros reportados en Ecuador, tanto para la provincia El Oro, con una prevalencia de 11,6 % de mastitis clínica moderada y 60% de mastitis subclínica (24), así como para la provincia del Cañar - Biblián, donde la prevalencia de mastitis subclínica en vacas y hatos ganaderos, fue de 9,1 y 56,5 %, respectivamente (25).
Pese al elevado porcentaje de vacas positivas a mollicutes y CMT, no se encontró asociación entre los resultados de ambos diagnósticos en vacas mediante Chi Cuadrado (p<0,05), posiblemente porque muchos animales positivos a CMT están infectados por otros patógenos. Aunque no se pueden descartar resultados falsos negativos a mollicutes, pues el porcentaje de infección a nivel de los rebaños y la intermitencia en la excreción de esos microorganismos puede incidir en un resultado negativo en el momento de la toma de muestra (26,27).
Se destaca que todas las vacas positivas a mollicutes resultaron negativas a M. bovis, al igual que las muestras de leche de tanque de los rebaños que se investigaron previamente en la provincia (15).
Se ha señalado que la participación de Mollicutes puede ser como agente secundario que exacerba las infecciones preexistentes, o incluso como agente primario, que después facilita la infección con otros patógenos frecuentes en los cuadros de mastitis bovina (14).
Aunque M. bovis se considera uno de los agentes más importantes asociados a mastitis y además es la especie del género que se aísla con mayor frecuencia, otras especies le siguen en relevancia, como son M. alkalescens. M. californicum, M. bovigenitalium, M. arginini, M. bovirhinis y M. dispar (12,13,28). Mycoplasma primatum también se aisló de una muestra de leche de un cuarto con mastitis clínica (28).
También otras especies como M. leachii, M. dispar y M. canadense no deben subestimarse como causa importante de enfermedad (29). A su vez, la co-infección de M. bovis con M. bovigenitalium, M. alkalescens, M. canadense y M. arginini en los mismos rebaños se señala como una observación interesante, que requiere de más investigación para determinar si tienen o no influencia directa en la salud de la glándula mamaria (28).
En Sao Paulo se encontró un 16.4% (11/67) de rebaños positivos a mollicutes; solo uno fue positivo a M. bovis y no se descartó la participación de otras especies de micoplasmas que pueden causar mastitis, como Mycoplasma alkalenses, M. arginini, M. bovigenitalium, M. bovirhinis, M. californicum, M. canadense, M. dispar, así como mollicutes como Acholeaplasma spp. (principalmente A. laidlawii e A. axanthum) (30).
Mollicutes se reportó por primera vez en Río de Janeiro en el 2021; en el 21% de rebaños (4/19) y 4% de las vacas (16/387), de estas el 1% (5/387) fueron positivas a M. bovis y el 3% (11/387) a M. arginini. En Minas Gerais, Rio de Janeiro y São Paulo solo se identificó M. arginini (31).
También en Brasil, estado de Paraná, la positividad para M. bovis fue del 3,78% en muestras de leche de vacas con mastitis, así como en el 20% de hisopos nasales de terneros saludables, pero hijos de vacas con mastitis, por lo que se destaca a ese microorganismo como parte de la microbiota pulmonar de los terneros. Además, se especula sobre la participación de otras especies de micoplasmas, pues se constató 17.84% de casos de mastitis positivos a Mollicutes, en tanto solo el 3.78% lo fue a M. bovis (13).
También en Brasil, en un estudio de 1166 muestras de leche de vacas con mastitis clínica, el 8.6% (100/1166) resultó positiva a mollicutes, en tanto por PCR se constató M. bovis en el 1.1% (13/1166) y el 0.9% (11/1166) por PCR en tiempo real, y se señaló la necesidad de profundizar en el conocimiento de otras especies de micoplasmas involucradas (32).
En el Altiplano Boyacense de Colombia no se detectó M. bovis en muestras de leche de tanque (33).
En el sur de Chile se aisló M. bovis y M. bovigenitalium en leche de tanque, y de una vaca individual M. alkalescens, y se destaca el riesgo potencial para los rebaños lecheros de estas dos últimas especies (34).
La frecuencia de muestras de leche positivas a mollicutes en todos los cantones, en leche de tanque o de vacas individuales, revela la importancia que pueden tener en los procesos de mastitis observados en la provincia. Incluso en rebaños que resultaron negativos en leche de tanque, como en Chinchipe y Palanda (15), la confirmación en ellos de vacas positivas puede tener relación con el periodo de excreción del patógeno, lo que puede contribuir a subestimar su presencia en los rebaños (26, 27).
Si bien la frecuencia de vacas positivas a mollicutes resultó elevada (32,6%), el porcentaje con mastitis subclínica fue mayor (88,1%), con 68,6% de vacas afectadas con dos o tres cruces a CMT, un indicativo de la complejidad que puede tener el mosaico etiológico de la enfermedad en los rebaños investigados.
Así, se recomienda investigar la colonización intramamaria de Mollicutes en los rebaños porque puede ser un factor que complique los procesos de mastitis, debido a la posible interacción sinérgica con otros micoplasmas y otros microorganismos, además de ocasionar otras enfermedades en los bovinos (31).
Los micoplasmas se relacionan con una amplia gama de trastornos, como enfermedades respiratorias, artritis, abscesos subcutáneos, queratoconjuntivitis, meningitis, infertilidad y otitis, y el creciente número de países que lo reportan desde hace algunos años es una alerta de su carácter emergente para la ganadería bovina, particularmente en países industrializados donde el tamaño de los rebaños está en aumento (9-11).
Los terneros con procesos respiratorios por micoplasmas pueden ser el origen de una nueva cadena de infección en un rebaño, así como los que se alimentan con leche de madres infectadas, pues pueden mostrar la infección después que se incorporan a la reproducción (35,36). Por ello, la existencia en los rebaños de grupos de animales de diferente edad en contacto se considera un factor de riesgo para las mastitis por micoplasmas (1).
En la transmisión de esos microorganismos tienen importancia los aerosoles, las secreciones de los animales con trastornos respiratorios y la vía genital (37,38). En el ambiente contaminado con el patógeno, este puede sobrevivir fuera del animal durante largos periodos de tiempo en estiércol, agua, arena y distintos materiales de cama, y las condiciones frías y húmedas aumentan su incidencia al favorecer la viabilidad del agente (12).
La presencia de micoplasmas en muestras de leche de tanque y de vacas individuales en los rebaños estudiados reviste especial importancia y tiene un impacto práctico en el control de esta enfermedad, pues para minimizar el riesgo de diseminación de la infección se deben identificar y controlar todos los factores de riesgo (11), porque los micoplasmas tampoco son sensibles a los antimicrobianos comunes.
Por carecer de pared celular, los micoplasmas no son sensibles a los antimicrobianos ß-lactámicos, y también son intrínsecamente resistentes a las sulfonamidas, porque tampoco sintetizan ácido fólico; solo son generalmente susceptibles a las drogas que interfieren con la síntesis de proteínas (tetraciclinas, macrólidos, linosamidos y florfenicol) o la síntesis de ADN (fluoroquinolonas) (39).
Como los micoplasmas son prácticamente intratables, se recomienda intentar la eliminación de los casos mediante el sacrificio, atendiendo a lo poco exitoso del tratamiento y el riesgo de los portadores asintomáticos del patógeno desde edades tempranas (40). Por ello la diseminación de M. bovis que se constata en la ganadería bovina de casi todos los países ha incentivado la obtención de vacunas que aún no están disponibles (41).
Por todo lo expuesto es indispensable profundizar en la etiología de la mastitis asociada a Mollicutes, y la identificación de las especies involucradas en Zamora-Chinchipe, por la repercusión económica que tiene la enfermedad en los productores del territorio y la necesidad de orientar adecuadamente las estrategias de control.
CONCLUSIONES
Se constató alta frecuencia de muestras de leche de vacas individuales positivas a Mollicutes (32,6%), también con elevada presencia de mastitis subclínica (88,1%) en los rebaños estudiados de la provincia, lo que sugiere la participación de otros patógenos. Aunque no se confirmó presencia de M. bovis, se conocen otras especies del género que también son patogénicas y difíciles de controlar. Por ello es importante continuar las investigaciones para identificar las especies de micoplasmas involucrados, así como otros patógenos asociados a la enfermedad en la provincia.
