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INTRODUCCIÓN
El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es la especie más transcendental del género Phaseolus, cultivada en gran parte del mundo (Beebe, 2012). Dicha leguminosa es una importante fuente de proteínas, vitaminas y minerales para más 500 millones de personas en Latinoamérica, África y el Caribe (Cortés et al., 2013), especialmente en Cuba, donde es la fuente principal de proteínas.
Mediante la formación de nódulos en las raíces de dicha planta como toda leguminosa, se lleva a cabo la Fijación Simbiótica del Nitrógeno (FSN), en asociación con rizobacterias denominadas colectivamente rizobios. Este proceso entre el frijol común y bacterias fijadoras de nitrógeno es crucial en la producción de otros cultivos agrícolas por su aporte de nitrógeno en el agroecosistema. Los mayores beneficios de la interacción simbiótica, leguminosa - rizobios son la reducción en la aplicación de fertilizantes nitrogenados y las mejoras en el crecimiento y salud de las plantas.
La Fijación Biológica del Nitrógeno (FBN) ha sido extensamente utilizada en lugar de los fertilizantes nitrogenados en la producción de leguminosas por su eficiencia económica en los agroecosistemas sostenibles (Ouma et al., 2016). El uso de cepas nativas de Rhizobium como biofertilizantes contribuye al mantenimiento de la biodiversidad del suelo, mediante la disminución de los efectos negativos de los fertilizantes minerales (Nkot et al., 2015).
Sin embargo, en la provincia de Villa Clara, aún es insuficiente el uso de variantes de biofertilización, que contribuyan al incremento de los parámetros del rendimiento del cultivo del frijol en diferentes condiciones edafoclimáticas. Teniendo en cuenta esta problemática, la presente investigación fue encaminada a determinar el efecto de diferentes variantes de biofertilización sobre la nodulación, variables morfofisiológicas y el rendimiento del frijol común en condiciones de campo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Localización y caracterización de la zona de estudio
El estudio se llevó a cabo en condiciones de campo y el experimento fue conducido en un área perteneciente a un campesino privado de la Cooperativa de Créditos y Servicios (CCS) “Lino del Río”, municipio Placetas (22°18′42″ N 79°39′15″ O), provincia Villa Clara. En el período comprendido entre noviembre del 2015 y enero del 2016, correspondiente a la época de siembra intermedia (noviembre - enero).
Caracterización de las propiedades del suelo
El suelo del área de estudio se clasifica como Pardo mullido carbonatado (Hernández et al., 2015). En el estudio fueron determinados los principales indicadores químicos de la fertilidad de suelo. Las muestras de suelo fueron tomadas antes de la siembra a 20 cm de profundidad, a partir de una diagonal imaginaria trazada en el campo, de la cual se tomaron 12 submuestras que se reagruparon en cuatro muestras. Todas las muestras fueron secadas al aire y tamizadas a 0,5 mm para los análisis químicos que incluyeron el pH (pH (H2O), pH (KCl)); método potenciométrico con una relación suelo-solución 1:2,5, materia orgánica (MO), método Walkey y Black, P - Olsen y K2O; Oniani (Tabla 1).
Montaje del experimento y condiciones de crecimiento
La variedad de frijol empleada en el estudio fue Delicia-364 (testa roja), teniendo en cuenta que es la más generalizada en la región por su adaptabilidad a las condiciones edafoclimáticas y resistencia a plagas. Los tratamientos evaluados, fueron distribuidos en un diseño experimental en bloques al azar con cuatro réplicas, para un total de 16 parcelas de 5 m2 (2,5 x 2 m). Conformadas por siete surcos de 5 m de largo y una distancia entre estos de 0,70 m, separados cada uno por un pasillo de 1 m. Se realizó la preparación de suelo tradicional, con tracción animal. Las labores agrotécnicas fueron conducidas durante el ciclo biológico del cultivo e incluyeron, dos pases de guataquea con una diferencia aproximada de 38 días uno de otro, comenzando a los 15 días después de la germinación. Se tomaron a los 21, 42 y 87 días después de la siembra (DDS), 5 plantas por parcelas (en los 5 surcos centrales).
Tratamientos:
Preparación del inóculo e inoculación
Las especies de Rhizobium pisi (40982 y 40983) fueron aisladas de nódulos de frijol común Phaseolus vulgaris L. en Cuba y seleccionadas teniendo en cuenta los resultados positivos obtenidos en investigaciones precedentes (Colás Sánchez, 2014). Para la elaboración del inóculo estas fueron crecidas a 30 ºC en medio YEM (extracto de levadura manitol) sólido/líquido, el pH fue ajustado a 7 adicionando HCl (1 M).
Para preparar el inóculo, 10 mL crecidos durante 24 h a 30 ºC fueron transferidos a Erlenmeyer que contenían 250 mL del medio líquido e incubados a igual temperatura durante 24 h en incubadora zaranda (Gerhardt, THO-500, Alemania). La titulación arrojó un mínimo de 109 unidades formadoras de colonias por ml (UFC ml-1) para ambas cepas de Rhizobium pisi. Posteriormente 100 mL del cultivo fueron mezclados con 115 g de humus, resultando en el inóculo final.
Las semillas fueron recubiertas con almidón 8 % mezcladas con el humus inoculado y secadas al aire. Las bolsas con las semillas inoculadas fueron almacenadas a temperatura ambiente durante 24 h, hasta el momento de la siembra que fue realizada de forma manual.
EcoMic®: las semillas fueron peletizadas en el momento de la siembra con este inoculante sólido que contiene propágulos de hongos micorrízicos arbusculares (HMA), producido en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). Se utilizó el 10 % del peso total de la semilla mezclado con agua, hasta que la mezcla alcanzó una consistencia pastosa.
Evaluaciones
Las evaluaciones fueron realizadas a los 21, 42 y 87 días después de la siembra (DDS), un total de cinco plantas por parcela fueron removidas por cada tratamiento.
A los 21 (DDS), fue determinado el peso seco de la raíz (PSR, g) y el follaje (PSF, g) los cuales fueron medidos después de mantener las plantas 72 h a 65°C en la estufa, posteriormente fueron pesadas en una balanza (Kern PRS 3203). Durante la fase reproductiva 42 DDS, fueron determinados el número de nódulos (NN), peso seco de los nódulos (PSN, g), peso seco de la raíz (PSR, g), peso seco del follaje (PSF, g).
En el momento de la cosecha aproximadamente a los 87 DDS las evaluaciones incluyeron: Número de plantas por parcela (NPP), Peso de 100 semillas (P100, g), número de frutos por planta (NFP), número de semillas por planta (NSP), peso seco de los frutos (PSF, g), peso seco de las semillas por planta (PSSP, g), peso seco de las plantas (PSP, g) y el peso seco de las semillas por parcela (PSSP, kg). El rendimiento agrícola fue estimado siguiendo la metodología propuesta por Remans et al. (2008).
Procesamiento estadístico
Se utilizó el paquete estadístico STATGRAPHICS Centurion XV.2.14 sobre el sistema operativo Windows 7. Las diferencias estadísticas entre los tratamientos, se determinaron mediante el análisis de varianza simple con nivel de significación p<0,05, empleando la prueba de comparación de medias paramétrica TukeyHSD, verificando la normalidad y la homogeneidad de varianza. Se establecieron las correlaciones de Pearson entre todas las variables y se realizó análisis de regresión simple.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre la biomasa seca de la raíz y del follaje a los 21 días después de la siembra (DDS)
El efecto de los tratamientos sobre la biomasa seca de la raíz y el follaje a los 21 días después de la siembra (DDS) fue significativamente superior respecto al control (Tabla 2).
En el caso específico del peso seco de la raíz (PSR) en todos los tratamientos se observaron diferencias significativas desde el punto de vista estadístico y numérico respecto al control. Lográndose los mayores incrementos en los tratamientos donde fueron inoculadas las semillas con EcoMic® y R. pisi 40982 respectivamente y en ambos casos superiores al 50 % con respecto al tratamiento control.
Tabla 2 Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre la biomasa radicular y del follaje a los 21 DDS
| Tratamiento | PSR | PSF |
|---|---|---|
| g | ||
| R. pisi 40983 | 0,069 b | 0,39 a |
| R. pisi 40982 | 0,077 a | 0,40 a |
| EcoMic® | 0,087a | 0,31 b |
| Control | 0,042 c | 0,24 c |
| EE (±) | 0,04 | 0,02 |
Los valores representan el promedio de 20 plantas
Medias con letras no comunes para una misma columna, difieren por Tukey a (P<0,05)
PSR: Peso seco de la raíz; PSF; Peso seco del follaje
La respuesta en la estimulación de la raíz ocasionada por el EcoMic® pudiera estar asociada al efecto que ejercen los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) sobre la raíz de la planta (Abdel-Fattah et al., 2016). Los mayores resultados obtenidos en la biomasa del follaje estuvieron asociados a la inoculación de la cepa R. pisi 40982 y sin diferencias significativas con la cepa 40983, alcanzando estos, valores superiores con diferencias respecto al resto de las variantes de inoculación.
Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre la nodulación, la biomasa radicular y del follaje a los 42 DDS
La respuesta del genotipo al número de nódulos mediante la inoculación de los diferentes variantes a los 42 días DDS (Figura 1), demuestra el efecto positivo de los tratamientos con respecto al control. La presencia de nódulos en el tratamiento control indica la existencia de cepas nativas de Rhizobium spp. en la zona de estudio, aunque en menor cantidad y masa seca, lo que indica que se requiere la selección de cepas eficientes para conseguir la maximización de la FBN en el cultivo de frijol. La mayoría de los nódulos radiculares mostraron coloración rosada, lo que indica la presencia de la proteína que contiene hierro, necesaria para la fijación efectiva de nitrógeno. La presencia de la coloración rosada en los nódulos es un indicio de la presencia y expresión activa de los genes nifH que codifican la síntesis de enzimas nitrogenasas responsables de la reducción de N a NH3 (Rondon et al., 2007).
a, b: medias con letras no comunes difieren por Tukey-LSD a (P<0,05)
Figura 1 Efecto de la inoculación sobre el número de nódulos (NN) y el peso seco de los nódulos (PSN) a los 42 DDS
En todos los casos en que fueron inoculadas las semillas con los diferentes tratamientos se observaron los mayores incrementos en el número de nódulos, mostrando siempre los mejores resultados estadísticos, resultados que coinciden con los obtenidos en el peso seco de los nódulos (Tabla 3), parámetro que ha sido declarado como indicador de la efectividad en la interacción y que además correlaciona con el nivel de nitrógeno fijado por la planta (Tahir et al., 2009). Los incrementos en la biomasa nodular reflejan mayor eficiencia de la FBN que resulta en un aumento de la biomasa del follaje.
La relación positiva existente entre la estimulación de los parámetros de nodulación, la biomasa radicular y del follaje han sido vinculados con los mecanismos directos que realizan las sustancias excretadas por las bacterias sobre el sistema radicular y de modo indirecto sobre el follaje de las plantas, además del incremento de las tasas de N fijado al follaje como resultado de la eficiencia de la interacción.
En esta etapa del ciclo del cultivo fue evaluado también el PSR sin diferencias significativas entre los tratamientos y el PSF (Tabla 3) en el que los mayores incrementos se lograron con la inoculación de la cepa Rhizobium 40982.
Tabla 3 Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre la biomasa nodular, radicular y del follaje a los 42 DDS
| Tratamientos | PSN | PSR | PSF |
|---|---|---|---|
| g | |||
| R. pisi 40983 | 0,112 a | 0,60 a | 3,21 b |
| R. pisi 40982 | 0,108 a | 0,63 a | 4,39 a |
| EcoMic® | 0,067 b | 0,66 a | 3,24 b |
| Control | 0,033 c | 0,66 a | 3,79 b |
| EE (±) | 0,0011 | 0,027 | 0,232 |
Los valores representan el promedio de 20 plantas
Medias con letras no comunes para una misma columna, difieren por Tukey a (P<0,05)
PSN: peso de los nódulos, PSR: Peso seco de la raíz, PSF: Peso seco del follaje
El efecto positivo de este tratamiento sobre el follaje pudiera estar atribuido a los aportes de la inoculación de la cepa en el contenido de N transferido a través de los nódulos y al resto de la planta (Groppa et al., 1998).
Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre algunos componentes del rendimiento
Al evaluar el efecto de los tratamientos sobre algunos componentes del rendimiento (Tabla 4) en el genotipo estudiado a los 87 días de sembrado el experimento, fueron observados incrementos significativos en todos los tratamientos respecto al control, aunque en algunos casos sin diferencias estadísticas significativas.
Todos los componentes evaluados fueron notablemente estimulados con la inoculación de la cepa 40983. Los incrementos con respecto al control fueron de 51 % en el número de frutos por planta (NFP), 68 % en el número de semillas por planta (NSP), 53 % en el peso seco de semillas por plantas (PSSP) y 78 % en el peso seco de los frutos por planta (PSF). Es importante destacar el efecto positivo obtenido con la aplicación de EcoMic® en todos los indicadores evaluados, con resultados muy similares a los obtenidos cuando se inocula la cepa 40983 en la mayoría de los tratamientos.
Tabla 4 Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre algunos componentes del rendimiento agrícola en el frijol
Los valores representan el promedio de 20 plantas
Medias con letras no comunes para una misma columna, difieren por Tukey a (P<0,05)
NFP: Número de frutos por planta, NSP: número de semillas por planta, PSSP: Pesco seco de semillas por planta, PSF: Peso seco de los frutos por planta
El efecto beneficioso de los HMA ha sido asociado al efecto que estos ejercen en la rizosfera sobre las cepas de Rhizobium en este caso las nativas, específicamente en cuanto a la disponibilidad de P y otros nutrientes necesarios por las bacterias (Smith, 2002). Resultados similares fueron obtenidos por Abdel - Fattah et al. (2016) quienes reportaron incrementos significativos en componentes del rendimiento agrícola como el número de legumbre, largo de la legumbre, peso de 100 semillas y peso de semillas por plantas con la inoculación de HMA.
El efecto de los tratamientos sobre el peso de semillas por parcela (PPS/PP) y peso de 100 semillas (PSS/100), evidencia que las diferencias entre los tratamientos no fueron tan marcadas comparadas con otros indicadores. Para el caso específico del PPS/PP (peso seco de las semillas por parcelas) no se observaron diferencias estadísticas entre los tratamientos, solo entre estos y el control y por otra en el PPS/100 (peso de cien semillas) no existieron diferencias. No obstante, los mejores incrementos en ambos indicadores coinciden con aquellas plantas que fueron inoculadas con la cepa R. pisi 40983. El efecto positivo de esta cepa pudiera estar asociado a su eficiencia en la interacción con el genotipo objeto de estudio.
En concordancia con este estudio resultados superiores en el peso de 100 semillas fueron obtenidos por Martins et al. (2017) en plantas inoculadas con aislados de Rhizobium, demostrando además que con la inoculación se obtuvieron valores similares en este indicador a los de las plantas en que se aplicó fertilizante nitrogenado, a razón de 80 kg ha-1, como ocurre en el estudio al compararlo con el EcoMic®.
Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre el rendimiento agrícola
Coincidentemente el efecto de los tratamientos sobre el rendimiento agrícola fue superior al control en todas las variantes de inoculación y sin diferencias estadísticas entre ellas (Figura 2). Los mejores resultados fueron alcanzados en las plantas inoculadas con las cepas de R. pisi 40983 y 40982 respectivamente.
Los resultados coinciden con los obtenidos por Garduño et al. (2009) estudio, en el que fueron detectadas diferencias estadísticas significativas, entre las variables del crecimiento y el rendimiento agrícola del frijol. En un estudio realizado por Morad et al. (2013), fue demostrado el efecto positivo de la inoculación en el rendimiento de granos y el número de legumbres de frijol comparado con las plantas no inoculadas, lo cual está en concordancia con los resultados del presente estudio.
El incremento positivo en el rendimiento agrícola con la inoculación de las especies de Rhizobium sugiere que pueden ser usadas como estimulantes del rendimiento agrícola, bajo condiciones similares a las del estudio y sobre todo en una agricultura sostenible. En sentido general los resultados obtenidos con la inoculación de cepas nativas de Rhizobium demuestran su eficiencia cuando son usadas en regiones agroclimáticas similares (Meghvansi et al., 2010). Además de su interacción positiva con las bacterias existentes en el suelo de forma natural, lo cual, según Tena et al. (2016) resulta en el mejoramiento de la calidad del suelo, la disponibilidad de nutrientes y el rendimiento de los cultivos.
Correlación entre los parámetros evaluados durante el ciclo del cultivo
El análisis de los coeficientes de correlación de Pearson entre el rendimiento agrícola y los parámetros evaluados durante el ciclo del cultivo mostró la relación existente entre los parámetros evaluados, tanto en la fase temprana de crecimiento como en el momento de la cosecha (Tabla 5).
Tabla 5 Coeficientes de correlación de Pearson entre los diferentes parámetros evaluados durante el ciclo del cultivo
Nivel de significación: * 0,05 > P > 0,01, ** 0,01 > P > 0,001, *** P < 0,001
Leyenda: PSS/PP: peso seco de semillas por parcela, PSS/100: peso seco de cien semillas, Rdto: Rendimiento agrícola, NN: número de nódulos, PSN: peso seco de los nódulos, PSR: peso seco de la raíz, PSF: peso seco del follaje, PSP: peso seco de la planta
Como puede observarse el número de nódulos correlacionó significativamente con la mayoría de los indicadores y generalmente mostró los mejores coeficientes, todos superiores a 0,5, mostrándose la alta relación lineal de este y su influencia sobre la producción de biomasa y el rendimiento agrícola, lo cual de forma indirecta pone de manifiesto su efecto sobre la fijación de nitrógeno.
Es de destacar que la correlación entre el rendimiento y el PSN (R2 = 0,046, p = 0,0038) fue significativa, coincidiendo con la correlación positiva entre el NN con el PSF y PSP. La correlación significativa existente el NN y el PSF confirma la dependencia de la biomasa de la planta en la nodulación y por consiguiente en la fijación del nitrógeno (Kawaka et al., 2014).
En este sentido, fue observado una estrecha relación entre la nodulación y la acumulación de nitrógeno en la planta (Deli´c et al., 2010) y coincidentemente con lo reportado por Unkovich et al. (2010) una fuerte relación entre la biomasa seca y el nitrógeno acumulado en la planta.
CONCLUSIONES
Todas las variantes de biofertilización incrementaron la nodulación de 47,5 a 48,4 %, los componentes del rendimiento de 21,8 - 44,1 % y el rendimiento agrícola de 34,4 - 43,2 %, especialmente con la inoculación de las cepas de R. pisi se observaron los mayores valores, demostrando su potencialidad como posible biofertilizante en la variedad Delicia 364
