EcoMic y LicoMic (Glomus hoi like), biofertilizantes que no provocan daño genotóxico ni citotóxico en las células germinales del ratón Cenp:NMRI

 

Ailemys Curbelo^I, Yesenia Rivero^II, Ms.C. A. Mancebo^III, Ms.C. María E. Arteaga^IV, Ms.C. Consuelo González^V, Ms.C. Ana M. Bada^VI y Dra.C. Bárbara O. González^VII, Lianne Arias^VIII, Oraima Marrero^IX

I Investigadora, email: [e-mail]

II Especialista del departamento de Genética Toxicológica

III Investigador Auxiliar del departamento de Toxicología General

IV Investigadora Auxiliar del departamento de Experimentación Animal

V Investigadora Auxiliar del departamento de Química Analítica

VI Investigadora Auxiliar del departamento de Calidad

VII Investigadora Auxiliar del departamento de Anatomía Patológica, Centro de Toxicología Experimental (CETEX), Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), finca Tirabeque, carretera El Cacahual km 2½, Bejucal, AP 3, La Habana

VIII Especialista del departamento de Biofertilizantes y Nutrición de las Plantas

IX Especialista de la Subdirección de Investigaciones del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, La Habana, Cuba, CP 32700.

 

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ABSTRACT

The use of biofertilizers is a more accurate method than the one of chemical synthesis, since it contributes to soil and environmental preservation. This kind of work has been developed at the National Institute of Agricultural Sciences (INCA) by means of obtaining EcoMic® and LicoMic® biofertilizers, Glomus hoi like stump, which implies several predictive toxicity assays should be performed, with the purpose of cancelling or minimizing the application of compounds, whose risk/benefit rate would be undesirable for society. Among the in vivo tests described for genotoxic evaluation, there is an assay for the sperm cell head abnormalities in mice. In order to evaluate the genotoxic potential of both biofertilizers, Cenp:NMRI mice were treated with three dose levels (20, 40 and 80 spores.mL-1) of each product, besides a negative (Ringer solution in EcoMic® and osmoprotector solution in LicoMic®) and a positive control (Acrylamide 20 mg.kg-1 in both cases). Results from both experiments show that the doses evaluated do not significantly increase anomalous sperm percentage compared to the negative control. Likewise, there was not a statistically significant sperm quantity decrease compared to the negative control. It was concluded the two biofertilizers evaluated do not cause genotoxic or citotoxic effects on the mice´s germinal cells treated.

 

Key words: biofertilizers, Glomus, toxicity, spermatogenesis, mice

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RESUMEN

El uso de biofertilizantes es un método más seguro en relación con el empleo de fertilizantes de síntesis química, pues contribuye a la preservación del suelo y el medio ambiente. Esta línea de trabajo ha sido desarrollada por el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), mediante la obtención de los biofertilizantes EcoMic® y LicoMic®, cepa Glomus hoi like, lo que implica la realización de ensayos de toxicidad predictivos, con el fin de anular o minimizar la aplicación de compuestos, cuya proporción riesgo/beneficio los haga indeseables para la sociedad. Dentro de las pruebas in vivo descritas para la evaluación genotóxica, se encuentra el ensayo de anormalidades de la cabeza del espermatozoide en ratón. Para la evaluación del potencial genotóxico de estos dos biofertilizantes, se realizó dicho ensayo empleándose ratones de la sublínea Cenp:NMRI, tratados con tres niveles de dosis (20, 40 y 80 esporas.mL-1) de cada producto, además de un control negativo (solución Ringer en EcoMic® y solución osmoprotectora en LicoMic®) y uno positivo (Acrilamida 20 mg.kg-1 en ambos casos). Los resultados de ambos experimentos muestran que las dosis evaluadas no provocan un incremento significativo del porcentaje de espermatozoides anómalos con respecto al control negativo. Así mismo, no se muestra significación estadística en la disminución de la cantidad de espermatozoides con respecto al control negativo. Se concluye que los biofertilizantes evaluados no provocan efectos genotóxicos ni citotóxicos sobre las células germinales de los ratones tratados.

 

Palabras clave: biofertilizantes, Glomus, toxicidad, espermatogénesis, ratón

 

 

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INTRODUCCIÓN

 

Existe una creciente preocupación por los riesgos que para el ambiente y la salud del hombre representan los fertilizantes de síntesis química, tanto por sus residuos en los alimentos como por el efecto contaminante en los suelos y las cuencas acuíferas. Esto ha despertado un fuerte interés en la investigación y el desarrollo de productos biológicos alternativos que puedan ser utilizados con este fin.
El uso de biofertilizantes es un método más seguro, pues contribuye a la preservación del suelo para futuras generaciones por el incremento de su fertilidad así como del medio ambiente y compiten con los patógenos por el sitio de infección (1). Esta línea de trabajo ha sido desarrollada por el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), institución que ha obtenido resultados satisfactorios en la producción de biofertilizantes a partir de hongos micorrizógenos, entre ellos EcoMic® y LicoMic®, ambos cepa Glomus hoi like.
Los biofertilizantes sólidos que se producen bajo la denominación EcoMic® están formulados a partir de esporas, micelios y raicillas infestadas de especies nativas de hongos micorrizógenos, que se mantienen en un soporte sólido (patente OCPI # 22641). Por su parte, LicoMic® es la denominación que reciben los biofertilizantes líquidos formulados a partir de esporas de especies nativas de hongos micorrizógenos con alto grado de pureza, eficiencia y estabilidad biológica, que se mantienen en una solución osmoprotectora (solicitud de patente OCPI # 0277/ 2004). Estos hongos han sido evaluados agronómicamente con éxito en diferentes condiciones edafoclimáticas (2).
La asociación que establecen estos hongos con las raíces de las plantas superiores es conocida comúnmente como micorriza, vocablo proveniente del término griego mykos (hongo) y la voz latina rhiza (raíz), utilizado por primera vez en 1881 por el botánico alemán Albert Bernard Frank para denominar la asociación. Este término agrupa tres tipos: ectomicorrizas, endomicorrizas y ectendomicorrizas, siendo los hongos que se utilizan para la elaboración de los productos Ecomic y LicoMic del tipo endomicorrízico arbuscular (2).
Las esporas de Glomus hoi like son pequeñas (60-110 µm), semitransparentes y, por lo general, se encuentran agrupadas formando ramilletes de tamaño pequeño a mediano; en ocasiones las esporas adultas aparecen dispersas (2).
La genética toxicológica es el estudio de los efectos adversos en el proceso de la herencia. Estos estudios han dado lugar a varios procedimientos tanto in vitro como in vivo, diseñados para evaluar los efectos de los químicos en los mecanismos genéticos y el riesgo consecuente a los organismos, incluidos los humanos (3). Dentro de las pruebas in vivo descritas para la evaluación genotóxica, se encuentra el ensayo de anormalidades de la cabeza del espermatozoide de ratón (4), que propone un sistema para detectar daño citogenético en células germinales, consistente en cuantificar poblaciones de espermatozoides anómalos. Este ensayo en ratones constituye una prueba simple, rápida, cuantitativa y sensible, para la identificación de compuestos capaces de inducir riesgo genético en humanos.
El objetivo de este trabajo es determinar el posible efecto mutagénico del EcoMic® y LicoMic® (Glomus hoi like), al evaluar tres niveles de dosis de cada producto, empleando en ambos casos el ensayo de anormalidades de la cabeza del espermatozoide en ratón Cenp:NMRI.

Materiales y Métodos

Estos experimentos se realizaron de acuerdo con los Principios de las Buenas Prácticas de Laboratorio no Clínico de Seguridad Sanitaria y Medioambiental, Regulación 39/2004 (5) y la Guía para el Cuidado, el Uso y la Reproducción de los Animales para Experimentación del CENPALAB (6).
Animales. Para la realización de ambos estudios se empleó la especie Mus musculus, que es una de las más utilizadas en el ensayo de espermatozoides. En cada experimento se tomaron 25 ratones Cenp:NMRI machos (50 en total), entre ocho y 12 semanas de edad, con un rango de peso corporal de 30 a 40 g, procedentes de la División de Animales Gnotobióticos del CENPALAB. Se mantuvieron en readaptación por un período de ocho días y fueron alojados en cajas T2 de policarbonato, con fondo y tapa de rejilla y bandejas para la colección de desechos (Tecniplast), a razón de cinco ratones por caja, formándose cinco grupos experimentales en cada estudio (Tabla I).

Los valores de temperatura y humedad relativa alcanzaron una media de 25.95±1.34ºC y 72.98±4.34%, respectivamente. El fotoperíodo fue de 12 horas luz/oscuridad. La dieta comercial granulada esterilizable EMO:1002 (CENPALAB, AlyCo®) para roedores se suministró a libertad durante ambos estudios, excepto los grupos tratados por vía oral, que se mantuvieron en ayuno durante tres a cuatro horas previas a la administración, reanudando el suministro tres horas después de administradas las sustancias. El agua se esterilizó y fue suministrada a libertad en frascos de 500 mL.
Se realizaron diariamente las observaciones clínicas a los animales, evaluándose el estado general, aspecto y comportamiento. Se determinó el peso corporal de cada animal antes de comenzar la administración de las sustancias y antes del sacrificio.
Compuestos. El EcoMic® y LicoMic®, ambos cepa Glomus hoi like, se obtuvieron como biofertilizantes en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). Estos se evaluaron a diferentes concentraciones: 20, 40 y 80 esporas.mL-1 usando como vehículo la solución Ringer, en el caso del EcoMic®, y solución osmoprotectora para el LicoMic. La Acrilamida (Pharmacia Biotech) se administró intraperitonealmente a una dosis de 20 mg.kg-1 de p.c. como control positivo.
Como controles negativos se emplearon las soluciones Ringer y osmoprotectora. Los dos biofertilizantes y controles negativos se aplicaron por vía oral mediante intubación intragástrica (gavage para ratón). En todos los casos se administró un volumen de 1 mL por animal.
Ensayo de anormalidades de la cabeza del espermatozoide. Este experimento se designó para el estudio del efecto de las diferentes dosis de EcoMic y LicoMic en células germinales. Todos los compuestos se administraron por cinco días consecutivos a intervalos de 24 horas y el sacrificio de un solo tiempo a los 35 días de la primera aplicación (3). Los animales se sacrificaron por dislocación cervical y se extrajo la cola del epidídimo, la cual se fragmentó en 1 mL de solución salina fisiológica (SSF) al 0.9 %; se utilizó 0.5 mL de cada muestra sin previa tinción, para analizar la concentración de espermatozoides y los restantes 0.5 mL fueron teñidos con Eosina al 1 %, para analizar la presencia de espermatozoides anómalos. En cada animal se analizaron 1000 espermatozoides, teniendo en cuenta las categorías propuestas por Wyrobek y Bruce (3): normales (N), amorfos (A), sin gancho (SG) y banana (B). Para cuantificar la concentración espermática se empleó la cámara de Newbauer. Todas las observaciones se efectuaron en un microscopio Opton con objetivo 100X.
Análisis estadístico. Se utilizó el paquete estadístico SPSS (7) versión 10.0.5, tomando un nivel de significación p<0.05. Se determinaron la media (X) y desviación estándar (DE) de cada variable [N, A, B, SG, total de anormales (TA) y concentración espermática (CE)] para cada grupo de tratamiento. Se utilizaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Levene para comprobar la normalidad y homogeneidad de los datos, respectivamente.
Estudio 1: Las variables se analizaron mediante un ANOVA de una vía, seguido de un ensayo LSD para establecer entre cuáles grupos eran las diferencias.
Estudio 2: Las variables N, SG y TA no cumplieron la premisa de homogeneidad de varianza, por lo que se les realizó un análisis no paramétrico con la prueba Kruskal-Wallis. Para la variable SG se hizo la prueba Mann-Whitney, verificando así entre cuáles grupos eran las diferencias. El resto de las variables (B, A y CE) se analizaron mediante un ANOVA de una vía seguido de un ensayo LSD.
Los criterios de genotoxicidad y citotoxicidad tomados en ambos estudios fueron los recomendados por Wyrobek y Bruce (3).
Significación estadística del incremento del porcentaje de espermatozoides anómalos del grupo tratado respecto al control negativo.
Significación estadística de la disminución del conteo de espermatozoides por mL x 106 del grupo tratado respecto al control negativo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 

Estudio 1. La supervivencia en este estudio fue del 96 %, pues durante el desarrollo del ensayo ocurrió la muerte del animal 2.3, perteneciente al grupo control negativo, no pudiéndose determinar las causas de muerte debido al estado de autolisis y putrefacción avanzado en que se encontraba.
Los resultados estadísticos evidencian que en ninguna de las categorías morfológicas evaluadas existen diferencias significativas, al analizar las medias del grupo control negativo y las de los tres grupos tratados con EcoMic® (Glomus hoi like). Las categorías N, B, SG y TA muestran diferencias estadísticamente significativas entre las medias de los grupos control negativo y positivo (Acrilamida), lo que evidencia la validez del ensayo. Al analizar la CE, no se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre las medias de esta variable en los grupos tratados con EcoMic® en relación con la media del grupo control negativo (Tabla II).

Estudio 2. La supervivencia en este estudio fue también del 96 %, ocurrió la muerte de un animal del grupo dosis media. Este comenzó a presentar un ligero abultamiento en la región de la nuca desde el día 15 del estudio, el cual fue aumentando de tamaño y consistencia extendiéndose por detrás de la oreja, lado izquierdo de la cara, desplazando el maxilar inferior hacia el lado derecho. Se dificultó la locomoción del animal, el consumo de agua y alimento, se presentaron secreciones sanguinolentas en las fosas nasales y se produjo la pérdida progresiva del peso corporal. Por todos estos síntomas se decidió el traslado del animal hacia el laboratorio de Anatomía Patológica el día 22 del ensayo, donde se sacrificó y realizó la necropsia.
Al evaluar el efecto genotóxico de cualquier sustancia en un organismo, resulta muy relevante el estudio de estos efectos en células germinales, porque brindan información sobre el daño genético transmisible de una generación a otra (12). Cualquier daño en el funcionamiento de las gónadas puede ocasionar trastornos reproductivos, viéndose afectada la fertilidad y originándose individuos portadores de enfermedades genéticas. Estos ensayos en células germinales son intrínsecamente relevantes para la evaluación de la seguridad y valoración del posible resultado reproductivo, pues el cambio en los parámetros espermáticos probablemente surja de la interferencia de la sustancia de prueba con la diferenciación genéticamente controlada de las células espermáticas (12).
La frecuencia de espermatozoides anómalos y concentración espermática inducida por EcoMic® y LicoMic® no resultó significativa a las dosis evaluadas, lo cual indica la no genotoxicidad de estos biofertilizantes in vivo en el ensayo de la morfología de los espermatozoides. Este ensayo identifica aquellos agentes que causan las pequeñas alteraciones en el ADN testicular, conociéndose que las características que determinan la forma de la cabeza del espermatozoide son controladas por factores autosómicos y que el cromosoma y desempeña un papel importante en la determinación del porcentaje total de anormalidades de la cabeza de los espermatozoides (12).

CONCLUSIONES

Se concluye que en las condiciones experimentales en que se realizaron las evaluaciones mutagénicas del EcoMic® y LicoMic® (Glomus hoi like), empleando en ambos casos el ensayo de anormalidades de la cabeza del espermatozoide en ratón Cenp:NMRI por vía intragástrica y con los niveles de dosis evaluados:
El EcoMic no exhibió efectos genotóxicos ni citotóxicos sobre las células germinales.
El LicoMic tampoco mostró daños genotóxicos ni citotóxicos sobre dichas células.

REFERENCIAS

1. Titus, A. y Pereira, G. N. Bio-fertilizer for coffee plantations. (Consultado 7-6-2006). Disponible en: http://www.ineedcofee.com/03/soil/. 2006.
2. INCA. Documento descriptivo de los agentes biológicos presentes en el Biofertilizante EcoMic®, 2007.
3. Krishna, G. y Hayshi, M. In vivo rodent micronucleus assay: protocol, conduct and data interpretation. Mutation Research, 2000, vol. 455, p. 155-166.
4. Wyrobek, A. y Bruce, W. Chemical induction of sperm abnormalities in mice. Proc. Natl. Acad. Sci., 1975, vol. 72, p. 4425-4429.
5. MINSAP: Buró regulatorio para la protección de la salud pública. Principios de las buenas prácticas de laboratorio no clínico de seguridad sanitaria y medioambiental. Regulación 39/2004.
6. CENPALAB. Guía para el cuidado, uso y reproducción de los animales para experimentación en el laboratorio. La Habana, 2000.
7. Statistical Package Scientific System, SPSS for Windows, version 10.0.5.
8. Wikipedia. Proteus vulgaris. (Consultado 20-12-2008). Disponible en: http://en.wikipedia.org/wiki/Proteus_ vulgaris. 2008.
9. Chuaqui, B.; Chuaqui, R., Duarte, I., González, S., Etchart, M., Rosenberg, H. Lecciones de Anatomía Patológica. Neuropatología. Chuaqui, B. (Consultado 20-12-2008). Disponible en: <http://escuela.med.puc.cl/paginas/publicaciones/AnatomiaPatologica/09Neuropatologia/9tumores_nervper.html>.
10. Settels, E.; Bernauer, U.; Palavinskas, R.; Klaffke, H. S.; Gundert-Remy, U. y Appel, K. E. Human cytochrome P450 2E1 metabolizes acrylamide to glycidamide. Toxicology Letters, 2007, vol. 172.
11. Ashby, J. The unique role of rodents in the detection of possible human carcinogen and mutagen. Mutation Research, 1983, vol. 140, p. 71-4.
12. Shahabuddin, M. S. y Gopal, M. Genotoxicity of DNA intercalating anticancer drugs: Pyrimido (4I,5I:4,5) thieno(2,3-b)quinolines on somatic and germinal cells. Toxicology Mechanism and Method, 2007, vol. 17, p. 135-145.

Recibido: 31 de marzo de 2008
Aceptado: 19 de enero de 2009