Efecto del déficit hídrico sobre cambios morfo-fisiológicos y bioquímicos en plantas micropropagadas de piña ‘MD-2’ en la etapa final de aclimatización

 

Water effect deficit on morpho-physiological and biochemical changes in ‘MD-2’ micro-propagated pineapple plants at the end of acclimatization stage

 

 

René C. Rodríguez-Escriba,^I Ibraín D. Rodríguez-Cartaya,^II Gustavo Y. Lorente,^I Dariel López,^I Roberto E. Izquierdo,^I Lucía S. Borroto,^I Camilo Bonet,^III Yolanda Garza-García,^IV Carlos E. Aragón,^I Florencio E. Podestá,^V Romelio Rodríguez,^I Justo L. González-Olmedo^I

^ICentro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila. Ciego de Ávila, Cuba.
^IIUniversidad de La Habana. La Habana, Cuba.
^IIIInstituto de investigaciones de Ingeniería Agrícola, La Habana, Cuba
^IVUniversidad Autónoma de Coahuila, México.
^VCentro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos. Fac. de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario. Rosario, Argentina.

 

 

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RESUMEN

La tecnología actual de micropropagación de piña presenta problemas con la transición de las plantas al campo, dichos problemas se asocian al drástico cambio de las condiciones ambientales unido al pobre endurecimiento de las plantas para su tránsito. Una posibilidad de su preparación es la inducción de mecanismos defensivos mediante el déficit hídrico y consigo la modulación de CAM (Metabolismo Ácido de las Crasuláceas, siglas en inglés) por lo que en este trabajo se estudiaron plantas crecidas durante 30 días en dos regímenes hídricos (plantas con riego y sin riego), después de este momento ambos grupos se regaron hasta la saturación del sustrato durante 15 días. Las determinaciones se realizaron en la hoja “D” con frecuencia quincenal. Se determinó el intercambio gaseoso, eficiencia en el uso del agua (EUA), porcentaje de captación de CO₂ en la noche, contenido de clorofilas, niveles de ácidos orgánicos, índice de suculencia (IS) y actividad de superóxido dismutasa (SOD) (EC 1.15.1.1). A los 15 días las plantas sin riego tuvieron la mejor respuesta para su traslado a campo, con el aumento de la expresión de CAM, sustentado por la disminución del contenido de clorofilas totales y por el incremento del porcentaje de asimilación de CO₂ durante la noche, EUA, IS y actividad SOD. A los 30 días las plantas sin riego tuvieron una respuesta CAM de mayor intensidad, con el 100 % de captación de CO₂ durante la noche, pero su rápida recuperación con el establecimiento del riego hasta la saturación del sustrato, lo cual demostró alta tolerancia a la sequía y elevada plasticidad metabólica.

Palabras clave: ciclo CAM, fotosíntesis, vitroplantas.

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ABSTRACT

Current technology of pineapple micro-propagation has problems with the plants transition to field, these problems are associated to drastic changes of environmental conditions linked to poor hardening plant for such transit. A possibility of preparation is the induction of defense mechanisms to drought stress and get modulating CAM, so that the object of this paper was study plants grown for 30 days in two water status (well-watered plants and non-watered plants) after 30 days both groups were full-watered during 15 days. Measurements were made on D-leaf, in which were determinates the gas exchange, water-efficiency use (WEU), night CO₂ uptake percentage, chlorophyll content, organic acids levels, succulence index (IS) and superoxide dismutase activity (SOD) (EC 1.15.1.1). After 15 days of drought, plants had the best response to field transfer, with increase in CAM expression, supported by the decline in total chlorophyll content and increases in the night CO₂ uptake percentage, WEU, SI, and SOD activity. After 30 days of drought plants had a CAM strong response, with 100 % of CO₂ uptake during night, but its rapid recovery with the establishment of irrigation to saturation of the substrate, showing high drought tolerance and great metabolic plasticity.

Key words: CAM cycle, photosynthesis, vitroplants.

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INTRODUCCIÓN

El híbrido ‘MD-2’ posee caracteres de elevada importancia agronómica con altos rendimientos productivos y calidad de fruta comparada con el resto de los cultivares de piña (1).

La necesidad de introducir ‘MD-2’ en las plantaciones cubanas, requiere de grandes producciones de material de propagación en el menor tiempo posible, lo cual es posible con la utilización de las técnicas de cultivo in vitro como herramientas de la micropropagación, tecnología que permite obtener gran número de plantas en poco tiempo y con mejor calidad; sin embargo, los laboratorios de micropropagación tienen limitaciones, dicho proceso tecnológico induce en las plantas un estado fisiológico desventajoso para la transición a condiciones ex vitro y, como consecuencia, la obtención de bajas tasas de crecimiento e insuficientes porcentajes de supervivencia durante la aclimatización (2).

Se han realizado investigaciones para determinar el mejor medio químico o físico de cultivo in vitro para obtener plantas capaces de aclimatarse a las condiciones ex vitro (3, 4) y en la fase de aclimatización (5, 6). Sin embargo, el protocolo utilizado para la aclimatización presenta problemas con la transición de las plantas al campo, una vez que son plantadas muestran quemaduras en las hojas y senescencia en algunos tejidos con una consecuente baja supervivencia.

Estos problemas están asociados al estrés provocado por el drástico cambio entre las condiciones ambientales de la fase final de aclimatización y el campo (7), por lo que es necesario desarrollar investigaciones encaminadas a disminuir el efecto negativo que ejerce el ambiente en las plantas de piña ‘MD-2’ en la transición hacia el campo.

Ananas comosus presenta metabolismo ácido de las crasuláceas (CAM). Las plantas con CAM pueden operar de diferentes modos: “CAM constitutiva” o “CAM obligada”, con alta acumulación de ácidos (ΔH⁺) y captación de CO₂ durante la noche; “CAM inducible o “CAM facultativa”, conocidas también como “C3-CAM” con una forma C3 de fijación de CO₂ y variación nula de ΔH⁺ en el estado no inducido; pero en el estado inducido presenta pequeñas fijaciones de CO₂ en el día y altos niveles de ΔH⁺ durante la noche; “CAM cíclica” con fijación de CO₂ durante el día y ΔH⁺ pero no presenta apertura estomática durante la noche; CAM “Idling” o “CAM fútil”, con cierre estomático y pequeñas variaciones de ΔH⁺ durante todo el día y la noche en plantas severamente estresadas (8).

Estos comportamientos pueden exhibir diferente fisiotipos dentro del propio metabolismo, como en el caso de las plantas “CAM constitutivas”, las cuales pueden ser fuertes o débiles, de acuerdo a la magnitud de expresión de la ruta C4. La piña en su hábitat o en condiciones de producción en el campo responde como una “CAM constitutiva fuerte” (9), pero se ha demostrado que las plantas micropropagadas pueden exhibir un fisiotipo diferente, estas pueden ser C3 o CAM de acuerdo a las condiciones de crecimiento in vitro (3, 4, 10, 11); además, estudios previos demostraron que un incremento de la intensidad lumínica aumenta la magnitud de expresión CAM en la etapa de aclimatización y que las plantas tratadas adquirieron un estado morfo-fisiológico y bioquímico ventajoso para la transición al campo (1).

Teniendo en cuenta que CAM se expresa y modula con cambios en las variables ambientales como intensidad lumínica, humedad, nutrición y temperatura (12), desde el punto de vista práctico y con una perspectiva económica se pueden realizar manejos con frecuencia e intensidad de riego para inducir una mejor respuesta morfo-fisiológica y bioquímica de las plantas en la etapa final de aclimatización favoreciendo el tránsito aclimatización-campo y por ende el incremento de la supervivencia.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Esta investigación se realizó entre los meses septiembre y noviembre del 2014 en el área de aclimatización del Centro de Bioplantas. Se utilizaron plantas de piña Ananas comosus (L.) Merr. ‘MD-2’ micropropagadas, según el protocolo establecido en el centro de Bioplantas. Se seleccionaron plantas de más de 4,0 cm de longitud, con 7,0 a 8,0 g de masa fresca y cinco y seis hojas funcionales y se sumergieron durante cinco minutos en una solución de Previcur Energy^® (Bayer CropScience) [3,0 mL L^-1] (13). Seguidamente se plantaron en envases plásticos con un volumen de sustrato de 256,26 cm³ con relación 1:1 (v/v) entre suelo ferralítico rojo y cachaza (derivado de la caña de azúcar) (6).

Las plantas se aclimatizaron en una casa de cultivo con condiciones promedios de 80±3 % de humedad relativa, 25,5±2 °C de temperatura (determinados con un termo-higrómetro digital “TECPEL^® modelo DTM- 303”), luz y fotoperiodo natural con un Flujo de Fotones Fotosintéticos (FFF) de 400 ± 25 µmol m^-2s^-1 y condiciones atmosféricas de concentración de CO₂ entre 330 y 375 µmol mol^-1 (determinados con un sistema portátil de fotosíntesis “PP Systems CIRAS-2 Portable Photosynthesis System”). El riego se realizó por aspersión durante 10 minutos a las 9:00 y 14:00 h diariamente. Se aplicó fertilización foliar con una mochila de fumigación cada 15 días con NPK cristalino [1,0 g L^-1] y Multimicro Combi (Haifa Chemicals Ltd., Haifa Bay 26120, Israel) [62,5 mg L^-1].

Después de cinco meses en aclimatización se seleccionaron 400 plantas de 34-36 g de masa fresca con 11-12 hojas y 12-13 raíces funcionales y se trasladaron al exterior de la casa de cultivo con una intensidad lumínica de 800 µmol m^-2s^-1. Los grupos se sometieron a diferentes condiciones de riego según Tabla I.

Se aplicó fertilización foliar a las 9:00 h en el momento inicial del experimento (N-P-K cristalino [1,0 g L^-1] y Multimicro Combi (Haifa Chemicals Ltd., Haifa Bay 26120, Israel) [62,5 mg L^-1]). El día 31 del experimento se aplicó fertilización foliar a las 9:00 h (N-P-K cristalino [1,0 g L^-1] y Multimicro Combi (Haifa Chemicals Ltd., Haifa Bay 26120, Israel) [62,5 mg L^-1]). El riego se realizó con una regadera manual, distribuyendo de manera homogénea 100 L de agua sobre la superficie foliar de las plantas cada 24 h.

Determinaciones morfológicas: se tomaron 30 plantas para la determinación del número de hojas y longitud y ancho de la hoja D. Además se determinó la masa fresca y seca de 10 discos de hojas de 0,785 cm² en cuatro hojas D colectadas a las 15:00 h y se calculó el contenido de agua.

Cuantificación del intercambio gaseoso en las hojas: se cuantificó el intercambio gaseoso cada tres horas hasta completar un día. Se utilizó un analizador infrarrojo de gases (IRGA) como parte de un sistema de fotosíntesis portátil (PP Systems CIRAS-2 Portable Photosynthesis System). Se tomaron tres hojas D y se realizaron 30 mediciones para cada momento y tratamiento. Las determinaciones se realizaron en condiciones de temperatura y humedad relativa ambientales, con un FFF de 600 µmol m^-2s^-1 (14) . Para el análisis de los resultados se tomó el promedio entre las 21:00 y las 9:00 h. Se calculó la eficiencia en el uso del agua con la división de la tasa de asimilación de CO₂ y la tasa transpiratoria. Además se determinó el porcentaje que representó la asimilación de CO₂ entre dichas horas respecto al día completo.

Cuantificación del contenido de clorofilas: se colectaron tres hojas D a las 15:00 h y se conservaron en nitrógeno líquido (NL) hasta el momento de las determinaciones. Se tomó 0,1 g de hojas y se maceraron en un mortero con NL hasta obtener un polvo fino. Se adicionaron 500 µL de acetona al 80 % con 2,5 mM de Fosfato de sodio pH 7,8, posteriormente se centrifugó a 12 000 g durante 15 minutos a 4 ºC con una centrífuga refrigerada al vacío Beckman (JB-21). Se colectó el sobrenadante y se midió la absorbancia a 664 nm y 647 nm. Se calcularon las concentraciones de clorofilas a, b y totales (15). Se utilizó un espectrofotómetro “Pharmacia Bio-Spectrophotometer”. Los resultados se expresaron en función de la masa fresca y se convirtieron de µg Cfls g^-1 MF a µg Cfls cm^-2 como es descrito (3).

Cálculo del índice de suculencia: el Índice de Suculencia (IS) se calculó utilizando los valores del contenido de clorofilas totales [Cfls (a+b)] y el contenido de agua (CA) de los discos de hojas “D”. Se utilizó la ecuación IS= CA [Cfls (a+b)]^-1 (16).

Determinación de los niveles de ácidos orgánicos: se tomó 1g de hojas, se adicionaron 10 mL de Etanol 50 % y se incubaron en un baño a 90 ºC durante 20 minutos. Se separó la fase líquida y se realizó una valoración ácido-base, con NaOH [20 mM] y fenolftaleína [1 mg L^-1] como indicador (17). Los resultados se expresaron en µmol H+ h^-1g^-1 MF.

Cuantificación de proteínas y actividad de la enzima Superóxido Dismutasa: se pesaron 0,5 g de material vegetal y se maceraron con NL hasta obtener un polvo fino, se añadieron 2 mL de buffer fosfato de potasio 50 mM pH 7,8 con 1 mM EDTA; 0,1 % Triton X-100 (v/v); 1 % PVP; 1 mM DTT y 1 mM PMSF), luego se centrifugó a 15 000 g durante 20 minutos a 4 ºC con una centrífuga refrigerada al vacío Beckman (JB-21) (16). Se colectó el sobrenadante y se cuantificó el contenido de proteínas (18), utilizando una curva patrón con “Bobine Sero Albumin” (BSA) como proteína estándar. El contenido de proteínas se expresó en mg Prot. g^-1 MS. La actividad de la enzima Superóxido dismutasa (SOD) (EC 1.15.1.1) se determinó por el método de oxidorreducción del citocromo C como es descrito (16). La actividad enzimática se expresó como U mg^-1 MS. Una unidad de actividad SOD se definió como la cantidad de enzima capaz de inhibir el 50 % de velocidad de reducción del citocromo C.

Análisis estadístico: todas las determinaciones fisiológicas y bioquímicas se replicaron tres veces en tres muestras biológicas diferentes para cada momento de evaluación y tratamiento. Se utilizó el software Statgraphics Centurion XV (19). Los resultados se procesaron con “ANOVA factorial” seguido por “Tukey’s Multiple Range test” para rangos múltiples, o “Kruskal-Wallis” seguido por “Student-Newman-Keuls” en los casos necesarios. Todas las pruebas estadísticas fueron realizadas con un nivel de significación de un 5 %.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Efecto del déficit hídrico en indicadores morfológicos

Después de 15 días en las plantas sometidas al déficit hídrico (SR) se observó un cese de la elongación de la hoja D (Figura 1A; sin embargo, a partir de los 30 días, cuando ambos grupos fueron regados hasta la saturación del sustrato se observó un aumento de la longitud de dicha hoja en este mismo tratamiento. Por otra parte, durante el periodo de déficit hídrico (hasta 30 días) no se observó emisión de hojas en las plantas SR (Figura 1C), pero sí con el restablecimiento del riego.

El déficit hídrico afectó tanto la elongación de las plantas SR como la emisión de hojas, lo cual está relacionado con una mejor aclimatación a condiciones ambientales adversas. La tasa de crecimiento y por ende la productividad de biomasa de plantas CAM terrestres son muy bajas comparadas con plantas C3 y C4 bajo condiciones poco estresantes; sin embargo, dentro de una misma especie CAM la productividad de biomasa está favorecida por condiciones ambientales favorables (12, 20, 21) y viceversa.

En contraste se observó un incremento continuo del ancho de la hoja D durante el periodo de déficit hídrico (Figura 1B), seguido por un cese de su incremento después del establecimiento del riego (a los 45 días). Las plantas de piña micropropagadas en condiciones de aclimatización presentan una relación directa entre el aumento del ancho de dicha hoja y la expresión (3) y modulación (16) de CAM bajo condiciones estresantes.

Es importante señalar que también se observó un incremento continuo aunque en menor grado en las plantas CR, esto pudo estar asociado al traslado de las plantas al exterior de la casa de cultivo, unido al incremento de la edad fisiológica de las plantas. Ambos grupos se expusieron a la luz solar directa durante 30 días antes de iniciar el experimento, de esta forma el incremento del ancho de la hoja “D” en las plantas CR pudo estar relacionado con un aumento gradual de la expresión CAM, como una respuesta a la alta intensidad lumínica y al incremento de la edad fisiológica de las plantas. Además, la tasa evapotranspiratoria en el exterior de la casa de cultivo debió ser superior que en el interior de esta, considerando que en el exterior existió una menor humedad relativa, mayor velocidad del viento y altos niveles de irradiación, lo cual favorece la difusión del agua al aire tanto del suelo como de la superficie foliar, de modo que el riego establecido en el interior de la casa de cultivo pudo ser insuficiente en el exterior, y por ende las plantas CR pudieron quedar expuestas a un déficit hídrico ligero que provocaría el incremento gradual de la magnitud de expresión CAM, y como respuesta el incremento del ancho de la hoja “D” durante el periodo experimental.

Efecto del déficit hídrico en el contenido de agua, clorofilas totales e índice de suculencia

El contenido de agua de las hojas en las plantas SR disminuyó durante el periodo de déficit hídrico en cada momento de evaluación hasta los 30 días (Figura 2A); sin embargo, cuando ambos grupos se regaron hasta la saturación del sustrato se observó un incremento considerable del contenido de agua de las hojas en las plantas SR (45 días), en este momento el contenido de agua de las hojas de las plantas SR alcanzó valores similares a las plantas CR.

Esto pudo estar asociado a la síntesis de tejidos acuíferos en las plantas SR durante el periodo de déficit hídrico, o a un incremento del potencial osmótico de las células asociado al influjo de carbohidratos y ácido málico hacia el interior del tonoplasto.

Por otra parte en el contenido de clorofilas totales se observó una tendencia similar en ambos grupos (Figura 2B), con una disminución continua hasta los 30 días, seguido de un incremento con el establecimiento del riego diario hasta la saturación del sustrato (45 días). Sin embargo, las plantas CR presentaron valores superiores a las plantas SR en todos los momentos de evaluación.

En el caso del índice de suculencia mesofílica ambos grupos presentaron una tendencia similar durante todo el experimento pero un mayor grado en las plantas SR (Figura 2C), con un aumento de la suculencia de las hojas durante los primeros 30 días y una disminución con el establecimiento del riego hasta la saturación del sustrato.

El índice de suculencia mesofílica representa la relación entre los tejidos acuíferos y los tejidos fotosintéticos.

En este experimento se observó una disminución del contenido de agua en las hojas de las plantas SR provocado por el déficit hídrico severo; sin embargo, también se observó una disminución de los contenidos de clorofilas totales, esto indica que el déficit hídrico provocó una disminución del contenido de clorofilas totales en mayor grado que la disminución del contenido de agua de las hojas, lo cual e confiere mayor suculencia y magnitud de expresión CAM a las plantas SR.

Una planta es considerada CAM cuando este índice es superior a la unidad (8), y a mayor suculencia de tallos y hojas mayor magnitud de expresión CAM y mejor aclimatación a condiciones ambientales adversas (22, 23); sin embargo, el IS también se incrementó en las plantas CR durante el periodo de déficit hídrico, lo cual sustenta la conjetura de que en este grupo existió un aumento gradual de la magnitud de expresión CAM, como una respuesta al aumento de la edad fisiológica y el traslado de las plantas al exterior de la casa de cultivo.

Efecto del déficit hídrico en el intercambio gaseoso

Las plantas SR tuvieron una disminución de la asimilación de CO₂ a los 15 y 30 días de déficit hídrico respecto a las plantas CR y al momento inicial del experimento (Figura 3A). El establecimiento del riego hasta la saturación del sustrato favoreció la captación durante la noche en este mismo grupo.

Se observó una disminución continua de la transpiración en las plantas SR durante todos los momentos de evaluaciones en el periodo de déficit hídrico, con diferencias significativas entre ellos y entre tratamientos. En el establecimiento del riego hasta la saturación del sustrato se observó un incremento considerable de la transpiración en este mismo grupo de plantas, alcanzando valores cercanos a las plantas CR aunque estadísticamente diferentes. Las plantas SR tuvieron un incremento de la eficiencia del uso del agua durante el periodo de déficit hídrico, con diferencias significativas respecto a las plantas CR en todos los momentos evaluados; sin embargo ,con el restablecimiento del riego se observó una disminución significativa de este indicador en ambos grupos pero con valores superiores en las plantas SR.

El aumento de la magnitud de expresión CAM está relacionado con el aumento del porcentaje de captación de CO₂ durante la noche (24), para las plantas CAM constituye un beneficio captar mayor cantidad de CO₂ en momentos donde las condiciones ambientales son menos drásticas, y de esta forma evitar una pérdida excesiva de agua (12, 25, 26).
El déficit hídrico provocó una disminución de la captación de CO₂ de las plantas SR; sin embargo, el porcentaje de asimilación de CO₂ entre las 21:00 y 9:00 h se incrementó continuamente en las plantas SR (0-30 días) durante el periodo de déficit hídrico (Tabla II).

Cuando las plantas CAM se exponen a déficit hídrico presentan una disminución de la captación de CO₂ durante el día, sobre todo en horas cercanas al amanecer y anochecer, pero cuando el déficit hídrico es prolongado o severo cesan la captación de CO₂ durante todo o la mayor parte del ciclo diario (17, 27, 28, 29), en este estado las plantas CAM para su supervivencia captan y por ende reciclan todo o gran parte del CO₂ liberado durante la respiración (30, 31), y esta respuesta ante condiciones desfavorables se denomina “CAM Idling” o “CAM fútil” (8).

Se ha demostrado que en condiciones favorables de crecimiento, el CO₂ captado por la piña durante la noche (fase I) representa más del 75 % del CO₂ asimilado durante el día completo; sin embargo, ante el déficit hídrico prolongado y altas temperaturas durante el día pueden incrementar dicho porcentaje, lo cual le confiere elevada tolerancia a la sequía (32). Esto explica el incremento del porcentaje de asimilación de CO₂ durante la noche en las plantas SR (Tabla II) ante el déficit hídrico por 30 días, donde dicho porcentaje representó aproximadamente el 100 % de la captación durante todo el día, lo cual demuestra que las plantas SR tuvieron una respuesta similar a “CAM Idling” ante el déficit hídrico severo, con cierre estomático durante casi todo el día y apertura de los mismos solo cuando el gradiente para la transpiración fue mínimo.

Las plantas de piña micropropagadas ante déficit hídrico severo también respondieron de manera similar a plantas “CAM Idling”, en lugar de “CAM facultativas” (3, 4, 10, 11), o “CAM constitutivas” (1) como se ha demostrado para plantas de piña provenientes del cultivo in vitro. A pesar del déficit hídrico durante 30 días, 15 días después del restablecimiento del riego hasta la saturación del sustrato las plantas SR presentaron una rápida recuperación, demostrando una elevada plasticidad metabólica. Además, en este mismo momento también se observó un aumento en la longitud de la hoja “D” (Figura 1A) y número de hojas (Figura 1C) lo cual permite conjeturar que con la rehidratación de los tejidos de las plantas SR (Figura 2A) la partición de carbohidratos debió favorecer el crecimiento en mayor proporción.

En el caso de la transpiración las plantas SR presentaron una disminución de la transpiración con el aumento del déficit hídrico hasta 30 días (Figura 3B), a partir de este momento se observó un aumento considerable en la traspiración con el establecimiento del riego.

La disminución significativa de la transpiración en las plantas SR a los 15 y 30 días sustenta la hipótesis del incremento de la magnitud de CAM; sin embargo, la disminución considerable a los 30 días está relacionada además con la disminución de la asimilación de CO₂ (Figura 3A) y del contenido de agua de las hojas (Figura 2A), ambos indicadores en estrecha relación con el déficit hídrico implicando cierre estomático, lo que permite conjeturar de que a los 30 días las plantas SR respondieron de forma similar a “CAM Idling”. Además el déficit hídrico incrementó la eficiencia en el uso del agua durante la noche en las plantas SR a los 15 días (Figura 3C).

Un incremento en la eficiencia hídrica en las plantas CAM está relacionado con un incremento de la magnitud de expresión en plantas CAM terrestres (12). Respecto al tamaño de los órganos de las plantas CAM, los estomas aparecen en bajas densidades y presentan bajas conductividades al vapor de agua, reflejando una alta capacidad de almacenaje de agua en las hojas y tallos, disminución de la relación área-volumen de las hojas y por ende elevada eficiencia hídrica (12). Esto explica el incremento del contenido de agua de las hojas en las plantas SR a los 45 días (Figura 2A), y el aumento de la eficiencia hídrica de las plantas SR a los 15 y 45 días de evaluación, además sustenta la conjetura de que el incremento considerable del contenido de agua en las plantas SR a los 45 días pudo estar relacionado con la síntesis de tejidos de reserva de agua (Figura 2A) unido al incremento del potencial osmótico de las células.

Efecto del déficit hídrico en los niveles de ácidos orgánicos

Se observó en la Figura 4 una tendencia contraria en los niveles de ácidos orgánicos de ambos grupos. El déficit hídrico provocó una disminución de los niveles de ácidos orgánicos (AO) en las plantas SR hasta los 30 días de sequía, en contraste los niveles de AO en las plantas CR aumentó durante el periodo de déficit hídrico y luego disminuyó a los 45 con el establecimiento del riego hasta la saturación del sustrato.

En las plantas CAM el CO₂ asimilado durante la noche es fijado por la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) en fosfoenolpiruvato (PEP) el cual es convertido a malato y transportado al interior de la vacuola donde se almacena en forma de ácido málico (33); además, los cambios de los niveles de AO se corresponden fundamentalmente con los niveles ácidos málico, cítrico e isocítrico; sin embargo, en Ananas comosus los cambios en los niveles de AO se corresponden fundamentalmente con los niveles de ácido málico, permaneciendo constantes los niveles de ácido cítrico y despreciables los de isocítrico (16), además la relación entre los niveles de AO y málico responde a una estequiometria 2:1 (24).

De esta forma para la piña se puede establecer una relación directa entre los niveles de AO y los niveles de ácido málico producto de la asimilación nocturna, y por ende se puede decir que la cantidad de malato acumulado durante el periodo de déficit hídrico en las plantas SR fue inferior a los niveles de las plantas CR, lo cual sustenta la disminución de la asimilación nocturna de CO₂ (Figura 3A), la disminución de la rapidez de elongación de la hoja D y la cesación de la emisión de hojas durante el periodo de déficit hídrico.
El incremento de los niveles de ácidos orgánicos a los 45 días alcanzó valores similares en ambos grupos a los 15 días de estudio, esto implica una recuperación de las plantas SR del estrés hídrico prolongado.

El incremento gradual y continuo de las plantas CR pudo estar relacionado al incremento de la edad fisiológica, unido al efecto del traslado de las plantas al exterior de la casa de cultivo, este último relacionado con la exposición durante tiempo prolongado a condiciones de alta intensidad lumínica y a un déficit hídrico moderado, lo cual está asociado a la disminución de los niveles de ácidos orgánicos a los 45 días en este mismo grupo.

Las plantas CAM terrestres presentan un aumento del contenido de agua de tallos y hojas en respuesta a condiciones limitantes de humedad, este incremento se relaciona con la síntesis de tejidos de reserva de agua y con el aumento del potencial osmótico de las células, este último provocado por el influjo de ácido málico y carbohidratos que se almacenan en el interior de las grandes y dominantes vacuolas (12).

El incremento del potencial osmótico explica la disminución del contenido de agua en las plantas SR durante el periodo de déficit hídrico (Figura 2A), el incremento significativo de las plantas SR con el restablecimiento del riego y el aumento gradual de las plantas CR durante el experimento, lo cual está relacionado con un decremento o incremento de los niveles de ácidos orgánicos y por ende de ácido málico según el caso; aunque esta conjetura no es consistente con la disminución de los niveles de AO en las plantas CR a los 45 días, de modo que con el establecimiento del riego hasta la saturación del sustrato dicha disminución pudo estar asociada a una menor magnitud de expresión CAM.

Efecto del déficit hídrico en la actividad de Superóxido dismutasa

En la Figura 5 se observa un aumento de la actividad de SOD en las plantas SR a los 15 días de evaluación sin diferencias significativas entre ellas a los 30 días, a partir de este momento mostraron una disminución en la actividad de SOD. El déficit hídrico aplicado a las plantas SR provocó un aumento de la actividad SOD, esto indica que durante los momentos de déficit hídrico (15 y 30 días) las plantas SR debieron incrementar el grado de expresión ya que se ha demostrado que la expresión de CAM está relacionado con rutas de estrés oxidativo (4).

Con el restablecimiento del riego hasta condiciones de saturación del sustrato se observó una disminución significativa de la actividad de SOD en las plantas SR, esto implica una disminución de la magnitud de expresión CAM en este grupo. Las plantas CR no alcanzaron los valores de actividad SOD de las plantas SR en ninguno de los momentos de déficit hídrico, lo cual implica que las plantas SR presentaron una mayor capacidad para la eliminación del radical superóxido comparadas con las plantas CR, además indica que a los 15 días las plantas SR presentaron mejor preparación para atenuar el efecto negativo de las drásticas condiciones ambientales de campo comparado con las condiciones ambientales de aclimatización.

 

CONCLUSIONES

• Durante el periodo de déficit hídrico las plantas SR mostraron mayor magnitud de expresión CAM que las plantas CR, con mejor respuesta a los 15 días de experimento.
• A los 30 días se observó en este mismo grupo un comportamiento similar a “CAM Idling”, lo cual demuestra estrés hídrico severo en las plantas SR.
• Se observó que las variables estudiadas demostraron una disminución de la expresión de CAM con el restablecimiento del riego hasta la saturación del sustrato, de modo que las plantas de piña micropropagadas en la etapa final de aclimatización mostraron una elevada plasticidad metabólica, primeramente porque en solo 15 días de déficit hídrico tuvieron una respuesta ante dicho estrés para mantener la homeostasis celular, y como consecuencia el aumento de la magnitud de expresión de CAM e incremento de la calidad morfo-fisiológica, 15 días después del restablecimiento del riego hasta saturación del sustrato se observó un incremento en los indicadores morfológicos relacionados con el crecimiento, por lo que se puede decir que a los 15 días de déficit hídrico las plantas SR presentaron una mejor preparación para la transición a condiciones de campo.

 

BIBLIOGRAFÍA

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Recibido: 15 de mayo de 2015
Aceptado: 18 de enero de 2016

 

 

René C. Rodríguez Escriba, Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila. Ciego de Ávila, Cuba. Email: [e-mail]