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INTRODUCCIÓN
El polisacárido quitosano es una clase de macromolécula natural que tiene una tendencia extremadamente bioactiva y es derivado del exoesqueleto de crustáceos como langostas, cangrejos y camarones 1. El quitosano, polímero parcialmente desacetilado de la quitina, tiene la capacidad de ser biodegradable, biocompatible y no tóxico, por lo que se considera un compuesto muy atractivo. En la agricultura es empleado para estimular la germinación, modificar suelos, como agente fungicida y como elicitor de respuestas defensivas en plantas, entre otras. También en el área de la tecnología de alimentos, se utiliza en la elaboración de películas biodegradables y películas de empaque antimicrobianos 2,3.
Este compuesto ha demostrado tener actividad antifúngica sobre diferentes patógenos, entre ellos se encuentra Pyricularia oryzae (Cav). Este hongo produce la enfermedad piriculariosis que es de gran importancia en el cultivo del arroz, la cual produce grandes daños y se encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo 4. El quitosano y sus derivados han demostrado que actúan directamente sobre el hongo inhibiendo su crecimiento micelial y también estimulando los mecanismos de defensa en el cultivo del arroz y protegiendo a la planta del ataque del mismo patógeno 5-8.
Quitosano. Características químicas y físicas
El quitosano, es un polisacárido que se obtiene a partir de la quitina, segundo polisacárido más abundante en la naturaleza. Es un copolímero líneal formado por residuos de unidades de D-glucosamina en mayor medida y N-acetil D-glucosamina en menor medida, distribuidos aleatoriamente y unidos por enlaces β 1,4. Según la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC), es 2 amino 2 desoxi-D-glucopiranosa (D-glucosamina GlcN) y 2 acetamida- 2 desoxi- D glucopiranosa N-acetil glucosamina 1. Tanto el contenido como la secuencia de estas unidades determinarán las propiedades físico-químicas y biológicas de este polímero. El quitosano tiene un contenido de nitrógeno (N) mayor que 7 y posee una distribución regular de los grupos aminos libres, que pueden ser protonados por ciertos ácidos, cargándose positivamente y esto le da un carácter policatiónico. Este hecho permite explicar algunas de sus propiedades como son la habilidad de enlazarse con sustancias cargadas negativamente, tales como lípidos, proteínas, colorantes entre otras; así como floculante, adherente y adsorbente, adicionales a las reacciones típicas de las aminas 9. Al unirse los grupos amino del quitosano a los aminoácidos ácidos de las proteínas se produce las interacciones electrostáticas que conlleva a desórdenes celulares en los microorganismos.
Este biopolímero posee actividad antimicrobiana contra una amplia variedad de microrganismos incluyendo hongos, algas y algunas bacterias. Su funcionalidad y actividad depende de sus características como: masa molecular, grado de acetilación, célula huésped, presencia de nutrientes naturales, composición química o nutricional de los sustratos y condiciones ambientales. En este sentido, respecto al grado de acetilación se puede plantear que mientras menor sea el grado de acetilación, mayor es la actividad antimicrobiana 10,11.
Pyricularia oryzae agente causal del añublo o quemazón del arroz
Este patógeno de plantas es muy eficaz ya que puede reproducirse sexualmente (teleomorfo: Magnaporthe grisea Barr (It. Hebert) sin Magnaporthe oryzae) y asexualmente (anamorfo: Pyricularia oryzae). El Grupo de Trabajo Pyricularia/Magnaporthe ha establecido bajo los auspicios de la Comisión Internacional sobre la Taxonomía de Hongos (CITH) la posibilidad de conservar el nombre Magnaporthe sobre Pyricularia. Sin embargo, dicha conservación requiere un cambio en la especie tipo del género Magnaporthe y causaría numerosos cambios de nombres para esas especies actualmente ubicadas en Pyricularia12.
El nombre tipificado asexualmente Pyricularia es el nombre correcto para el hongo que produce la quemazón del arroz, que se corresponde bien con la patogenicidad y las características ecológicas y evolutivas. Por lo tanto, el nombre Pyricularia oryzae debe usarse para el hongo que produce esta enfermedad. Sin embargo, el sinónimo Magnaporthe oryzae puede seguir siendo mencionado en publicaciones como Pyricularia oryzae (syn. Magnaporthe oryzae). Esta práctica ayudará a cerrar una brecha potencial en la literatura y el conocimiento de esta importante especie 12. En cuanto a grisea y oryzae, son especies muy distintas. Grisea es para cepas de Digitaria y oryzae para cepas de arroz, trigo y otras gramíneas; aunque en la literatura se consideran sinónimos y se utilizan los cuatros nombres: Pyricularia oryzae, Magnaporthe oryzae, Pyricularia grisea y Magnaporthe grisea.
Pyricularia oryzae conocida como piriculariosis, añublo, quemazón, fallada, mancha, bruzone del arroz o tizón foliar es una de las enfermedades más serias del cultivo de arroz (Oryza sativa L.), la cual ha causado significantes pérdidas en los rendimientos a nivel mundial 13.
La distribución del añublo es mundial ya que se encuentra en todos los agroecosistemas de los trópicos y de las zonas templadas en que se cultiva el arroz comercial. La piriculariosis genera grandes pérdidas en la producción del grano, tanto en el sistema de secano como en el de riego. Esta enfermedad se ha reportado en al menos 85 países de todo el mundo. Se descubrió en Italia en 1560 y más tarde fue encontrada en China (1637), Japón (1760), Estados Unidos (1960) y la India (1913) 14. La piriculariosis ha causado significantes pérdidas, por ejemplo: en la India el 90 % 15, en China el 70 % 16, en Tailandia fue afectada en 1987 solamente 1900 ha, ya en 1988 se incrementó a 490 000 ha, en España y en la zona del mediterráneo también ha causado daños 17. México, por su parte ha reportado un abatimiento de la producción hasta del 30 % en siembras de temporal. Cuba ha sido otro de los países donde ha causado daños este patógeno y cuando las condiciones son favorables se ha incrementado las pérdidas hasta un 70 % 6.
Clasificación taxonómica, morfología y sintomatología de Pyricularia oryzae
El agente causal de la piriculariosis se clasifica taxonómicamente en la clase: Deuteromicetes, orden: Moniliales, familia: Dematiaceae, género: Pyricularia, especie: Pyricularia oryzae. Pyricularia oryzae posee conidióforos simples, tabicados y de color pardusco (Figura 1 A). Los conidióforos nacen solitarios o en grupos de tres y en sus extremos llevan los conidios. Los conidióforos nacen solitarios o en grupos de tres y en sus extremos llevan los conidios, los cuales son hialinos, fusiforme y están divididos por dos septos en forma equidistantes.
Imágenes de los autores
Figura 1 Conidios de Pyricularia oryzae A), tallo B) y hoja C) de arroz infectados por este hongo
Es una enfermedad compleja debido a la variabilidad patogénica y a la rapidez con la que este hongo vence la resistencia de la planta de arroz. El micelio del hongo produce una sustancia tóxica conocida como piricularina 16, que inhibe el crecimiento de los tejidos y los desorganiza. Ataca las partes aéreas de la planta como las hojas, tallos, nudos y espigas 18 (Figuras 1 B, C). El hongo produce unas manchas o lesiones en las hojas de forma alargadas o elípticas a romboides y de color marrón uniforme que más tarde cambiarán a un color grisáceo en la parte central, hecho que indica la esporulación del hongo; aunque su tamaño y color varían de acuerdo con las condiciones ambientales y con la susceptibilidad de las variedades 19. Su temperatura óptima de crecimiento está entre 22-29 oC y una elevada humedad relativa entorno al 90 %, que coinciden plenamente con las condiciones climáticas de países tropicales. La presencia de elevadas concentraciones de nitrógeno en el agua favorece también el desarrollo del hongo y produce gran cantidad de esporas. Las esporas llegan desde los restos de cosecha de la temporada anterior o de malas hierbas donde ha estado alojado el hongo durante el invierno 20.
Estrategias generales para el control de Pyricularia oryzae
El control de la enfermedad se basa, principalmente, en la aplicación de fungicidas químicos sistémicos entre los que se cuentan los del grupo de los benzimidazoles, como el procloraz, tebuconazol y propiconazol, entre otros. Sin embargo, su uso ha presentado varias desventajas, ya que ocasionan contaminación del manto freático y de los cuerpos de agua colindantes, generando efectos nocivos sobre diversos organismos. Además, es importante señalar, que estos fungicidas químicos están siendo vulnerados por el hongo, a causa del surgimiento de poblaciones con pérdida de sensibilidad a su modo de acción 21. Debido a esta situación se viene presentando un número creciente de ciclos de fungicidas por año para proteger los cultivos contra esta enfermedad, lo cual implica un incremento en los costos de producción y en efectos negativos de los fungicidas convencionales sobre el ambiente, cuestionando su uso comercial, siendo entonces prioritario la búsqueda de alternativas que permitan complementar al manejo integrado de las enfermedades.
Actividad in vitro e in vivo del quitosano y sus derivados sobre Pyricularia oryzae
La propiedad antimicrobiana del quitosano y sus derivados han recibido considerable atención en años recientes, debido al inminente problema asociado con los agentes químicos sintéticos. Estos compuestos han demostrado ser fungicidas y fungistáticos para el control de Botrytis cinerea, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Drechstera sorokiana, Fusarium acuminatum, Fusarium graminearum, Micronectriella nivalis, Rhizoctonia solani, Alternaria alternata, Colletotrichum gloesporioides, Penicillum spp., Fusarium oxysporum y Bipolaris oryzae, entre otros hongos 22-26.
Al respecto, la actividad antifúngica del quitosano y sus derivados ha sido observada en diferentes estados de desarrollo de los hongos como la afectación al crecimiento y el desarrollo del agente patógeno, esporulación, viabilidad y germinación de las esporas y la producción de factores de virulencias fúngicos 23,27,28. Algunos autores han comprobado el efecto fungicida de estos compuestos a diferentes concentraciones y aislamientos de P. grisea5,7,29. También los oligómeros de quitosano han demostrado tener mejor efecto inhibitorio sobre este patógeno, logrando la concentración mínima inhibitoria a una concentración mayor de 2000 mg L-1 (30.
Estudios llevados a cabo en el laboratorio de Oligosacarinas del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) con P. grisea indican que el quitosano y sus oligómeros en el medio de cultivo a la concentración de 1,000 mg L-1 y pH 5.6, inhibieron totalmente el crecimiento micelial de este hongo 5. Sin embargo, es importante considerar el pH de la disolución resultante, que afecta la carga positiva de los grupos aminos, pues en otro ensayo a pH 6 solo hubo una ligera afectación del crecimiento del hongo, aunque se mantuvo una inhibición total de la esporulación 7.
Algunos grupos de investigación han comenzado a modificar la molécula del quitosano con adición de grupos hidrofóbicos para aumentar su actividad biológica contra este patógeno. Por ejemplo, N-sulfonada N-sulfobenzoil quitosano 31, N,N,N.trimetil quitosano 32 N,O-acyl quitosano 33, O-acil quitosano 34,35, hidroxietil aril quitosano 36, dimetilpiperazina quitosano 37, carboximetil quitosano 38, acil urea tiourea quitosano 39, N-succinoil quitosano 40 y N-heterocíclico quitosano 41. Investigadores han notado que la N-alquilación o N-arilación del quitosano con aldehídos aromáticos o alifáticos aumentaron efectivamente su actividad antifúngica sobre P. grisea42.
Con los mismos métodos y técnicas de obtención, pero utilizando diferentes tipos de aldehídos, otros científicos 31, observaron actividad antifúngica de 24 nuevos derivados de quitosano (derivados N-benzil quitosanos), los cuales tuvieron mayor efecto inhibitorio que los quitosanos nativos sobre el crecimiento y la formación de esporas de P. grisea, siendo N-(m-nitrobencil) quitosano quien logró el mayor efecto a la concentración de 5 g L-1. También estos autores observaron que el derivado más activo fue N-(2,2 difeniletil) quitosano, con una concentración mínima inhibitoria de 0,3 g L-1 contra este patógeno. Por otra parte, grandes avances del quitosano y sus oligómeros sobre el control directo de enfermedades del arroz ha sido observada. Tanto la quitina como el quitosano han demostrado que inducen la acumulación producción de fitoalexinas en este caso de momilactonas A y momilactonas B ante una infección con P. grisea en hojas de arroz a la concentración de 10 µg mL-1 (43.
Un grupo de investigadores publicaron el efecto del quitosano en la estimulación de respuestas de defensa en hojas de arroz 44. Después del tratamiento con quitosano al 0,1 %, se observó claramente necrosis en la parte superior de la hoja de arroz. Sin embargo, al tratar plántulas de arroz con 5 mg L-1 e inocularlas con Magnaporthe grisea 97-23-2D1 se demostró un mejor efecto y control de la enfermedad en más de un 50 % 45. Sin embargo, en el año 2007 se evaluó, en condiciones semicontroladas, donde trataron semillas de arroz a diferentes concentraciones con dos quitosanos de diferente peso molecular 6. A los 18 días de germinada la semilla las plantas obtenidas fueron inoculadas con esporas de P. grisea, se determinó la actividad de enzimas relacionadas con la defensa como PAL, glucanasa, quitinasa y quitosanasa, observándose un incremento en la actividad de las plantas tratadas con los elicitores, en relación con el control. Además, de no observarse síntomas de la enfermedad en la concentración más elevada utilizada de ambos compuestos 6.
Actualmente, se investiga la aplicación de nanopartículas a base de quitosano con actividad antifúngica y para el control de enfermedades como la piriculariosis 8,46,47. Por su parte, estudiosos del tema encontraron que nanopartículas de quitosano y plata (Ag) tuvieron una elevada actividad antifúngica sobre Pyricularia oryzae a una concentración de Ag (2 ppm) y de quitosano (4000 ppm) 46. Sin embargo, otros científicos observaron que aplicando 500 μl de una solución de nanopartículas de quitosano al 0,1 % sobre hojas de arroz y 24 h más tarde inoculó una suspensión de esporas (1x105 esporas mL-1) de P. grisea8. A los 10 días no se observaron síntomas de la enfermedad, esto pudo deberse por la estimulación de algún mecanismo de defensa en las hojas y controló la infección 8.
Mecanismos de acción del quitosano
Los mecanismos de acción del quitosano no han sido del todo establecidos, aunque existen algunas hipótesis al respecto. En general, las diversas propuestas para explicar la actividad antimicrobiana del quitosano consideran como característica fundamental la naturaleza policatiónica de la molécula, la cual está dada por los grupos NH3 + de la glucosamina, que le confiere importantes propiedades biológicas y fisiológicas 48,49. En condiciones de pH, el quitosano se comporta como polielectrolito lineal, con un pK alrededor de 6.5, por lo tanto a pH bajos los residuos de glucosamina están cargados positivamente, debido a la protonación de sus residuos aminos, conteniendo una alta densidad de cargas positivas, lo que le permite unirse fuertemente a superficies cargadas negativamente 50. Se plantea que cuando la carga positiva sobre el C-2 del monómero de glucosamina se encuentra por debajo de pH 6, del quitosano es más soluble y tiene una mejor actividad antimicrobiana que la quitina 31,51.
Otro mecanismo propuesto es la interacción entre la carga positiva de la molécula de quitosano y la carga negativa de las células de la membrana microbiana que conduce a la salida de proteínas y otros constituyentes intracelulares 31. El más abundante de los esfingolípidos es el manosildiinositolfosfato-ceramida (M(IP2)C), el cual presenta dos cargas negativas. Estas cargas negativas correspondientes a la membrana plasmática (M(IP2)C, pueden unirse a los grupos aminos de los residuos de glucosamina del quitosano. En otros estudios se ha observado, que el quitosano forma canales de transporte de moléculas en bicapas lipídicas artificiales, lo que provee evidencia de que este compuesto puede desorganizar a la membrana celular 50. Por su parte, un grupo de trabajo analizaron el modo de acción del quitosano sobre las células fúngicas y observaron dos aspectos: que el quitosano permeabiliza la membrana plasmática del hongo y penetra a las células del hongo, proceso que es dependiente de ATP y también demostró que diferentes tipos de células (conidio, tubo germinativo e hifa) exhiben diferente sensibilidad al quitosano 52,53. En el año 2010, el mismo grupo de investigadores demostró, a través de técnicas biológicas, bioquímicas, genéticas y biofísicas, que la actividad antifúngica del quitosano depende de la fluidez de la membrana plasmática del hongo, la cual está determinada por la composición de sus ácidos grasos polinsaturados y esto sugiere una nueva estrategia para la terapia antifúngica, que involucra tratamientos que incrementan la fluidez de la membrana plasmática para hacer el hongo susceptible a biocompuestos como el quitosano.
El quitosano también actúa como agente quelante que une, selectivamente, a trazas de metales y, por consiguiente, inhibe la producción de toxinas y el crecimiento micelial 54. Además activa algunos procesos de defensa en los tejidos hospederos 55 e inhibe varias enzimas. La unión del quitosano con el ADN y la inhibición de la síntesis de ARNm y síntesis de proteínas 56, provocando daños celulares y estructurales.
En el caso de las nanopartículas de plata (Ag) se basa en la posibilidad de que estás se adhieran y penetren en la membrana celular 57, causando desbalance osmótico en las esporas, siendo muy efectivas contra Magnaporthe grisea58.
CONCLUSIONES
En la literatura reportada, se demuestra que el quitosano y sus derivados son capaces de actuar sobre P. oryzae, ya sea de forma directa, inhibiendo el crecimiento micelial y la producción de esporas del mismo o por inducción de los mecanismos de defensa en la planta de arroz, por lo que estos compuestos pudieran ser utilizados en la agricultura haciéndola más sostenible. Sin embargo, aún es conveniente profundizar en otras líneas de investigación como la evaluación de dichos compuestos en estudios de campo, la factibilidad de desarrollar productos comerciales a base de este compuesto enfocándose, no sólo en el control, sino en los posibles mecanismos de acción por los que estos compuestos actúan sobre el hongo y en la planta.
