Revista Cubana de Medicina Tropical, enero-junio, 1995

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Caracterización físico-química de los agentes aislados durante el brote de neuropatía epidémica en Cuba. Parte I

Dra. MARIA G. GUZMAN,<1 Lic. ROSMARI RODRIGUEZ,<2 Dra. SONIA RESIK,<3 Lic. MAYLING ALVAREZ,<4 Lic. LUIS MORIER,<5 Lic. AIDA CASTILLO,<6 Dr. GUSTAVO KOURI1 y Dr. PEDRO MAS.1

RESUMEN

En el presente trabajo se reportan las características físico-químicas presentadas por los agentes aislados en muestras de pacientes con neuropatía epidémica. Los Enterovirus aislados se comportaron en la forma descrita para estos virus. Los agentes productores de efecto citopático ligero (ECP-L) se comportaron en forma variable en lo que se refiere a la sensibilidad al cloroformo, por otra parte no fueron sensibles al ácido fosfonoacético (PAA) ni al cloruro de guanidina (GHCl) y crecieron en células previamente tratadas con bromodeoxiuridina (BDUR). Estos resultados sugieren la presencia de 2 agentes que recuerdan a los Enterovirus y a virus envueltos. Se necesita continuar profundizando en los estudios de caracterización de estos agentes.

Palabras clave: NEURITIS/líquido cefalorraquídeo; NEURITIS OPTICA/líquido cefalorraquídeo; ENTEROVIRUS/aislamiento & purificación; EFECTO CITOPATOGENICO VIRAL; ALLIUM CEPA/aislamiento & purificación.

INTRODUCCION

A finales del año 1991 se reportó en Cuba un brote de polineuropatía. Comenzó en la región más occidental del país y se extendió posteriormente a las regiones central y oriental. La epidemia declinó a mediados del año 1993. Más de 50 000 pacientes fueron reportados, en su mayoría adultos.1

Se observaron 2 formas predominantes de la enfermedad, una caracterizada principalmente por síntomas ópticos y otra por síntomas y signos periféricos.

Diferentes factores tóxicos, nutricionales y biológicos han sido relacionados con la patogenia de la enfermedad.2

Varios Enterovirus y un agente productor de un efecto citopatogénico (ECP) de progresión lenta, peculiar y ligero fueron aislados en cultivos de células Vero a partir de muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) de los pacientes.3 Además, Ito et al. (comunicación personal) aislaron en varias muestras y cepas de estos pacientes el virus de Inoue-Melnick serotipo 2.

En el presente reporte se estudian algunas características físico-químicas del agente productor del ECP-L y se comparan con las de una de las cepas de Enterovirus aislada, así como con las características reportadas en la literatura en relación con el virus de Inoue-Melnick.

MATERIAL Y METODO

Células. Para la replicación de los virus estudiados y para la realización de los diferentes estudios se utilizaron cultivos de células Vero (ATCC) crecidas en nuestro laboratorio en medio 199 con 10 % de suero de ternero fetal y mantenidas posteriormente en el mismo medio con 5 % del suero.

Virus. Se estudiaron las cepas 47/93 IPK (previamente identificada como Coxsackie A9), 44/93 IPK, M26 CIGB y M28 CIGB aisladas en cultivos de células Vero a partir de LCR de pacientes con neuropatía epidémica (NE). Las cepas M26 y M28 fueron aisladas en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología y enviadas posteriormente a nuestro laboratorio, en el cual se acotaron como 589/93 CIGB y 590/93 CIGB. Las 3 últimas cepas (44/93, 589/93 y 590/93) fueron clasificadas de acuerdo con el tipo de ECP como productoras de ECP-L. Como controles se utilizaron los virus HSV tipo 1 y Coxsackie A9 (cepa 234/91 IPK) ambos mantenidos en nuestros laboratorios.

Todas las cepas fueron propagadas en cultivos de células Vero mantenidas en medio 199 conte niendo 5 % de suero de ternero fetal y antibióticos (en las dosis habituales) hasta que se observó ECP completo. Después de 3 ciclos de congelación y descongelación rápidos, los virus fueron "alicuotados" y titulados en células Vero por el método de Reed y Muench4 y posteriormente utilizados en los diferentes estudios.

Estudio de sensibilidad al cloroformo. Fueron incubados a temperatura ambiente en agitación durante 4 horas 0,2 mL de cada cepa viral y 0,2 mL de cloroformo (BDH). El mismo volumen de virus fue incubado con medio 199 en iguales condiciones. Posteriormente se centrifugó a 10 000 r.p.m. durante 10 minutos y se recogió el sobrenadante. Cada cepa viral (tratada con cloroformo y la mantenida con medio) fue diluida en medio 199 desde 10-1 hasta 10-8, y 0,1 mL de cada dilución se inoculó por duplicado en placas plásticas de 24 pozuelos sembradas con células Vero. Los cultivos fueron incubados a 37 oC en atmósfera de 5 % de CO2 y se realizó la lectura del ECP diariamente.

Estudio de sensibilidad frente al ácido fosfonacético (PAA) y al cloruro de guanidina (GHCl). Diluciones seriadas en base 10 de cada cepa viral fueron inoculadas con un volumen de 0,1 mL por duplicado en células Vero con monocapa confluente sembradas en placas plásticas de 24 pozuelos. Previamente, el medio de las células fue sustituido por medio de mantenimiento que contenía PAA (100 mg/mL) o GHC1 (200 Mol/L). Como control se inocularon células conteniendo sólo el medio de mantenimiento usual. Las placas fueron incubadas a 37 oC en atmósfera de 5 % de CO2 y la lectura del ECP se realizó diariamente.

Estudio de sensibilidad al acyclovir (ACV). El ACV fue preparado a una concentración de 10 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMS) y posterior mente en medio de mantenimiento a una concentración final de 100 mg/mL. Diluciones seriadas en base 10 de las cepas 44/93 IPK y de HSV fueron inoculadas en células Vero con monocapa con fluente a las que previamente se les había puesto medio de mantenimiento que contenía ACV (100 mg/mL). Cultivos inoculados con medio de mantenimiento sin ACV fueron utilizados como controles. La incubación y observación fueron similares a las descritas anteriormente.

Estudio de sensibilidad a la 5-bromodeoxyuri dina (BDUR). La BDUR fue disuelta en agua destilada a una concentración de 100 mg/mL. Cultivos de células Vero fueron tratados durante 3 días con medio de mantenimiento que contenía BDUR con una concentración final de 50 mg/mL. Posteriormente el medio fue removido y fueron inoculados 0,1 mL de las cepas 44/93 IPK, 47/93 IPK y 234/91 IPK. Después de 1 hora de incubación a 37 oC se añadió el medio de mantenimiento. Cuando el ECP fue completo, se realizó la cosecha y titulación viral en células Vero. Como controles del crecimiento viral fueron utilizados cultivos de células inoculadas en igualdad de condiciones y mantenidas en medio sin BDUR.

Estudio de estabilidad a diferentes temperaturas. Cada cepa viral fue diluida 1/10 en PBS (pH 7,2-7,3) en presencia y ausencia de MgC12 1Mol/L. Cada dilución se incubó durante 1 hora a 4 y 50 oC. Posteriormente, se realizaron diluciones seriadas en base 10 en medio de mantenimiento inoculándose en cultivos de células Vero. El procedimiento posterior fue similar a lo reportado anteriormente.

Estudio de sensibilidad a diferentes pH. Cada cepa viral diluida 1/10 en PBS preparado a diferentes pH (3, 5 y 7) fue mantenida durante 1 hora a 4 oC e inoculada posteriormente en células Vero. El procedimiento posterior fue similar al descrito anteriormente.

RESULTADOS

En la tabla 1 se presentan los resultados obtenidos en el estudio de las cepas frente a los agentes químicos. En todos los experimentos los virus controles utilizados se comportaron de la forma esperada. La cepa 47/93 IPK fue resistente al cloroformo y al PAA y sensible al GHC1. Las cepas 589/93 y 590/93 CIGB fueron sensibles al cloroformo solamente. La cepa 44/93 IPK no fue sensible al cloroformo aunque se observó un retardo en la aparición del ECP tal como puede observarse en la figura. Además no fue sensible al ACV ni a la BDUR.

En la tabla 2 se presentan los resultados obtenidos en el estudio de estabilidad de las cepas a diferentes temperaturas y pH. La cepa 589/93 CIGB fue sensible a temperaturas de 50 oC en presencia y ausencia de MgCl2 y a pH 3. La cepa 47/93 IPK fue resistente a temperaturas de 50 oC sólo en presencia de MgC12 y a pH ácidos.

DISCUSION

Las epidemias de neuropatías tropicales han sido descritas en las regiones ecuatoriales del mundo desde hace muchos años. Estas enfermeda des presentan una causa multifactorial. Una de ellas es la conocida como Subacute Myelo-Optic- -Neuropathy (SMON) reportada en Japón desde la década de los años 50 hasta 1972. Durante esta epidemia se observaron aproximadamente 10 000 enfermos, principalmente adultos. La enfermedad se caracterizaba por disturbios sensoriales acompañados de síntomas abdominales.5 A partir de muestras de LCR y heces de pacientes con esta enfermedad se aisló un agente viral al que posteriormente se le denominó virus de Inoue-Melnick.6 Este agente ha sido clasificado como perteneciente a la familia Herpesviridae siendo sensible al cloroformo, al PAA y al ACV.7

La epidemia observada en Cuba guarda estrecha similitud clínica con la reportada en Japón. Aún más, durante nuestra epidemia también se reportó el aislamiento de un agente cuyas características culturales guardaban aparente similitud con el virus de Inoue-Melnick.3 Además, se aislaron varios Enterovirus.

Con todos estos elementos intentamos caracterizar los 2 tipos de agentes aislados en el LCR de nuestros pacientes y comparar sus características a las reportadas para el virus de Inoue-Melnick y los Enterovirus.

Las cepas de Enterovirus aisladas en nuestros pacientes mostraron las características usuales para estos virus, tales como resistencia al cloroformo, sensibilidad frente al GHC1, resistencia a los pH ácidos y estabilidad a temperaturas de 50 oC en presencia de concentraciones determinadas de MgC12.8

Dos de las cepas productoras de ECP-L se mostraron sensibles al tratamiento con cloroformo, lo que podría sugerir la presencia de envoltura. Otra de las cepas de ECP-L, la 44/93 IPK se comportó como resistente aunque sí se observó un retardo en la aparición del ECP. Este estudio fue repetido en 3 ocasiones y se obtuvieron resultados similares (datos no mostrados).

No se pudo demostrar sensibilidad de ninguna de las cepas productoras de ECP-L frente al PAA y al GHC1, aunque se observó un retraso en la aparición del ECP. Por otra parte, la cepa 44/93 IPK creció en células previamente tratadas con BDUR lo que sugiere que su ácido nucleico es de tipo ARN.

Ito et al. (comunicación personal) reportaron la presencia del virus de Inoue-Melnick en las cepas 589/93 CIGB y 44/93 IPK. Estas cepas son neutralizadas con sueros hiperinmunes específicos a varios Enterovirus y, por otra parte, sueros hiperinmunes preparados a cepas de ECP-L neutralizan cepas de Cox A9 y B4.9 Los resultados de la caracterización físico-química unidos a los estudios antigénicos9 sugieren la presencia de 2 agentes en la misma muestra con algunas características comunes a los Enterovirus y a virus envueltos. Las cepas productoras de ECP-L no se comportan exactamente como lo reportado para el virus de Inoue-Melnick; por otra parte, presentan características semejantes a los Enterovirus al demostrar comunidad antigénica con estos agentes y ser virus aparentemente ARN.

Se necesitan estudios posteriores que demuestren si estamos en presencia de 2 agentes diferentes cuyas características frente a los agentes físico-químicos dependerán de cuál se exprese principal- mente (fenómeno que estamos observando ya que las cepas de ECP-L muestran características diferentes entre ellas en lo que se refiere a la sensibilidad al cloroformo), o si estamos en presencia de un virus defectivo que requiere la actividad de otro para su replicación o maduración.

AGRADECIMIENTOS

Queremos dejar constancia de nuestro agradecimiento a la UNESCO por haber financiado en parte esta investigación.

<1Doctor en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Microbiología.

<2Licenciada en Radioquímica.

<3Especialista de I Grado en Microbiología.

<4Licenciada en Microbiología.

<5Licenciado en Microbiología. Investigador Auxiliar.

<6Licenciada en Microbiología. Investigadora Agregada.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Institute of Tropical Medicine "Pedro Kourí". Epidemic neuropathy: brief epidemiological summary. En: Ministry of Public Health. Epidemiological bulletin. Edición Especial. Havana: Ministry of Public Health, june 4, 1993:1-8.
2. Cuba. Ministery of Public Health. Epidemic Neuropathy Cuba 1991-1994. MMWR 1994; 43:183-9.
3. Más Lago P, Pelegrino JL, Guzmán MG, Capó V, Rodríguez L, Rodríguez P, et al. Neuropatía epidémica cubana: parte I: aislamiento viral. Rev Cubana Med Trop 1995;47(1):11-15.
4. Reed LJ, Muench J. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg 1938;27:493-7.
5. Kono R. Introductory review of subacute myelo-optico-neuropathy (SMON) and its studies done by the SMON research commission. Jpn J Med Sci Biol 1975;28:1-21.
6. Melnick J, Wang S, Seidel E, Muchinik G, Zhang L, Lanford R. Characterization of IM virus, which is frequently isolated from cerebrospinal fluid of patients with multiple sclerosis and other chronic diseases of the central nervous system. J Virol 1984;52: 739-44.
7. Inoue Y. Inoue-Melnick virus and associated diseases in man: recent advances. Prog Med Virol 1991;38:167-79.
8. Melnick JL. Enterovirus: polioviruses, Coxsackieviruses, Echoviruses and newer enteroviruses. En: Fields BN, Knipe DM, eds. Virology. 2 ed. New York: Raven, 1990:549-605.
9. Más P, Guzmán MG, Muné M, Resik S, Alvarez M. Neuropatía epidémica cubana: parte II: algunas características antigénicas de los aislamientos virales. Rev Cubana Med Trop 1995; 47(1):16-20.

Recibido: 19 de diciembre de 1994. Aprobado: 13 de febrero de 1995.

Dra. María G. Guzmán. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.