Revista Cubana de Medicina Tropical, enero-junio, 1995

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Comparación de los resultados obtenidos en la serología de IgM y la neutralización anti-Coxsackie A9 (cepa 47) en casos de neuropatía epidémica y sus contactos

Dra. MARIA DE LOS ANGELES RIBAS,<1 Dr. PEDRO MAS,<2 Dra. LICEL RODRIGUEZ,1 y Dr. ANGEL BALMASEDA1

RESUMEN

Se estudió un total de 213 monosueros de pacientes con el diagnóstico de neuropatía epidémica y sus contactos, por las técnicas de inmunofluorescencia indirecta y neutralización, con el fin de demostrar la presencia de anticuerpos IgM y neutralizantes en los sueros frente a la cepa 47 IPK/93 identificada como Coxsackie A9. La edad promedio de estos pacientes osciló entre 20 y 50 años y la positividad a ambas técnicas no predominó en un sexo determinado. No hubo diferencia significativa en los resultados obtenidos entre pacientes y contactos en las técnicas empleadas.

Palabras clave: NEURITIS OPTICA/líquido cefalorraquídeo; NEURITIS OPTICA/sangre; NEURITIS/líquido cefalorraquídeo; NEURITIS/sangre; IGM/análisis; TECNICA DEL ANTICUERPO FLUORESCENTE.

INTRODUCCION

La neuropatía epidémica se presenta en Cuba en el segundo semestre de 1991, se extiende hasta el año 1992 y principios de 1993, comienza en la provincia de Pinar del Río y se disemina luego al resto de las provincias del país.1

En el transcurso de la epidemia se observaron diferentes manifestaciones clínicas, dadas, en sus inicios, por una forma predominantemente óptica, caracterizada por disminución de la agudeza visual, visión borrosa, hipersensibilidad a la luz y en el examen oftalmológico se encontró disminución o pérdida de la visión de colores fundamentalmente al eje rojo-verde, escotoma simétrico central o cecocentral, edema papilar y otras. Posteriormente estos pacientes comenzaron a presentar signos y síntomas propios de afecciones del sistema nervioso periférico dados por parestesias, dolor en miembros inferiores, pérdida de la sensibilidad y otros síntomas. Tres formas clínicas fueron observadas durante la epidemia, una predominante mente óptica, otra periférica y la combinación de ambas.2

La patogenia de la enfermedad ha sido asociada a factores tóxico-nutricionales y biológicos. Aún no se ha llegado a la conclusión de cuál de estos factores puede ser el agente causal, pero la posibilidad de uno de naturaleza infecciosa asociado con otros factores no ha sido completa mente descartada.

En el Laboratorio de Virología del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", tratando de encontrar un agente viral relacionado con esta afección, se aisló en células de riñón de mono verde (VERO) inoculadas con líquido cefalorraquídeo de un paciente con neuropatía, un virus, el cual fue designado como cepa 47/93 IPK.2

Esta cepa, identificada posteriormente como Coxsackie A9, fue la empleada en nuestro trabajo para realizar las técnicas de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y neutralización a sueros de pacientes y sus contactos, con el fin de determinar la presencia de anticuerpos IgM y neutralizantes a este virus.

MATERIAL Y METODO

Para realizar este estudio se empleó un total de 213 sueros, de los cuales 174 monosueros pertenecían a pacientes con el diagnóstico de neuropatía epidémica y 39 a sus contactos, procedentes de diferentes provincias del país. Estos sueros fueron almacenados a -20 oC hasta su uso.

TECNICAS

Inmunofluorescencia indirecta (IFI).3Para realizar esta técnica se emplearon células VERO inoculadas con Coxsackie A9 (cepa 47/93 IPK) y células VERO no infectadas. Cuando las células inoculadas mostraron efecto citopatogénico (ECP) característico, entre el 50 y el 75 %, las 2 clases de células se fijaron con acetona en láminas propias para esta técnica. Estas láminas fueron bloqueadas con albúmina bovina (BSA) al 1 % durante 30 min a temperatura ambiente.

Pasado este tiempo se lavaron una vez rápida mente con tampón fosfato (PBS). Los sueros fueron tratados en proporción volumen/volumen con absorbente de factor reumatoideo (IgG humana cadena gamma específica, producida en el IPK) para eliminar falsos positivos y diluidos 1:10 en PBS. Posteriormente fueron distribuidos en las láminas a razón de 10 mL por pocillo e incubados 3 horas a 37 oC en atmósfera húmeda.

Se realizaron lavados sucesivos con PBS, y se adicionó el conjugado anti-IgM humano con azul de Evans 10 mL por pocillo y se incubó durante 30 min a 37 oC.

Se volvieron a realizar lavados sucesivos con PBS y posteriormente se añadió glicerina al 1 %, se colocó el cubreobjeto y se observó en el microscopio de fluorescencia.

Se consideró una muestra positiva (criterio de positividad) aquélla que presentara fluorescencia citoplasmática específica en las células infectadas y la ausencia de ésta en las células VERO control.

Neutralización.4 Se inocularon células VERO con la cepa 47/93 IPK. Posteriormente se realizó la titulación del virus por el método de Reed y Muench. Los sueros fueron diluidos desde 1:10 hasta 1:320. Añadimos las 100 TCID50 del virus a los sueros y se pusieron en contacto durante 4 horas a 37 oC.

Luego añadimos la suspensión de células VERO a la concentración de 150 000-200 000 células/mL. Las placas fueron mantenidas a 37 oC en atmósfera de CO2. Se observaron diariamente al microscopio óptico hasta la lectura final (por ECP al 4to. o 5to. día).

RESULTADOS Y DISCUSION

En trabajos llevados a cabo en Japón5-7 se realizó el diagnóstico de una epidemia de neuropatía mielo-óptica subaguda (SMON), la cual fue asociada al uso de un medicamento (Clioquinol), además en esta epidemia se pudieron aislar varios virus, cuyo papel en ésta no pudo ser esclarecido.

Al surgir la epidemia de neuropatía epidémica en Cuba, hizo recordar el SMON de Japón, ya que presentaban características clínicas y epidemiológicas similares, salvo algunas excepciones.

A partir del aislamiento obtenido del líquido cefalorraquídeo de un paciente con neuropatía epidémica (cepa 47/93 IPK), comenzamos a realizar este estudio con el objetivo de poder observar la presencia de anticuerpos específicos a este virus y su relación con los casos de neuritis.

Se estudió un total de 213 monosueros pertenecientes a 174 pacientes con el diagnóstico de neuropatía epidémica y 39 de sus contactos.

Pudimos encontrar (tabla 1) que tanto en pacientes como en contactos, el mayor porcentaje de muestras estudiadas correspondió al sexo femenino, observándose el 53,4 % de este sexo en pacientes y el 56,4 % en contactos.

En cuanto a edad, en ambos grupos el intervalo osciló entre 20 y 50 años, dato que se relaciona con los estudios epidemiológicos realizados, donde se planteó que el mayor número de casos en esta epidemia correspondió al grupo de 25 a 64 años.1

Se realizó la determinación de IgM por IFI y la neutralización al 100 % de los casos estudiados (tabla 2). Los resultados de la IFI nos muestran que 93 (53,4 %) de los pacientes y 22 (56,4 %) de los contactos resultaron positivos a la IgM, la diferencia no es estadísticamente significativa (p 0,05).

En la neutralización tampoco la diferencia fue significativa, ya que 147 (84,4 %) de los pacientes y 31 (79,4 %) de los contactos fueron positivos por esta técnica (p 0,05). Estos datos coinciden con los estudios realizados por Más Lago,8 donde el 86,6 % de los pacientes y el 83,7 % de los contactos presentaron títulos de anticuerpos neutralizantes a la cepa 47/93 IPK. En la IFI, hay un porcentaje similar de los resultados positivos en los 2 grupos analizados (53,4 y 56,4 %). En la neutralización, la positividad también es igual en ambos grupos estudiados (84,4 y 79,4 %). Al comparar los resultados obtenidos por ambas técnicas en los 2 grupos de muestras estudiados, observamos una diferencia significa tiva en el número de casos con resultados positivos (p < 0,01). En la neutralización, en relación con los pacientes, el número de muestras con presencia de anticuerpos (84,4 %) fue mayor que el número de pacientes con anticuerpos de la clase IgM por IFI (53,4 %), mientras que en los contactos el número de muestras positivas por neutralización fue del 79,4 % y por IFI fue del 56,4 %.

Wulff et al. en el estudio de un brote de conjuntivitis hemorrágica por Enterovirus 70 en el Brasil, encontraron el 55 % de positividad a la IgM en sueros de convalescientes utilizando un ELISA de captura, y el 69 % de los sueros pares mostraron aumento de 4 veces o más el título de anticuerpos neutralizantes;9 Kono et al. en un estudio serológico de esta misma enfermedad, obtuvieron del 65 al 90 % de aumento de 4 veces o más el título de anticuerpos neutralizantes.10

Mediante un ELISA de captura de IgM, empleando una combinación de 9 antígenos de Enterovirus, en sueros de fase aguda y convales ciente de individuos infectados, Samuelson et al. encontraron una positividad en el 75 % de los casos, y demostraron además gran variabilidad en la cinética de la respuesta de IgM.11

Nuestros resultados se corresponden con los hallazgos de otros autores que coinciden en que, en el caso de los Enterovirus, la respuesta de los anticuerpos neutralizantes es más duradera y más específica y que, por el contrario, la respuesta de la IgM es transitoria y menos específica (reacción cruzada con otros serotipos).11-13

La no diferencia significativa de los resultados por IFI y neutralización entre pacientes y contactos puede haber sido debida al desconocimiento que aún se mantiene del período de incubación de la enfermedad, a la posible exposición de estos contactos a la cepa viral aislada y en general a la experiencia previa de la población con antígenos similares o relacionados, que en nuestro país es elevada, debida a la amplia circulación de Enterovirus.

Es conocido además, la reactividad a antígenos enterovirales en sueros de pacientes con signos clínicos de hepatitis A, Epstein Barr y Citomegalo virus, en estos 2 últimos casos por estimulación policlonal de la síntesis de la IgM viral específica.14

Podemos concluir que el alto tanto por ciento de pacientes con neuropatía epidémica que presentaron anticuerpos IgM y neutralizantes al Coxsackie A9 (cepa 47/93 IPK), aislada en el laboratorio durante la epidemia, así como sus contactos, se debe a la circulación de dicho virus en este período, así como a la ocurrencia de infección subclínica en el caso de los contactos.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la UNESCO el financiamiento de parte de esta investigación (Contrato No. 883579.3).

<1Especialista de I Grado en Microbiología. Investigador Agregado.
<2Doctor en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Microbiología. Investigador Titular.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Llanos GC, Aschor D, Brown DC. Epidemic neuropathy in Cuba. Epidemiological Bulletin 1993;14:1-4.
2. Más Lago P. Resultados preliminares de laboratorio virológico en estudio de casos de neuropatía epidémica en Cuba. Bol Epidemiol IPK 1993;1:7.
3. Knapp W, Holubar K, Wick G, eds. Immunofluorescence and related staining techniques. Workshop report on Microbiology and Parasitology. Amsterdam: Elsevier 1978:299-308.
4. The standard procedure for determining immunity to poliovirus using the microneutralization test. WHO/EPI/GEN. 9;1993.
5. Sohue I, Ando K, Lida M. Myeloneuropathy with abdominal disorders in Japan. A clinical study of 752 cases. Neurology 1971;21:168-73.
6. Inoue YK, Nishide Y, Nakamura Y. Virus associated with SMON in Japan. Lancet 1971; 1:853-4.
7. Nakamura Y, Inoue YK. Pathogenicity of virus associated with subacute myelo-optico neuropathy. Lancet 1972;1:223-6.
8. Más Lago P, Balmaseda A, Avalos I, Castillo A, Guzmán MG, Llop A, et al. Neuropatía epidémica cubana: parte III: anticuerpos neutralizantes a cepas aisladas y otros enterovirus en pacientes y personas sanas. Rev Cubana Med Trop 1995;47(1):21-25.
9. Wulff H, Anderson LJ, Pallansch MA, Piza de Souza Carvalho R. Diagnosis of Enterovirus 70 by demonstration of IgM antibodies. J Med Virol 1987;21:321-7.
10. Komo R, Miyamura K, Tajin E, Sasagawa A, Phvapradit P, Roongwithu N, et al. Virological and serological studies of neurological complications of acute hemorrhagic conjunctivitis in Thailand. J Infect Dis 1977;135:706-13.
11. Samuelson A, Skoog E, Forsgren M. Aspects on the serodiagno sis of enterovirus infections by ELISA. Serodiag Immunother Infect Dis 1990; 4:395-406.
12. Waldamn EA, Takimoto S, Ishida MA. Enterovirus 70 na regiao metropolitana de Sao Paulo, Brasil, de 1984 a 1987: aspectos da infeccao em periodos epidemico e endemico. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1990;32(3):221-8.
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14. Morgan-Capner P, Tedder RS, Mace JE. Rubella-specific IgM reactivity in sera from cases of infectious mononucleosis. J Hyg 1983;90:407-13.

Recibido: 2 de octubre de 1994. Aprobado: 10 de enero de 1995.

Dra. María de los Angeles Ribas. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.