Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Ensayo inmunoenzimático para la detección de anticuerpos monoclonales contra las proteínas E y NS1 del virus dengue

Lic. SUSANA VAZQUEZ,¹ Lic. MARITZA PUPO,² Lic. JOSE LUIS PELEGRINO,³ Lic. LUIS MORIER,⁴ Lic. AIDA CASTILLO,⁵ Lic. ANSELMO OTERO⁶ y Dra. MARIA GUADALUPE GUZMAN⁷

RESUMEN

Se estandarizó un ELISA para la detección de anticuerpos monoclonales a las proteínas E y NS1 del virus dengue. Se aplicó un ELISA indirecto utilizando como fuente de antígeno células C6/36 inoculadas con la cepa A-15 aislada durante la epidemia de dengue 2 en 1981. Estas células fueron fijadas en placas ELISA a una concentración de 200 000 células/pozo. Se utilizó un control celular en condiciones similares. Para normalizar el sistema se emplearon anticuerpos monoclonales específicos a ambas proteínas. Se realizaron estudios a diferentes tiempos de incubación para determinar el momento de mayor expresión de estas proteínas en la membrana celular. Los resultados muestran una respuesta máxima a las 72 horas posinoculación para ambas proteínas, se obtuvo una sensibilidad para la detección de NS1 de 14,7 ng/mL y para la E de 1,43 ng/mL. Este sistema permite el tamizaje primario de anticuerpos monoclonales a las proteínas E y NS1 del virus dengue 2.

Palabras clave: ELISA/normas; ANTICUERPOS MONOCLONALES/aislamiento y purificación; DENGUE; AEDES.

INTRODUCCION

La Familia Flaviviridae está constituida aproximadamente por 70 virus serológicamente relacionados. Muchos de estos miembros son los agentes causales de una variedad de enfermedades en el humano como la fiebre del dengue, la fiebre amarilla, la encefalitis japonesa y la encefalitis transmitida por garrapata.1

El dengue, como todos los flavivirus está constituido por 3 proteínas estructurales, y su RNA también codifica 7 no estructurales. Entre ellas, la E (proteína estructural) y la NS1 (no estructural) son los mejores "candidatos" para la elaboración de una vacuna, por la implicación que puedan tener en la respuesta inmuno-protectora antiviral.2-4

Se ha realizado un gran número de estudios dirigidos a profundizar los conocimientos acerca de estas proteínas. Dentro de ellos existe particular interés en los anticuerpos monoclonales (AcM), los cuales han servido como una poderosa herramienta para la identificación de epítopes antigénicos inmunodominantes y en la localización física de éstos.5,6

Para la selección de los AcM deseados se han desarrollado diferentes métodos, entre los cuales se encuentran los ensayos inmunoenzimáticos, muy utilizados por su sensibilidad, rapidez y facilidad de ejecución, lo que permite la evaluación de un gran número de muestras al mismo tiempo.

El objetivo del presente trabajo es normalizar un sistema inmunoenzimático útil para el tamizaje primario de anticuerpos monoclonales contra las proteínas E y NS1 del virus dengue 2, utilizando como fuente de antígeno células de mosquito (C6/36).

MATERIAL Y METODO

Antígeno. Se inocularon células de mosquito C6/36 (Aedes albopictus) con monocapa con fluente, con la cepa A-15 de dengue 27 para una multiplicidad de 1. Se dejaron en contacto por 1 hora a 28 oC. Fue incluido en la prueba el control de células sin inocular.

Anticuerpos monoclonales. Se utilizaron el AcM anti-NS1 (9G5) concentración 5 mg/mL, donado gentilmente por el doctor Schelesinger del Hospital National de Rochester, New York; y el AcM Anti-E de complejo dengue (H3-6-G5- -G1) concentración 0,98 mg/mL, obtenido en el Laboratorio de Monoclonales del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK).8 Se incluyó ascitis normal como control negativo.

ELISA. Las células con 24, 48 y 72 horas posinoculación fueron desprendidas suave mente y lavadas 3 veces con PBS. Se prepa- ró una suspensión de 200 000 células/pozo. Se agregó glutaraldehído para una concentración final de 0,025 %. Se dejó en contacto 15 minutos a temperatura ambiente y se lavaron las placas 3 veces con PBS. Se bloquearon con albúmina bovina al 1 % en PBS y se incubaron 1 hora a 37 oC. Se eliminó el contenido y se dejaron secar. La misma metodología se siguió con el control celular.

Los AcM fueron diluidos en PBS en diluciones al doble a partir de 1:100, se agrega ron 100 mL por pozo de cada dilución tanto a las células infectadas como sin infectar, se dejaron 2 horas a 37 oC en cámara humeda. Posteriormente se lavaron 3 veces y se agregó el conjugado anti-ratón peroxidasa (Sigma) diluido 1:1 000 en PBS con 10 % de suero de ternera fetal, se dejó en incubación 1 hora a 37 oC. Se lavó 3 veces y se añadió el sustrato (tampón fosfato-citrato, ortofenilendiamina y peróxido de hidrógeno). Se mantuvo la reacción durante 30 minutos en la oscuridad, y se detuvo con ácido sulfúrico al 12,5 %. La lectura se efectuó en un lector de microplacas (Multiskan) a una longitud de onda de 492 nm.

Análisis estadístico. La diferencia entre las densidades ópticas (DO) entre las células infectadas y no infectadas (control celular) fueron determinadas para cada dilución de los AcMs y el control negativo.

La sensibilidad del sistema para cada AcM, en términos de cantidad mínima detectable, fue calculada por interpolación en una curva de regresión de los logaritmos de la DO contra los logaritmos de la concentración. El criterio de sensibilidad fue el valor del control negativo más 2 veces la desviación típica.

La repetibilidad y la reproducibilidad se calcularon mediante el análisis de varianza de clasificación simple, reportando el coeficiente de variación (CV) a partir del cuadrado medio del error (paquete estadístico, Facultad de Biología, Universidad de La Habana).

RESULTADOS CURVAS DE TITULACION DE LOS AcMs A DIFERENTES TIEMPOS DE INCUBACION DEL VIRUS

En las figuras 1 y 2 se muestran los resulta dos obtenidos a las 24, 48 y 72 horas posinoculación para el AcM anti-NS1 y para el anti-E. Como se observa, los valores mayores de DO fueron obtenidos a las 72 horas posinoculación. No se consideraron en el estudio tiempos posinoculación mayores de 72 horas, pues el efecto citopático se observó en más del 50 % de las células. Los valores del control negativo para cada tiempo mostraron el mismo comportamiento reflejado en una curva única.

SENSIBILIDAD DEL ELISA

En las figuras 3 y 4 se presenta la sensibili dad del ELISA para cada monoclonal. Para el anti-NS1 fue de 14,7 ng/mL, para el anti-E fue de 1,43 ng/mL. Se obtuvo una r2 en cada caso de 0,98.

Los CVs obtenidos intraplaca (repetibi- lidad) oscilaron entre 6 y 7 % en el ELISA para AcMs anti-E, y entre 7 y 8 para anti-NS1. El CV obtenido en el análisis interplaca (reproducibilidad) fue de 11,85 % para el AcM anti-E y de 16,12 para el anti-NS1.

DISCUSION

La obtención de AcMs de una deseada especificidad, depende principalmente de la eficiencia de la prueba de tamizaje usada para identificar los hibridomas entre un gran número de clones originalmente producidos en una fusión celular.

En la producción de AcMs antivirus los ELISAs son comúnmente usados como una prueba de tamizaje primario. Entre ellos, el indirecto es uno de los más utilizados emplean do células fijadas covalentemente a la placa antes de ser probadas con los anticuerpos.

Algunas de las principales ventajas de este sistema son: la habilidad para probar un gran número de muestras bajo idénticas condiciones, su alta sensibilidad y la estabilidad de la monocapa de células fijadas.9

En este estudio se utilizó la línea celular de mosquito C6/36, por ser una de las más amplia mente usadas debido a su alta susceptibilidad a la replicación del virus y por haberse demostrado la presencia de ambas proteínas en áreas localizadas de la superficie celular.10

Para la normalización del sistema era preciso conocer el momento de mayor expresión de ambas proteínas en la membrana celular, lo cual nos permitiría establecer las condiciones óptimas para la prueba. Con este fin se utiliza ron diferentes tiempos posinoculación. Estos correspondieron a 24, 48 y 72 horas; no se pudo obtener valores mayores de 72 horas por observar un efecto citopático mayor o igual que el 50 %.

Ng y Corner en 1989, realizaron un estudio con anticuerpos a las proteínas E y NS1 del virus dengue 2 marcados con oro coloidal, con el objetivo de obtener la distribución de estas proteínas en células de mosquito infectadas (C6/36). La inmunomicroscopia electrónica demostró presencia de partículas de oro en la superficie celular a las 32 horas posinoculación.

En nuestro estudio, a partir de las 48 horas posinoculación, los valores de DO comenzaron a ser significativos para ambas proteínas y se obtuvieron los máximos valores a las 72 horas. Estos resultados pudieran explicarse por la alta multiplicidad utilizada. Algunos autores plantean que al usar una alta multiplicidad de infección, el título más alto del virus es usual mente obtenido entre los días tercero y sexto posinfección, en dependencia de la combinación virus-hospedero.11

Por otro lado, los resultados siempre fueron superiores para la proteína E que para la NS1, lo que puede ser debido a que, si el modo de salida más frecuente del dengue 2 es por gemación a través de la membrana plasmática, entonces es de esperar que la proteína E sea la más abundante insertada en la membrana.10

Uno de los aspectos más importantes que se han señalado en los sistemas ELISA para su uso en el tamizaje primario de AcM es la búsqueda de una alta sensibilidad.

Hunter y Bosworth en 1986,12 obtuvieron un promedio de concentración de AcMs en cultivo de hibridomas de aproximadamente 1 mg/mL. En un estudio realizado por Fleming y Pen en 1988,13 utilizando un ELISA de captura de IgG, se detectaron, en el sobrenadante de cultivo, concentraciones en el rango de 1 a 20 ng/mL.

Los resultados obtenidos en nuestro ELISA, en cuanto a la sensibilidad, están acordes con los obtenidos por Fleming (1988), son lo suficientemente sensibles como para favorecer la detección de los AcMs.

Este sistema puede ser aplicado en el tamizaje primario de AcMs contra el virus dengue 2. Pudiera ser posible además el empleo de esta tecnología para el resto de los serotipos de este virus. Es de señalar que otras proteínas del virus pudieran ser detectadas si se usa el adecuado AcM como control, como es el caso de la NS3.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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10. Ng ML, Corner LC. Detection of some dengue-2 virus antigens in infected cells using immuno-microscopy. Arch Virol 1989;104:197-208.
11. Schlesinger RW. Dengue Viruses. Wien: Springer, 1977 (Virology Monographs; 16).
12. Hunter KW, Bosworth JM. Measurement of monoclonal immunoglobulin concentrations in hybridoma cultures by competitive inhibition enzyme immunoassay. Methods Enzymol 1986;121:7-10.
13. Fleming JO, Pen LB. Measurement of the concentration of murine IgG monoclonal antibody in hybridoma supernatans and reliable enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). J Immunol Methods 1988;110:11-8.

Recibido: 25 de octubre de 1994. Aprobado: 10 de abril de 1995.

Lic. Susana Vázquez. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.

¹Investigadora Auxiliar. Laboratorio de Arbovirus. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK).
²Investigadora Agregada. Laboratorio de Monoclonales. IPK.
³Investigador Agregado. Laboratorio de Arbovirus. IPK.
⁴Investigador Auxiliar. Laboratorio de Cultivo Celular. IPK.
⁵Investigadora Agregada. Laboratorio de Cultivo Celular. IPK.
⁶Investigador Titular, PhD. Jefe del Laboratorio de Monoclonales. IPK.
⁷Investigadora Titular, PhD. Jefa del Departamento de Virología. IPK.