Universidad de La Habana. Facultad de Biología

Inactivación in vitro del Ags HB por extractos de plantas del género Phyllanthus

Lic. GLORIA DEL BARRIO ALONSO,¹ Lic. OMELIO CABALLERO PÉREZ² y Lic. PABLO CHEVALIER³

RESUMEN

Se estudiaron 3 especies del género Phyllanthus procedentes de la zona oriental de Cuba con el fin de determinar la capacidad inactivante del antígeno de superficie (Ags HB) del virus hepatitis B in vitro . Para ello se prepararon extractos alcohólicos de cada especie y de diferentes partes de dichas plantas, con las cuales se trataron sueros de pacientes positivos al Ags HB. Los resultados demuestran que las especies estudiadas poseen la propiedad de inactivar dicho antígeno entre el 93 y el 97 % de los sueros ensayados. El análisis de la capacidad de inactivación de las 3 partes del Phyllanthus chamaecristoides reveló una mayor actividad en los extractos de tallos (97 %), con un comportamiento similar en las 2 temperaturas de incubación utilizadas. Se observa presencia de flavonoides en el extracto de esta especie.

Palabras clave: PLANTAS MEDICINALES; ANTIGENOS DE SUPERFICIE/aislamiento y purificación.

INTRODUCCION

Las infecciones causadas por el virus de la hepatitis B (VHB) representan un importante problema de salud mundial,1,2 por lo que las investigaciones en el campo de los agentes antivirales muestran un interés actual, en particular los estudios de productos naturales de origen vegetal.

En la práctica médica tradicional se han utilizado para el tratamiento de las ictericias y otras enfermedades.3,4

Los estudios realizados con Phyllanthus niruri Linn demuestran la propiedad de inactivación del Ags HB del VHB.5 Esta misma especie es capaz de inhibir la DNA polimerasa endógena del VHB y del virus de la hepatitis B de la marmota.6

En el presente trabajo se evalúa la capacidad inactivante del Ags HB mediante ensayos in vitro, por 3 especies de Phyllanthus procedentes de la zona oriental de Cuba.

MATERIAL Y METODO

Preparación de los extractos. Se prepararon extractos alcohólicos a partir de diferentes partes de las plantas cuyas especies fueron: Phyllanthus chamaecristoides, Phyllanthus formosus y Phyllanthus microdictyus.

El procedimiento de extracción se realizó durante 24 horas a temperatura ambiente.7 Posteriormente se filtró y concentró en rotoevaporador. Cada muestra se liofilizó en bulbos de 4 mL.

Inactivación in vitro. Teniendo en cuenta la especie y la parte de la planta sometida a ensayo, los extractos obtenidos: tallo (P. chamaecristoides), raíz y tallo (P. formosus) y raíz y hojas (P. microdictyus), se evaluaron frente a 30 sueros humanos positivos al Ags HB procedentes del Centro Provincial de Higiene y Epidemiología de Ciudad de La Habana, según el método de Thyagarajan et al .4 para lo cual cada muestra de Phyllanthus se mezcló con un volumen igual de suero Ags HB positivo y se incubó a 36 oC durante 48 horas.

En la evaluación de los extractos obtenidos a partir del tallo, raíz y hojas de P. chamaecristoides se utilizaron 30 sueros humanos positivos al Ags HB procedentes del Instituto de Gastroenterología de Ciudad de La Habana, teniendo en cuenta a su vez la acción de 2 temperaturas: 36 oC y temperatura ambiente (28-30 oC) durante el proceso de incubación.

En todos los ensayos se emplearon controles, consistentes en la mezcla de iguales volúmenes de suero Ags HB positivo y PBS, que se incubaron por el tiempo y temperatura antes señaladas.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación se procedió a la detección del Ags HB presente en las diferentes muestras mediante la técnica ELISA tipo sandwich, para lo cual se utilizaron estuches diagnósticos de la Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay".

Lectura. La reacción inactivante se expresa como el decrecimiento en la absorbancia de la muestra con respecto al control, se consideraron negativos aquellos valores que tras el tratamiento están por debajo del valor de densidad óptica (DO) límite establecido.

Ensayo estadístico. Los resultados se pro- cesaron empleando la prueba estadística chi-cuadrado.

Ensayo fitoquímico y cromatográfico preliminar. Con el extracto procedente de P. chamae cristoides se procedió a realizar el ensayo de Shinoda, cuyo resultado fue corroborado mediante cromatografía en placa delgada de sílica gel. Una vez aplicada la muestra, las placas se corrieron en el sistema de solvente polar: cloroformo-metanol-agua (35:15:2,5 mL) en una cámara cromatográfica, ésta fue revelada con iodo y vainillina-HCLO4 al 1 %, como segundo revelador.

RESULTADOS

Los resultados del experimento de inactivación in vitro del Ags HB por los extractos procedentes de las 3 especies en estudio se aprecian en la tabla, donde se representan los valores de DO obtenidos para cada muestra ensayada. TABLA. Inactivacion in vitro del AgHBs por extracto de Phyllanthus

	Valores de DO (492 nm)
	Phyllanthus chamaecristroides	Phyllanthus formosus	Phyllanthus formosus	Phyllanthus microdictyus	Phyllanthus microdictyus
Control	(tallo)	(tallo)	(raiz)	(hoja)	(raiz)
0,655	0,111	0,099	0,102	0,100	0,100
1,281	0,093	0,098	0,097	0,092	0,111
0,748	0,108	0,110	0,096	0,099	0,097
1,190	0,092	0,109	0,094	0,101	0,102
1,348	0,133	0,102	0,106	0,095	0,091
0,627	0,163	0,147	0,108	0,128	0,133
0,893	0,092	0,090	0,093	0,100	0,137
1,269	0,102	0,101	0,096	0,094	0,097
0,847	0,083	0,091	0,088	0,086	0,086
0,739	0,116	0,083	0,082	0,087	0,112
0,278	0,087	0,117	0,091	0,148	0,089
0,433	0,091	0,091	0,095	0,080	0,085
0,491	0,084	0,093	0,086	0,086	0,088
0,543	0,098	0,087	0,088	0,088	0,088
0,659	0,085	0,101	0,097	0,091	0,100
0,572	0,102	0,094	0,098	0,100	0,091
0,652	0,100	0,093	0,097	0,104	0,098
1,574	0,099	0,111	0,145	0,094	0,113
1,023	0,096	0,111	0,106	0,102	0,157
1,470	0,100	0,108	0,099	0,100	0,105
1,281	0,093	0,109	0,099	0,098	0,105
0,242	0,106	0,102	0,101	0,100	0,108
0,501	0,089	0,097	0,099	0,097	0,095
0,201	0,102	0,089	0,099	0,091	0,109
0,788	0,101	0,092	0,093	0,097	0,096
1,750	0,105	0,103	0,103	0,096	0,108
0,724	0,099	0,107	0,109	0,105	0,105
1,343	0,100	0,109	0,102	0,107	-
1,173	0,104	0,101	0,111	0,103	0,111
0,781	0,099	0,096	0,095	0,096	0,102

 

En todos los casos se evidencia una disminución de los valores de DO, y es estadísticamente significativo (p < 0,01) el número de sueros que se convierten en negativos para las 3 especies. En la figura 1 se representan los porcentajes de sueros que se convierten en negativos tras los tratamientos con cada especie y parte de la planta estudiada.

Los sueros positivos tratados con los extractos de las 3 partes de P. chamaecristoides mostraron una disminución de los valores de DO, independientemente de la temperatura de incubación utilizada. Los resultados obtenidos en la inactivación in vitro con los extractos de cada una de las partes de dicha especie se observan en la figura 2.

El ensayo de la reacción de Shinoda resultó positivo, lo que permite afirmar la presencia de flavonoides. El ensayo cromatográfico preliminar mostró 2 manchas en el revelado con iodo y 4 en el revelado con vainillina, lo cual corrobora la presencia de flavonoides.

DISCUSION

Diversos estudios sobre las propiedades antivirales de extractos de P. niruri Linn (más tarde clasificada como Phyllanthus amarus ) han sido descritos por distintos autores.4,5,8 Thyagarajan et al. 5 demostraron que extractos obtenidos a partir del sistema radicular y del tallo de esta especie eran capaces de inactivar el Ags HB, evaluando ello por la contrainmunoelectroforesis y hemaglutinación reverso-pasivo (RPHA). Mehrotra et al.8 utilizando la técnica ELISA evaluaron los efectos in vitro sobre los Ags HB, Age HB y el ADN del VHB, y tuvieron resultados positivos frente a éstos, Por otra parte, Shead9 al utilizar el virus de la hepatitis B del pato en su hospedero específico, mostró que extractos provenientes de 5 especies de Phyllanthus existentes en Australia, inhibían la ADN polimerasa de dichos virus.

En el presente trabajo se demuestra que las especies P. chamaecristoides, P. formosus y P. microdictyus, endémicas de Cuba, poseen la propiedad de inactivar el Ags HB del virus de la hepatitis B, al lograr disminuir dicho antígeno en el 100 % de los sueros estudiados, así como valores de seronegatividad altamente significati vos (93-97 %).

Dadas las características de la especie P. chamaecristoides y a su más fácil o asequible colecta, ésta se utilizó para evaluar los extractos provenientes de cada una de sus partes, se demostró que el extracto procedente del tallo presenta el mayor efecto in vitro y resultó estadísticamente significativo (p < 0,01) al compararlo con el extracto de hojas. El extracto proveniente de raíz resultó igualmente activo, no existen diferencias significativas con respecto al tallo pero sí en relación con el extracto de hojas, quien mostró la menor actividad frente al antígeno.

Al emplear el procedimiento de inactivación a 2 temperaturas diferentes se evidencia un comportamiento semejante, no existen diferencias estadísticamente significativas.

Los resultados aquí obtenidos confirman la importancia que presenta este género para los estudios de propiedades antivirales y en especial frente al VHB.

La ulterior confirmación de estos resultados preliminares precisan ensayos frente a otros marcadores virales in vitro, así como ensayos in vivo con el virus de la hepatitis B de la marmota u otros sistemas establecidos.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. MMWR. Protection against viral hepatitis. 1990;39(RR-4).
2. Galbán E, Bravo JR, Castañeda C, Toledo G, González A, Delgado MG. Ensayo de campo de la vacuna recombinante cubana contra la hepatitis B (Heberbiovac HB): estudio en recién nacidos hijos de madres Ags HB+. Rev Cubana Med Trop 1992;44(2):149-57.
3. Roig y Mesa JT. Plantas medicinales aromáticas o venenosas en Cuba. La Habana: Ciencia y Técnica, 1974:85-8.
4. Thyagarajan SP. Antiviral substance against hepatitis B: a possibility. Proc Natl Symp HBV Infect 1986;Sec B:30-46.
5. Thyagarajan SP, Thiruneelakantan K, Subramian S, Sundara velu T. In vitro inactivation of HBs Ag by Eclipta alba Haask and Phyllanthus niruri Linn. Indian J Med Res 1982;76 (Suppl):124-30.
6. Venkateswaran PS, Millman I, Blumberg BS. Effects on an extract from Phyllanthus niruri on hepatitis B and Woodchuck hepatitis B viruses: in vitro and in vivo studies. Proc Natl Acad Sci USA, 1987;84:274-78.
7. Vanden Berghe DA, Vlichink AJ, Van Hoof I. Present status and prospects of plant products as antiviral agents. Adv Med Plant Research 1984;1:67-101.
8. Mehrotra R, Ramat S, Kulshreshtha DK, Goyal P, Panaik GK, Dhawan BN. In vitro effect of Phyllanthus amarus on hepatitis B virus. Indian J Med Res 1991;93:71-3.
9. Shead A. Effect of Phyllanthus plant extracts on duck hepatitis B virus in vitro. Antiviral Res 1992;18(2):127-38.

Recibido: 12 de septiembre de 1994. Aprobado: 9 de enero de 1995.

Lic. Gloria del Barrio Alonso. Universidad de La Habana. Facultad de Biología. Calle 25 entre J e I, Vedado, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba.

¹Maestra en Ciencias. Licenciada en Ciencias Biológicas. Profesora Titular. Facultad de Biología. Universidad de La Habana (UH).
²Licenciado en Ciencias Biológicas. Profesor Auxiliar. Facultad de Biología (UH).
³Licenciado en Química. Profesor Asistente. Instituto Superior Pedagógico de Camagüey.