Rev Cubana Med Trop 1996;48(1)

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Evaluación de un Dot ELISA para la detección de antígeno de Rotavirus

Dra. MARIA DE LOS ANGELES RIBAS ANTUNEZ,¹ Lic. DAYSI FERNANDEZ,² Téc. CARINA RODRIGUEZ,³ Téc. ILEANA TORAÑO³ y Téc. TAMARA PIMENTEL³

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¹ Especialista de I Grado en Microbiología. Investigadora Agregada. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"(IPK).
² Investigadora Agregada. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología.
³ Técnica en Procesos Biológicos. IPK.

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RESUMEN

Se realizó la evaluación de un Dot ELISA elaborado por el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, para la detección de antígeno de Rotavirus. Se analizaron 100 muestras de heces fecales por esta técnica y los resultados fueron comparados con los obtenidos con la electroforesis en gel de poliacrilamida, técnica tradicionalmente empleada en el diagnóstico de Rotavirus. Se obtuvo una alta coincidencia, especificidad y sensibilidad entre éstos.

Palabras clave: ROTAVIRUS; ELISA/métodos; ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA; HECES ANTIGENOS/análisis; ESTUDIOS DE EVALUACION.

INTRODUCCION

Los Rotavirus son virus ARN que pertenecen a la familia Reoviridae, se encuentran ampliamente distribuidos por el mundo y han sido considerados los agentes de mayor responsabilidad en la producción de las gastroenteritis infantiles de causa viral, que provocan el 50 % de las hospitalizaciones por diarreas agudas en niños menores de 4 años.1

El diagnóstico de laboratorio de estos virus está basado fundamentalmente en su detección en las heces fecales, se emplean variadas técnicas tales como son la microscopia electrónica, la contrainmunoelectroforesis, la inmunofluorescencia indirecta, la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), la aglutina ción por látex, el ELISA, la hibridación de ácidos nucleicos y otras.2,3

Entre estas técnicas se encuentra el Dot ELISA, descrito por Towbin et al. en 1979,4 quienes utilizaron por primera vez el método de inmunoblotting para transferir proteínas del ribosoma desde un gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa. Posteriormente las técnicas de inmunoblott han sido usadas para la detección de antígenos y anticuerpos a diferentes microorganismos, se emplean sistemas de amplificación como el marcaje del conjugado con oro coloidal para aumentar la sensibilidad del método.

Debido a la alta frecuencia de infección por Rotavitus, especialmente en la población infantil, y la necesidad de un diagnóstico rápido, el Laboratorio Nacional de Referencia de Rotavirus del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK) evaluó un Dot ELISA elaborado por el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB).

MATERIAL Y METODO

MUESTRAS
 
Se emplearon 100 muestras de heces fecales recibidas en el Laboratorio Nacional de Referencia de Rotavirus del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" durante el segundo semestre del año 1991 y primero del 1992, las cuales se mantuvieron almacenadas a -20 oC hasta su uso.
 
TECNICAS
 
Dot ELISA (CIGB). Se empleó como fase sólida una membrana de nitrocelulosa marcada con un anticuerpo monoclonal antiRotavirus (CIGB). Se pesaron 0,2 g de heces fecales y se diluyeron en 1 mL de tampón de dilución No. 1 para la muestra (PBS pH 8; BSA al 2 % Tween 20 0,05 %; NaN3 0,1 %). Se agitó en un vortex, centrifugándose posteriormente a 3 000 r.p.m. durante 10 min. Se tomó el sobre nadante y se pasó a un vial teniendo 250 mL de tampón No. 2 para dilución de muestra (PBS pH 8; BSA 2 %; Tween 20 0,05 %; NaN3 0,1 %; polietilenglicol 6 000 al 2 %). Se añadió a este vial 250 mL del conjugado constituido por un anticuerpo monoclonal marcado con oro; incubándose durante 5 minutos a temperatura ambiente.5 Se tomó 1 mL de la mezcla anterior y se depositó en un vial que contenía la tira reactiva de nitrocelulosa ya sensibilizada, se incubó con agitación durante 25 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se sumergió la tira 1 vez en PBS y se puso a secar sobre un papel de filtro. Se emplearon en esta prueba un control positivo y otro negativo. Se consideró la muestra como positiva al aparecer una mancha rojiza en la membrana de nitrocelulosa. Cuando la membrana quedó de color blanco, la muestra se consideró como negativa.

Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Se empleó la técnica descrita por Laemmli en 1970 con algunas modificaciones introducidas por Pereira et al. en 1983.6

RESULTADOS

Se realizó el estudio por Dot ELISA y electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de 100 muestras de heces fecales para la detección de antígeno de Rotavirus, de las cuales 68 (68 %) fueron positivas por ambas técnicas, 29 (29 %) fueron negativas y solamente 3 resultaron no coincidentes (positivas por PAGE y negativas por Dot ELISA). Se obtuvo al comparar las 2 técnicas una coincidencia del 97 %, una sensibilidad del 95,7 % y una especificidad del 10 % (tabla).
  TABLA. Comparación de resultados obtenidos por PAGE y Dot ELISA  

Dot	ELISA
+	—
+68	3
PAGE
-0	29

  Sensibilidad: 95,7 %. Coincidencia: 97 %. Especificidad: 100 %.

DISCUSION

Las gastroenteritis agudas producidas por Rotavirus son de gran importancia por su alta morbilidad y mortalidad, ya sean solas o asociadas a otro agente productor de diarreas,7 por ello los métodos de diagnóstico rápido en la atención primaria de salud, son muy importantes.

El Dot ELISA es un método muy sensible para la detección de antígeno que ha sido empleado exitosamente en el diagnóstico de múltiples virus. En estudios realizados por diferentes autores,8 se ha comparado con el ELISA y se ha comprobado la mayor sensibilidad de este ensayo dado por la mayor eficiencia en la unión del anticuerpo monoclonal a la membrana de nitrocelulosa que a la placa de microtitulación.

La presencia de los 3 resultados no coinci dentes se puede explicar por la existencia de proteasas en algunas muestras de heces fecales, las cuales pueden lisar a los anticuerpos utilizados en la captura o en el conjugado y evitar así la formación del complejo antígeno anticuerpo. También puede ser consecuencia de presentar las muestras un contenido viral escaso no detectado por el Dot ELISA pero sí por el PAGE.

La comparación de los resultados obtenidos por ambos métodos, demuestra que el Dot ELISA elaborado en el CIGB, es una buena alternativa para el diagnóstico de Rotavirus, ya que permite obtener resultados de una forma rápida y fácil, tiene poca complejidad técnica, es de fácil manipulación, emplea pocos reactivos y proporciona una información diagnóstica rápida, ya que los resultados se obtienen en un período de 30 minutos, lo cual resulta muy conveniente para el tratamiento de esta enfermedad.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Janda MJ, Duffey PS. Mesophilis Aeromonads in human disease: current taxonomy laboratory indentification and infections disease spectrum. Rev Infect Dis 1988;10:980-97.
2. Davis WA, Kane JG, Garagusi VF. Human Aeromonas infections: a review of the literature an a case report of endocarditis. Medicine 1978;57(3):367-277.
3. Gravenitz A von. Aeromonas y plesiomonas. En: Lennette EH, Balows A, Hausler WJ, Truan JP, eds. Manual de microbiología clínica. 3. ed. La Habana: Editorial Científico- Técnica, 1982;t 1:279-85.
4. Khardori N, Fainstein V. Aeromonas and plesiomonas as etiological agents. Rev Microbiol 1988;42:395-419.
5. Reina J, Pericas CN, Machado H, Blanco I, Alomar P. Gastroenteritis aguda por aeromonas mesófilas en pacientes pediátricos: consideraciones clínico-microbiológicas. Rev Esp Pediatr 1989;45(268):283-7.
6. Agger WA, Mc Cormial JD, Gruwith MJ. Clinical and microbiological features of Aeromonas hydrophila - associated diarrhoea. J Clin Microbiol 1985;21(6):909-13.
7. Grasey J. Burke V, Robinson J, Masters PL, Stewart J, Pearman J. Aeromonas spp in travellers'diarrhoea. Br Med J 1984;289:658.
8. Gelbart SM, Prabhudesai M, Magee SM. A case report: Aeromonas sobria gastroenteritis in an adult. Am J Clin Pathol 1985;83(3):389-91.
9. Roberts IM, Parenti DM, Albert MB. Aeromonas hydrophila- associated colitis in a male homosexual. Arch Intern Med 1987;147:1502-3.
10. Haake DA, Hewitt WL, Lance GW. Supurative thrombophebi tis due to Aeromonas. Diagn Microbiol Infect Dis 1988;10:57-60.

Recibido: 31 de enero de 1995. Aprobado: 11 de mayo de 1995.

Dr. Alejandro Vázquez Piloto. Hospital General Docente "Comandante Pinares". San Cristóbal, Pinar del Río, Cuba.