Rev Cubana Med Trop 1996;48(2)

Centro de Investigaciones Científicas de la Defensa Civil

Purificación de la proteína de 24 KD natural (P24) del virus de inmunodeficiencia humana tipo-1 (VIH-1) utilizando inmunoafinidad

Lic. RENE GRANA SANCHEZ, Dr. ELADIO SILVA, Lic. NANCY RUIZ y Lic. MARIA TERESA PEREZ¹

RESUMEN

En el seguimiento de las personas infectadas con el VIH-1 resulta de gran utilidad el empleo de sistemas para detectar la presencia de proteína de 24 KD y los niveles de anticuerpos a ésta; para el desarrollo de estos sistemas es necesario contar con esta proteína purificada. El presente trabajo describe la purificación de p24 a partir de lisado viral semipurificado sobre gradiente de sacarosa, empleando cromatografía de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales acoplados a Sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno. Para la caracterización del producto purificado se utilizó electroforesis en gel de poliacrilamida con tinción de plata e inmunoelectrotransferencia. Como resultado de este trabajo se obtuvo p24 útil para ser empleada en el desarrollo de medios diagnósticos y anticuerpos monoclonales.

Palabras clave: PROTEINA P24 DEL NUCLEO DEL VIH/aislamiento & purificación; HIV-1/aislamiento & purificación; CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD; ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA; ESTUDIOS DE SEGUIMIENTO.

INTRODUCCION

La p24, principal proteína de la nucleocápside del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1),² compone la membrana externa del núcleo del virus y está involucrada en la formación de las estructuras capsulares y el empaquetamiento del ARN del genoma viral.²

Los individuos infectados con el VIH-1, desarrollan una respuesta inmune contra todas las proteínas del virus, incluidos los productos de los genes regulatorios y estructurales. Esta respuesta se caracteriza por el desarrollo de diferentes patrones serológicos, relacionados con la progresión de la infección. La presencia de anticuerpos contra las proteínas de la envoltura gp41 y gp120 se mantiene a lo largo de toda la infección, mientras que hay una disminución de anticuerpos anti-p24, con antigenemia detectable,^3-5 debido a que, al incrementarse la producción viral, la p24 en aumento se acompleja con la anti-p24.^5,6 Este fenómeno ha sido utilizado como marcador de la progresión del VIH-1.⁴ Por otra parte, la posibilidad de detectar p24 en los primeros estadios de la infección y durante la enfermedad, es usado como método de rutina para monitorear la respuesta a la quimioterapia antiviral.^7,8

En el presente estudio nos propusimos purificar p24 con el objetivo de desarrollar medios diagnósticos (ELISA de captura de antígeno p24 y anticuerpos p24),^7,8 útiles para el seguimiento clínico y de la terapia antiviral en personas infectadas por el VIH.

MATERIAL Y METODO

Purificación de anticuerpos monoclonales anti-p24. Se emplearon anticuerpos monoclonales de la subclase IgG₂b que reaccionan contra la p24 del VIH-1 y que fueron suministrados por el laboratorio de anticuerpos monoclonales del LI-SIDA. Estos anticuerpos se purificaron a partir de líquido ascítico, por cromatografía de afinidad en proteína A Sefarosa CL-4B. A la columna estabilizada con solución tampón PBS pH 7,2-7,4; le fue aplicado el líquido ascítico diluido 1:2 en la misma solución, con un volumen final igual al de la resina. La elusión se realizó con solución tampón 0,1 M ácido cítrico pH 4,0. Las fracciones fueron colectadas y dializadas contra solución tampón 0,1 M NaHCO₃, 0,5 M NaCl pH 8,3.⁹

Acoplamiento de los anticuerpos monoclonales purificados. Los anticuerpos monoclonales anti-p24 fueron acoplados a Sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno (Pharmacia-LKB) según metodología descrita por el fabricante.¹⁰

Obtención del preparado viral. El antígeno se obtiene a partir de sobrenadante del día de máxima producción de cultivos de células CCRF-CEM infectadas con la cepa LAV-1 Bru y purificado por gradiente de sacarosa.

Purificación de la p24. El preparado viral fue pasado por la columna de anti-p24 acoplado a Sefarosa 4B activada con bromuro de cianóge-no, se eluyó con solución tampón 0,1 M glicina pH 2,8; se detectó la absorbancia a 256 nm y las fracciones fueron dializadas contra solución tampón 0,1 M NaHCO₃ pH 9,6.

Determinación de la concentración de proteínas. Para determinar la concentración de proteínas se empleó el método de Lowry.¹¹

Criterio de pureza y determinación del peso molecular. Se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida al 10 % utilizando proteínas patrones de bajo peso molecular (Biorad) y se tiñeron con nitrato de plata.¹² Con el objetivo de determinar el peso molecular de la p24 purificada se midieron las Rf de las proteínas patrones y de la p24 y se graficaron al log de su peso molecular.¹³

Caracterización inmunológica. La p24 purificada se enfrentó a un panel de sueros positivos y negativos a VIH-1, así como a un anticuerpo monoclonal anti-p24, mediante la técnica de inmunoelectrotransferencia, con el objetivo de comprobar la permanencia de su actividad biológica a lo largo del proceso de purificación.¹²

RESULTADOS

En la figura 1 correspondiente a la tinción con nitrato de plata, se puede apreciar una banda de proteínas de aproximadamente 24 KD si se compara con proteínas patrones de bajo peso molecular. En los datos de la figura 2, donde se grafican las Rf medidas según la migración de las proteínas patrones frente al log de sus pesos moleculares, se define que el peso molecular de la proteína purificada está por los 24 KD. La figura 3 responde a la inmunoelectrotransferencia de la proteína purificada frente a sueros positivos y negativos al VIH-1, y a anticuerpos monoclonales anti-p24, el antígeno de VIH-1 sólo se enfrentó a suero control positivo.

DISCUSION

Al no apreciarse en la figura 1 ninguna banda contaminante, se puede concluir que la p24 tiene un alto grado de pureza. Se constató, en la inmunoelectrotransferencia, la presencia de una banda proteica al mismo nivel de la p24 del antígeno de VIH-1, este hecho confirma que la proteína que aparece en la tinción con nitrato de plata (figura 1), no es otra que la p24 natural. Otra conclusión a la que podemos llegar es que, durante la purificación, la p24 natural no pierde su inmunogenicidad pues reaccionó de manera satisfactoria frente a sueros positivos y al anticuerpo monoclonal. Por otra parte, al analizar un panel de sueros negativos, éstos resultaron no reactivos, de lo que se infiere que la p24 purificada es muy específica y pudiera ser utilizada en el desarrollo de medios diagnósticos.²⁴

SUMMARY

The use of systems to detect the presence of 24kd protein as well as the levels of antibodies to it, is very useful in the follow-up of HIV-1 infected individuals. To develop these systems it is necessary to have this protein purified. The present paper describes the purification of p24 starting from the semipurified viral flattening on saccaharose gradient, using immunoaffinity chromatography with monoclonal antibodies coupled to Sepharosa 4B activaded with cyanogen bromide. For the characterization of the purified product it was used polyacrylamide gel electrophoresis with silver staining and immunoelectrotransference. As a result, it was obtained p24 which can be used for the development of diagnostic tools and monoclonal antibodies.

Key words: HIV CORE PROTEIN P24/isolation & purification; HIV-1/isolation & purification; CHROMATOGRAPHY, AFFINITY; ELECTROPHORESIS: POLYACRYLAMIDE GEL; FOLLOW-UP STUDIES.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Recibido: 7 de julio de 1995. Aprobado: 23 de diciembre de 1995.

Lic. René Grana Sánchez. Centro de Investigaciones Científicas de la Defensa Civil. Apartado 23031, Habana 14, San José de Las Lajas, La Habana, Cuba.