Rev Cubana Med Trop 1996;48(2):133-135

Comunicación Breve

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Identificación por ELISA de agentes productores de efecto citopático ligero aislados durante la epidemia de neuropatía en Cuba. 1991

Lic. GREHETE GONZALEZ, Lic. JOSE LAFERTE, Dr. PEDRO MAS, Lic. VALEXYS VAZQUEZ, Lic. ROSMARI RODRIGUEZ y Lic. JOHANDRA MIGUEZ

RESUMEN

Utilizando como referencia la cepa 44/93 aislada durante la epidemia de neuropatía en Cuba en 1991 y caracterizada como productora en cultivo celular de efecto citopático ligero (ECP-L), se logró la normalización de un ELISA para la identificación rápida de otras cepas con similar efecto. El ensayo consistió en un ELISA tipo sandwich donde las condiciones seleccionadas para cada reactivo (10 mg/mL para el anticuerpo de recubrimiento, 1 mg/mL para el antígeno y dilución 1/2 000 para el conjugado) permitieron una adecuada discriminación entre el antígeno y el control de antígeno para la cepa de referencia empleada. La evaluación de un panel de cepas virales de referencia y de otras cepas productoras de ECP-L, mostró un 100 % de coincidencia entre este método y el aislamiento en cultivo celular. Los resultados obtenidos nos permiten recomendar la utilización de este ensayo como una alternativa más precisa en la identificación de estos agentes.

Palabras clave: ELISA/métodos; NEURITIS; CUBA. A finales de 1991 comenzó en Cuba una epidemia de neuropatía, cuya causa fue considerada de índole multifactorial (agentes neurotóxicos y deficiencias nutricionales).

Los estudios realizados con el fin de descartar una posible causa infecciosa, en particular viral, demostraron la presencia en cultivo celular de 2 agentes aislados de líquido cefalorraquídeo de pacientes, uno que provocaba un efecto citopático rápido, típico de Enterovirus, identificado con los pools de Lim Benyesh Melnick por prueba de neutralización¹ como un Coxsackie A9 y otro de progresión lenta, con efecto citopático ligero (ECP-L), predominando hacia los bordes de la monocapa celular, en los primeros pases, cuya observación no era siempre evidente, y el cual fue detectado en un porcentaje elevado de casos.^2-4

Al considerar que el estudio y posterior identificación de este agente sería de utilidad para ayudar a esclarecer en alguna medida la posible causa de esta enfermedad y teniendo como antecedente la utilización de un ELISA para la detección de anticuerpos a una cepa de Coxsackie A9 (cepa 47/93), aislada durante la epidemia,⁵ decidimos combinar la objetividad de este método con su sensibilidad y especificidad respecto a la observación en cultivo para utilizarlo como una alternativa más en la identificación de estos agentes de efecto citopático ligero.

Para la puesta a punto del ELISA, se empleó fracción gamma de conejo inmunizado con la cepa 44/93, la cual había sido caracterizada como productora de ECP-L en cultivo de células VERO.⁶ Este anticuerpo presentó un título neutralizante de 1:1 280 a la cepa, y fue fijado a la fase sólida durante toda la noche a 4 °C a una concentración de 10 mg/mL. El antígeno viral y el control de antígeno fueron preparados en la línea celular BHK-21, clono 15 y utilizados ambos en el ensayo a una concentración de 1mg/mL incubados durante 3 horas a 37 °C. Las diferentes cepas fueron evaluadas a igual concentración de proteínas que la cepa 44/93 (1 mg/mL) y su título infectivo, medido por neutralización oscilaba entre 10^-5 y 10^-7. El conjugado empleado fue la misma fracción gamma de conejo acoplado a la enzima peroxidasa de rábano picante y diluido 1/2 000 en buffer fosfato conteniendo tween 20 al 0,5 % y suero de ternera al 5 %. La incubación se realizó durante 1 hora a 37 °C.

La reacción fue revelada utilizando como sustrato ortofenilendiamina (OPD) durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Las lecturas de densidad óptica (DO) se realizaron a 492 nm en un lector de ELISA de la serie multiskan. Los resultados fueron expresados en porcentajes de absorbancia que tenían como referencia la DO de la cepa 44/93, se observaron valores bajos para las cepas no relacionadas con este efecto (tabla). Para la cepa 47/93 y Coxsackie A9 los porcentajes de absorbancia son elevados respecto a las demás cepas no relacionadas, cuestión que podemos explicar si tenemos en cuenta que al realizar pruebas de neutralización cruzada con sueros hiperinmunes se ha observado neutralización de la cepa 47/93 (Coxsackie A9) y el Coxsackie B4 con sueros a los agentes de ECP-L. Por inmunoblot con sueros hiperinmunes también esta relación ha sido observada, lo que presupone una relación entre ambas cepas aún no esclarecida.

Consideramos que este método además de ser rápido (5 horas), puede ser una vía para detectar la presencia de estos agentes de difícil visualización en el cultivo celular.

TABLA. Identificación de algunas cepas productoras de ECP-L en sobrenadante de cultivo utilizando ELISA tipo sandwich

Cepas ELISA	(% de absorbancia)
44/93	100,0
CoxA9	29,9
CoxB2	9,6
CoxB3	1,3
CoxB4	14,4
CoxB5	0,7
Echo4	2,7
Echo6	4,2
Echo7	9,7
Polio 1	4,1
Polio 2	4,5
Polio 3	5,4
HSV	1,4
RSV	1,7
47/93	29,4
Dengue 2(A15)	5,1
402*	57,7
470*	53,8
401*	51,4
231*	62,5
589*	98,7

* Cepas productoras de ECP-L provenientes de aislamientos.

SUMMARY

Using as a reference the strain 44/93 isolated during the neuropathy epidemy in 1991 and characterized as a producer of a light cytopathic effect (L-CPE), it was possible the standardization of an ELISA for the fast identification of other strains with similar effect. The assay consisted in a sandwich-type ELISA where the conditions selected for each reactive (10 mg/mL for the coating antibody, 1 mg/mL for the antigen, and dilution 1/2 000 for the conjugate) allowed to have an adequate discrimination between the antigen and the antigen control for the reference strain used. The evaluation of a panel of reference viral strains and of other L-CPE-producing strains showed a 100 % of coincidence between this method and the isolation in cellular culture. The results obtained permit us to recommed the use of this assay as a more precise alternative to identify these agents.

Key words: ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY; NEURITIS; CUBA.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Lennette EH, Schmidt NJ. Diagnostic Procedures for viral, rickettsial and chlamydial infections. 5. ed. Washington DC: American Public Health Association, 1979:104-8
2. Más P, Pelegrino JL, Guzmán G. Comellas M, Resick S, Alvarez M, et al. Viral isolation from cases of neuropathy in Cuba (en prensa).
3. Más P, Pelegrino JL, Guzmán G, Capó V, Rodríguez L, Rodríguez P, et al. Neuropatía epidémica cubana: parte I: aislamiento viral. Rev Cubana Med Trop 1995;47(1):11-5.
4. Más P, Guzmán G, Muné M, Resick S, Alvarez M. Neuropatía epidémica cubana: parte II: algunas características antigénicas de los aislamientos virales. Rev Cubana Med Trop 1995;47 (1):16-20.
5. Balmaseda A, Laferté J, Soler M, Vázquez S, Rodríguez L, Otero A, et al. Utilización del ELISA y el ultramicroELISA en la identificación de una cepa de coxsackie A9 aislada durante la epidemia de neuropatía en Cuba. Rev Cubana Med Trop 1995;47(1):44-9.
6. American Type Culture Collection. Cataloge of cell line & hydridomas, 7 ed. Maryland, 1992.

Recibido: 12 de enero de 1996. Aprobado: 15 de abril de 1996.

Lic. Grehete González. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.