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Revista Cubana de Medicina Tropical

Print version ISSN 0375-0760On-line version ISSN 1561-3054

Rev Cubana Med Trop vol.48 no.3 Ciudad de la Habana Setp.-Dec. 1996

 

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Evolución de la resistencia en una cepa de Culex quinquefasciatus a partir de la selección con el insecticida piretroide lambdacialotrina

Lic. TANIA GONZÁLEZ,1 Lic. JUAN A. BISSET,1 Lic. CRISTINA DÍAZ,2 Lic. MARÍA M. RODRÍGUEZ2 y Lic. LORENZO DIÉGUEZ1

RESUMEN

Se estudiaron los cambios en la resistencia a diferentes insecticidas en una cepa de Culex quinquefasciatus seleccionada en el laboratorio con dosis del piretroide lambdacialotrina que provocaran el 90 % de mortalidad en larvas. Se logró un aumento de la resistencia a este insecticida de 144,5 veces respecto al nivel original, y se obtuvo una cepa resistente (287x). También aumentaron los niveles de resistencia a metilpirimifos (2.4 veces), propoxur (6 veces), DDT (5,2 veces), clorpirifos (22 veces), cipermetrina (67,5 veces) y deltametrina (20,2 veces). Las frecuencias de los genes que codifican para las enzimas esterasas elevadas y acetilcolinesterasa modificada alcanzaron su máximo valor y se observaron cambios notables en los fenotipos para esterasas en las electroforesis en geles de poliacrilamida. Se detectó sinergismo de DEF y PB con lambdacialotrina, por lo que las esterasas elevadas y las esterasas de función múltiple pueden contribuir a la resistencia.

Palabras clave: RESISTENCIA A INSECTICIDA; CULEX/enzima.

INTRODUCCIÓN

La dramática extensión de la resistencia de diferentes especies de mosquitos a insecticidas organoclorados y carbamatos, así como el comienzo de la aparición de resistencia a piretroides que se han utilizado para sustituirlos, ha provocado un reciente incremento de los estudios que al nivel internacional se realizan, no sólo para su evaluación en el terreno, sino al nivel de laboratorio, con el fin de investigar los mecanismos que puedan estar involucrados en ésta.1,2 Por otra parte, la resistencia a un insecticida en particular se desarrolla relativamente rápido cuando los vectores se someten a una rigurosa presión de selección; por lo que se han realizado intentos para inducir la resistencia mediante el uso de insecticidas en el laboratorio. Esto no ha sido siempre exitoso por la ausencia de resistencia, o por los bajos niveles obtenidos.3,4 Sin embargo, la selección en Cuba de una cepa de Culex quinquefasciatus, homocigótica para la resistencia al insecticida organofosforado malatión, permitió una mejor comprensión de este fenómeno en el terreno y profundizar en el conocimiento de los mecanismos de resistencia existentes en nuestro país, lo que evidencia la importancia de extender estas investigaciones a otros insecticidas.5

El presente trabajo se propone evaluar los cambios que pueden producirse en el espectro de resistencia de una cepa de Culex quinquefasciatus ante la presión en el laboratorio con el insecticida piretroide lambdacialotrina, así como estudiar los mecanismos que se desarrollan a medida que se incrementa la resistencia a este tóxico durante sucesivas generaciones de selección.

MÉTODOS

El trabajo se inició con la cepa de Culex quinquefasciatus "Tínima", colectada en junio de 1992 en una zona próxima a la fábrica de cerveza de ese nombre en la provincia de Camagüey. Se estableció la colonia en el laboratorio y se sometió a diferentes pruebas.

Bioensayos. Se siguió la técnica de Georghiou y otros,6 se utilizaron larvas de tercer estadio tardío o cuarto temprano en número de 20 por copa con 99 mL de agua destilada. Los insecticidas ensayados fueron 1 organoclorado: DDT, 3 organofosforados: malatión, clorpirifos y metil-pirimifos; 1 carbamato: propoxur y 3 piretroides: lambdacialotrina, deltametrina y cipermetrina; aplicados en 5 o más dosis de 1 mL que provocaran mortalidades entre 2 y 98 %. Se realizaron 5 réplicas por concentración. Los insecticidas se prepararon en acetona y se colocaron controles a los que se les adicionó 1 mL de ésta. La lectura de las mortalidades se realizó a las 24 h y los resultados se procesaron mediante el programa Probit-log.7

Pruebas bioquímicas. Las larvas y adultos fueron homogeneizados de forma individual en 200 mL de buffer fosfato (0,02 M; pH = 7,5) a 4 oC de temperatura. Se determinó la actividad de las enzimas esterasas según el método descrito por Peiris y Hemingway.8 Para determinar la actividad de la enzima acetilcolinesterasa (AchE) modificada se siguió el método de Hemingway y otros.9 A partir de estas pruebas se calculó la frecuencia de los genes de la resistencia (FG) para las esterasas elevadas y para la AchE modificada, según la fórmula del equilibrio de Hardy-Weimberg:

FG = 1 - raíz cuadrada (SS/T)

Donde: SS = total de individuos susceptibles y

T = total de individuos testados.

Electroforesis. Se realizaron electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para la identificación de las esterasas, se emplearon las siguientes soluciones:

  • Buffer de gel (buffer tris-borato/EDTA pH = 8,6): Tris 0,1 M; EDTA O,0025 M; ácido bórico 0,04 M.

Para el gel de corrida:

  • Solución A: metil bis-acrilamida 2,25 g, acrilamida 75 g y agua destilada a completar500 mL.
  • Solución B: 25 g sacarosa / 250 mL buffer de gel.
  • Solución C: sulfato de amonio 0,16 % en agua destilada.

Las soluciones A, B y C se mezclaron y se adicionó agua destilada en proporción 1:1:1:1. Se utilizaron 0,75 mL del catalizador N,N,N,N tetrametilen diamino (TEMED) por mL de solución.

Previo a las electroforesis se determinó la actividad enzimática de las esterasas y se escogieron las muestras de mayor actividad, se aplicaron 10 mL de cada una de ellas mezclados con 10 mL del marcador xilen-cyanol (0,5 % diluido en sacarosa 5 %). La corrida se realizó a 200 v durante aproximadamente 1 h. Para la tinción se sumergió el gel en 50 mL de buffer fosfato que contenía 4 mL de cada uno de los sustratos específicos de las esterasas (1-naftil acetato y 2-naftil acetato) y se añadió 0,5 g del colorante fast-blue. Posteriormente el gel se enjuagó con agua destilada y se sumergió en ácido acético al 10 % para fijar la coloración de las bandas. Con el fin de identificarlas se corrió en cada gel una muestra de la cepa de referencia MRES que contiene la esterasa B1. Las otras bandas fueron identificadas por sus valores de Rf comparados con los reportados en la literatura internacional.

Selección. Se utilizó el insecticida piretroide lambdacialotrina y 50 larvas de cuarto estadio por copa con 99 mL de agua destilada. Se adicionó 1 mL de la dosis de este insecticida que produjo el 90 % de mortalidad en los bioensayos. Después de transcurridas 24 h se extrajeron los sobrevivientes y se transfirieron a agua fresca con alimento, creándose con ellos una nueva colonia. Este proceso se llevó a cabo por 4 generaciones de selección. En cada generación se realizaron los bioensayos, pruebas bioquímicas y electroforesis según los procedimientos descritos para la cepa parental ("Tínima").

Pruebas con sinergistas. Para completar el estudio de la resistencia se sometió la última generación seleccionada a las pruebas con sinergistas, se utilizó como inhibidor de las esterasas S.S.S. tributil fosforotritioato (DEF), y como inhibidor de las oxidasas de función múltiple (MFO), piperonil butóxido (PB). Durante 4 horas se expusieron las larvas a concentraciones subletales (1 y 0,5 p.p.m., respectivamente) de estos sinergistas, luego se adicionó el insecticida lambdacialotrina. El resto del procedimiento coincide con el descrito para los bioensayos.

RESULTADOS

En los bioensayos con larvas de la cepa parental "Tínima" (tabla 1) se pudo determinar que sólo era resistente (RF50 10) a malatión y altamente resistente a DDT, y presentaba susceptibilidad a clorpirifos, metil-pirimifos, propoxur y cipermetrina. A su vez, los valores de FR50 para deltametrina y lambdacialotrina indican que aunque esta cepa no mostró aún resistencia a estos tóxicos, sí debían estar presentes en ella genes que permitirían el desarrollo de ésta en caso de ser sometida a presión de selección con estos piretroides.

TABLA 1. Valores de las concentraciones letales (CL50 en mg/mL) y factores de resistencia (FR50) en larvas de Culex quinquefasciatus de la cepa porcentual "Tínima" y la colonia resistente TF4
 

Insecticida

Bleuet

CL50

"Tínima"

TF4

CL50

(DE)

FR50

CL50

(DE)

FR50

DDT

0,025

1,81

72,4

9,9

380,7

 

 

(0,48)

 

(1,4)

 

Malatión

0,15

1,54

10,3

0,48

3,2

 

 

(0,14)

 

(0,003)

 

Clorpirifos

0,0005

0,0004

0,8

0,009

17,6

 

 

(0,00008)

 

(0,003)

 

Metil-pirimifos

0,26

0,025

1,0

0,06

2,3

 

 

(0,003)

 

(0,01)

 

Propuxur

0,51

0,22

0,4

1,27

2,4

 

 

(0,04)

 

(0,11)

 

Cipermetrina

0,0008

0,0008

1,0

0,054

67,5

 

 

(0,0002)

 

(0,003)

 

Deltametrina

0,0003

0,001

3,3

0,02

66,6

 

 

(0,0002)

 

(0,01)

 

Lambdacialotrina

0,0003

0,0006

2,0

0,086

286,6

 

 

(0,0001)

 

(0,012)

 

DE: +/- desviación estándar.

Bleuet: Cepa susceptible de referencia.

Una vez iniciada la selección con lambdacialotrina se observó un aumento progresivo de la resistencia a este insecticida, que se desarrolló desde la primera generación de selección obtenida. Esto puede observarse mediante el comportamiento creciente de los valores de CL50, CL90 y FR50 que se muestran en la tabla 2. Al final de la selección el factor de resistencia se había elevadoaproximadamente 144,5 veces respecto al original. También se produjeron cambios en las pendientes de las rectas de regresión dosis-mortalidad (b) a medida que avanzó la selección. El elevado valor de b en la última generación indica que no sólo se logró un aumento considerable de la resistencia a lamdacialotrina, sino que además la población se hizo homogénea para la resistencia a este tóxico.

TABLA 2. Valores de los parámetros de la recta de agresión dosis-mortalidad durante la seleccióncon lambdacialotrina por 4 generaciones
 

 

CL50

CL90

 

 

 

(DE)

(DE)

b

FR50

"Tínima"

0,0006

0,003

1,9

2

 

(0,0001)

(0,0008)

 

 

TF1

0,004

0,014

2,7

13

 

(0,0007)

(0,003)

 

 

TF2

0,006

0,035

1,7

20

 

(0,004)

(0,03)

 

 

TF3

0,014

0,045

2,6

47

 

(0,003)

(0,016)

 

 

TF4

0,086

0,151

5,2

287

 

(0,012)

(0,074)

 

 

Bleuet

0,0003

0,0004

6,4

-

DE: +/- desviación estándar.

Bleuet: Cepa susceptible de referencia.

La presión con lambdacialotrina provocó cambios en la resistencia a otros insecticidas (tabla 1). Sólo para malatión se produjo disminución de la resistencia respecto al valor inicial, y es de destacar que esta disminución constituyó un cambio importante en la cuarta y última generación de selección "TF4", pues en las generaciones precedentes se había incrementado en lugar de disminuir. TF 4 presentó aumento de la resistencia a metil-pirimifos y propoxur (2, 4 y 6 veces; respectivamente), aunque para estos insecticidas la resistencia puede considerarse todavía incipiente. Para DDT, clorpirifos, cipermetrina y deltametrina, TF 4 sí constituye una colonia resistente, y el aumento de los FR50 fue de 5,2; 22; 67,5 y 20,2 veces, respectivamente.

Las pruebas bioquímicas revelaron que en larvas y adultos de la cepa parental "Tínima" eran bajas las frecuencias de los genes que codifican para las enzimas esterasas elevadas y AchE modificada (tabla 3). Sin embargo, a medida que avanzó la selección estas frecuencias aumentaron de forma gradual por generaciones, llegando incluso sus valores a la unidad.

TABLA 3. Frecuencias génicas para las esterasas elevadas y acetilcolinesterasa (AchE) modificada en la cepa parental y las 4 generaciones de selección
 

 

Larvas

Adultos

Cepa

Esterasas

AchE

Esterasas

AchE

"Tínima"

0,29

0,30

0,36

0,08

TF1

0,42

0,44

0,76

0,24

TF2

0,85

0,75

1,00

0,85

TF3

0,90

0,82

1,00

0,67

TF4

1,00

1,00

1,00

1,00

 

En las electroforesis en gel poliacrilamida "Tínima" se caracterizó por la gran variedad de fenotipos para esterasas, y ésta fue mayor en larvas que en adultos. En larvas se distinguieron 9 combinaciones diferentes, las más importantes son (con frecuencias mayores o iguales al 10 %): A3B6 (21 %), A2A3A6A6 (17 %), B1A6B6 (15 %), A3A6B6 (14 %) y A2B1A6 (10 %). En adultos los patrones más frecuentes fueron B1A6 (45 %) y B1 (39 %), de un total de 4 combinaciones observadas (figura 1). A medida que se realizó la selección se redujo la diversidad de los patrones de esterasas en PAGE. Tanto en larvas como en adultos fue progresivamente menor el número de bandas diferentes por individuo, y lo más notable lo constituyó la presencia del patrón donde se destaca una banda cada vez más gruesa de la esterasa B1 hasta la tercera generación de selección (figura 2). Sin embargo, en la cuarta y última generación ocurrió un nuevo cambio en los zimogramas de larvas y adultos, lo más significativo fue la disminución de la frecuencia de aparición de la esterasa B1. En larvas se presentaron 4 fenotipos: A3A6B6 (49 %), A3 (37 %), B1A6B6 (11 %) y B1 (3 %). En adultos fueron 3 los patrones de esterasas: A6 (44 %), B1A6 (40 %) y A3A6 (16 %) (figura 3). Es de notar que el patrón de una sola banda de la esterasa A6, que es el de mayor frecuencia en adultos de TF4, no se había observado en ninguna de las generaciones anteriores.

Figura 1

FIGURA 1. Fenotipos de esterasas en electroforesis en gel de poliacrilamida, correspondientes a adultos de la cepa "Tinima" de Culex quinquefasciatus.

Figura 2

FIGURA 2. Patrón de esterasas en electroforesis en gel de poliacrilamida, característico de los adultos de la tercera generación de selección de la cepa de Culex quinquefasciatus "Tínima" presionada con lambdacialotrina al 90 % de mortalidad.

Figura 3

FIGURA 3. Fenotipos de esterasas en gel de poliacrilamida, correspondientes a adultos de la cuarta generación de selección de la cepa de Culex quinquefasciatus "Tínima" presionada con lambdacialotrina al 90 % de mortalidad.

Los estudios realizados con sinergistas revelaron acción sinérgica de DEF y de PB con lambdacialotrina (FS=4,5 y 86, respectivamente) en larvas de TF4.

DISCUSIÓN

Diferentes autores han encontrado resistencia cruzada entre organofosforados y carbamatos.10-12 En nuestro estudio la cepa parental, aunque era resistente a malatión, no presentaba resistencia al resto de los organofosforados ni a propoxur. También se ha demostrado que la resistencia a DDT está correlacionada con la resistencia a piretroides por el gen kdr,13 pero en "Tínima" tampoco se cumplió esta correlación. Sin embargo, el aumento de la resistencia a cipermetrina, deltametrina y DDT que se produjo al realizar la selección con lambdacialotrina sí se corresponde con la resistencia cruzada que se ha descrito puede existir entre diferentes piretroides y entre éstos y el DDT. La selección con cipermetrina al 60-75 % en Cx. quinquefasciatus durante 20 generaciones aumentó más el FR50 a deltametrina que a la propia cipermetrina.14 A diferencia de esto, en nuestra cepa el aumento de la resistencia a lambdacialotrina fue mucho mayor que el detectado para el resto de los piretroides y el DDT, lo que indica que aunque deben existir mecanismos comunes que permitan la detoxificación de estos compuestos, pueden desarrollarse también, de forma selectiva, mecanismos más específicos que confieran resistencia al insecticida con el que se lleva a cabo la presión de selección.

Se ha descrito que la selección con insecticidas organofosforados no provoca aumentos en la resistencia a piretroides.5 En una cepa de Culex sp. altamente resistente a organofosforados se encontró mayor o igual susceptibilidad a piretroides que en la respectiva cepa susceptible de referencia,15 e incluso se ha demostrado que puede existir resistencia cruzada negativa entre organofosforados y permetrina.14 Esto no descarta el que pueda encontrarse resistencia cruzada entre estos 2 tipos de insecticidas. En Cuba, la resistencia a malatión apareció después de 6 a de uso continuado para el control de mosquitos,16 al ser sustituido por piretroides comenzó a desarrollarse también la resistencia a dichos tóxicos, en poblaciones de campo, después de la selección con piretroides, se produjo un aumento de la resistencia a malatión y propoxur, y en menor medida a metil-pirimifos.10 En nuestra cepa la presión con lambdacialotrina incrementó la resistencia a malatión hasta la tercera generación, aunque en la última se redujo a un nivel inferior al de la parental. Para el resto de los organofosforados y el propoxur sí se mantuvo el aumento gradual de la resistencia, que se correspondió con el incremento de la frecuencia de los genes que codifican para las enzimas esterasas elevadas y AchE modificada en larvas y adultos a través de las 4 generaciones.

Se ha demostrado el papel de las esterasas y de la AchE modificada en la resistencia a organofosforados y en la detoxificación de los carbamatos,16-19 lo que apoya los resultados mencionados anteriormente. Sin embargo, en cuanto a los piretroides es aún controvertido el papel que pueden jugar las esterasas como mecanismo de resistencia. En Cuba se detectó un tipo de resistencia incipiente en el terreno para deltametrina, que se asoció con alto sinergismo de este insecticida con DEF.11 las pruebas con sinergistas en nuestra última generación de selección indican que aunque las MFO deben desempeñar un papel fundamental como mecanismo de resistencia a lambdacialotrina, por el elevado valor del factor de sinergismo con PB, se detectó además sinergismo con DEF, por loque las esterasas intervienen también en la resistencia a este insecticida.

Los cambios en los patrones de esterasas en PAGE a medida que se llevó a cabo la selección demuestran la importancia de realizar estudios con vistas a esclarecer el papel de las diferentes bandas y las combinaciones en que éstas pueden presentarse, en relación con la resistencia a los distintos tipos de insecticidas. Es de notar que el aumento de la resistencia a malatión hasta la tercera generación coincide con el incremento de la frecuencia de la esterasa B1 observada en PAGE, y la reducción de la resistencia a este insecticida en la última generación se corresponde a su vez con la disminución de la frecuencia de aparición de esta enzima. En estudios realizados en Cx. quinquefasciatus de California se observó que la esterasa B1 puede causar resistencia múltiple a organofosforados9 (Ranasinge LBE. Role of synergists in the selection of specific organophosphorus resistance mechanisms in Culex pipiens quinquefasciatus Say [Ph.D. dissertation], University of California, Riverside, 1986), aunque en nuestra cepa parece estar más fuertemente relacionada con la resistencia a malatión. En cuanto a la resistencia a lambdacialotrina el aumento más significativo se corresponde con el importante cambio en los zimogramas que ocurrió en la cuarta generación, en la cual aparece incluso un fenotipo que no se había observado en las generaciones anteriores. Esto evidencia la necesidad de continuar investigando el papel de estas enzimas en la resistencia a piretroides y especialmente a lambdacialotrina.

SUMMARY

The resistance change to different insecticides in Culex quinquesfasciatus strain select at the laboratory with doses of pyrethroid lambda-cyhalothrin that would cause a larva mortality of 90 % were studied. It was attained an increase of the resistance to this insecticide of 144.5 times compared with the original level, and it was obtained a resistant strain (287x). There was an increase of the levels of resistance to methyl-pyrimifos (2.4 times), propoxur (6 times), DDT (5,2 times), clorpirifos (22 time), cypermethrin (67.5 times), and deltamethrin (20.2 times). The frecuencies of the genes that codify for the elevated esterases enzymes and for the modified acetylcholinesterase reached their maximum value. Significant changes were observed in the phenotypes for esterases in the electrophoresis in polyacralamide gels. It was detected synergism of DEF and PB with lambda-cyhalothrin. Therefore, the elevated esterases and the esterases of multiple function may contribute to resistance.

Key words: INSECTICIDE RESISTANCE; CULEX /enzymology.

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Recibido: 23 de mayo de 1995. Aprobado: 14 de junio de 1995.

Lic. Tania González. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.

1 Licenciado en Biología.
2 Licenciada en Bioquímica.

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