Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Ensayo inmunoenzimático en fase sólida para la detección de antígenos de Giardia lamblia

Lic. DINORAH TORRES, Dra. MARIBEL FERNÁNDEZ, Téc. TANIA BRITO y Dr. CARLOS FINLAY

RESUMEN

Se normalizó un sandwich ELISA para la detección de antígenos de Giardia lamblia en heces humanas. Se estudiaron 175 muestras: 77 positivas, 61 negativas a quistes y/o trofozoítos por el examen directo de las heces y 19 muestras positivas a otros parásitos diferentes de G. lamblia. La sensibilidad de la técnica fue de 94,8 % y la especificidad de 98,3 %; el método detecta una concentración de antígenos de 31 ng. El procedimiento es simple, sensible y específico, por lo que pudiera ser útil para el diagnóstico y en estudios epidemiológicos.

Descriptores DeCS: GIARDIA LAMBLIA/inmunología; ANTIGENOS DE PROTOZOARIOS; ELISA/métodos; HECES/parasitología.

INTRODUCCIÓN

La giardiasis es reconocida actualmente como una infección intestinal importante en muchas partes del mundo.^1,2 El agente causal, Giardia lamblia, es el protozoo parásito más frecuentemente identificado en la población cubana, según los datos de la Encuesta Nacional de Parasitismo Intestinal realizada en 1984,³ la mayor prevalencia se encuentra en el grupo de 1 - 5 a.

El diagnóstico convencional se realiza por el examen microscópico de las heces para determinar la presencia de quistes y/o trofozoítos, estos últimos más frecuentes en las heces diarreicas. En general estas técnicas tienen una baja sensibilidad, dada fundamentalmente por el patrón intermitente de excreción de quistes, lo que hace necesario el examen seriado de un número variado de muestras para lograr el diagnóstico.^4-6 La utilización de métodos alternativos de diagnóstico, tales como la observación del líquido duodenal o la biopsia de mucosa de intestino delgado, aumentan la sensibilidad, pero son muy invasivos para el paciente. Los problemas antes mencionados han estimulado el desarrollo de técnicas inmunológicas que permiten la detección de antígenos parasitarios en las heces, las técnicas inmunoenzimáticas en fase sólida son las más empleadas. En el presente trabajo evaluamos un ensayo inmunoenzimático en fase sólida que detecta antígenos de G. lamblia en muestras de heces, los resultados son comparados con el examen microscópico.

MÉTODOS

PREPARACIÓN DE LOS ANTÍGENOS DE TROFOZOÍTOS DE G. LAMBLIA

Los antígenos utilizados en la inmunización de los animales y como controles en la técnica de ELISA se prepararon a partir del cultivo axénico del aislamiento de G. lamblia C-5 obtenido en el Laboratorio de Parasitología del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK), procedente de un paciente con giardiasis sintomática. Para la preparación del antígeno se tomaron cultivos de 3 d en medio TYI-S-33, suplementado con bilis,⁷ y se colectaron los parásitos por inmersión en baño de hielo por 10 min con posterior centrifugación a 600 gravedades. Una vez colectados se lavaron 3 veces con solución salina tamponada con fosfato 0,1 M pH 7,2-7,4 (SSTF) y se rompieron por congelación y descongelación 10 veces.

Una vez concluido el proceso se procedió a una centrifugación a 2 000 gravedades durante 5 min y el sobrenadante se almacenó a -70 °C hasta su utilización. La concentración de proteínas se estimó por el método de Lowry y otros.⁸

PREPARACIÓN DEL SUERO HIPERINMUNE

Se inmunizaron 2 conejos chinchillas, se siguió un esquema ascendente de concentración antigénica que consistió en 5 inoculaciones a intervalos de 15 d, por vía subcutánea. Cada animal fue inoculado con 0,5 mL del antígeno emulsificado en igual volumen de adyuvante completo de Freund en la primera inyección y de adyuvante incompleto de Freund en las 4 restantes. La concentración inicial de antígeno fue de 50 µg/mL y la final de 500 µg/mL. Quince días posteriores a la última inyección se inocularon con 1 mL de antígeno a una concentración de 500 µg/mL, por vía intravenosa y se desangraron 7 d después.

PURIFICACIÓN DE LAS INMUNOGLOBULINAS DEL SUERO HIPERINMUNE

Se realizó en 2 etapas: se precipitó la fracción gammaglobulina con solución saturada de sulfato de amonio al 50 %, seguido de un proceso de desalinización en una columna PD-10 (Sephadex G-25, Pharmacia) como primera etapa; luego se purificó la fracción de inmunoglobulina (Ig) específica anti-G. lamblia por medio de una cromatografía de afinidad, en la que se acopló antígeno de G. lamblia a Sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno.

El antígeno que se acopló a la columna se obtuvo a partir de los trofozoítos obtenidos como se describió anteriormente, los que se resuspendieron en el tampón de lisis: Nonidet P-40 al 0,5 % en SSTF, con inhibidores de proteasas (1 mmol/L) (Phenylmetylsulfhonyl fluoride y iodoacetamide) y se sometieron a un proceso de congelación y descongelación 10 veces, seguido de una centrifugación a 2 000 gravedades por 10 min. El sobrenadante así obtenido se dializó contra el tampón de acoplamiento (NaHOC₃ 0,1 M pH 8,3 que contiene NaCl 0,5 M) toda la noche a 4 °C.

El acoplamiento del antígeno (12 mg) con la Sefarosa 4B, se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia). La fracción de Ig obtenida después de la precipitación con sulfato de amonio al 50 % se aplicó a la columna, que se equilibró previamente con SSTF, y después de lavados sucesivos con SSTF la fracción de Ig específica anti-G. lamblia, unida a la columna, fue eluida con solución tamponada de glicina-HCL 0,1 mol/L pH 2,5. El pH fue neutralizado rápidamente con solución tamponada Tris-HCL 3 mol/L pH 8. El eluato fue posteriormente dializado contra SSTF, concentrado por ultrafiltración por medio de un equipo AMICON (Amicon corp.) con membrana YM-100 y almacenado en alícuotas de 500 µL a -70 °C hasta su uso.

CONJUGADO IG DE CONEJO ANTI G. LAMBLIA CON PEROXIDASA

El conjugado fue preparado a partir de la inmunoglobulina purificada por afinidad, mediante el método de Wilson y Nakane⁹ el cual emplea peryodato de sodio como agente activante de la enzima.

MUESTRAS ESTUDIADAS

Se procesaron 77 muestras de heces obtenidas de pacientes positivos a G. lamblia por el examen directo de éstas y/o del líquido duodenal, procedentes de la consulta externa de Parasitología y/o Gastroenterología del Hospital Pediátrico "Juan Manuel Márquez" y de una institución infantil del municipio La Lisa, ambos de Ciudad de La Habana; y 80 muestras de heces de niños negativos a G. lamblia por el examen directo de las heces, 19 de las cuales presentaban otras parasitosis (5 por Blastocystis hominis, 5 por Endolimax nana, 2 por Entamoeba histolytica, 2 por Criptosporidium sp., 2 por Fasciola hepatica y 3 por Trichuris trichiura).

PROCEDIMIENTO DE LA TÉCNICA DE ELISA

Para la técnica de ELISA se tomó 1 g de heces y se emulsificó en 2 mL de SSTF-0,05 % de Tween 20 (SSTF-T20), se centrifugó a 600 gravedades durante 20 min, y se tomó el sobrenadante para el estudio.

Las diluciones óptimas de los reactivos se establecieron por titulación simultánea cruzada.

Las placas de poliestireno (NUNC MAXISORP F-8) se sensibilizaron con 20 µg/mL de IgG anti-G. lamblia en tampón carbonato - bicarbonato 0,05 M pH 9,6; 16 h a 4 °C. Posteriormente se lavaron 6 veces con SSTF-T20 y se añadieron 300 µL/pocillo de leche descremada al 5 % en SSTF-T20 por 1h a 37 °C. Se desechó la leche y se añadieron 100 µL/pocillo de la muestra correspondiente y se incubaron 2h a temperatura ambiente (TA) seguido de otro paso de lavado similar al anterior. Inmediatamente se añadieron 100 µL/pocillo de IgG de conejo anti-G. lamblia conjugada con peroxidasa diluida 1/1 000 en SSTF-T20 con un 10 % de suero de conejo y se incubó 2h a TA. Posteriormente se procedió a otro paso de lavado y se añadió la solución de sustrato (20 mg de ortofenilendiamina, 20 µL de H₂O₂ al 30 % y 50 mL de tampón citrato-fosfato pH 5,0) y se dejó reaccionar por 30 min a TA en la oscuridad. Para detener la reacción se adicionaron a cada pocillo 50 µL de H₂SO₄ al 12,5 % y se leyó a una longitud de onda de 492 nm.

Las muestras se consideraron positivas cuando tenían un valor de DO mayor que la DO media del grupo de las muestras negativas más 2 desviaciones estándar (DE) (DO + 2DE).

Para determinar el número de trofozoítos y quistes, así como la concentración mínima de antígenos solubles que podía detectar el sistema, se realizaron diluciones seriadas de trofozoítos procedentes de cultivo, sin ser sometidos a ningún proceso de rotura, de quistes purificados de las heces por un gradiente de sacarosa o de una solución de antígenos preparada como se describió con anterioridad, con una concentración de proteínas conocida; las diluciones en todos los casos se realizaron en SSTF. El número de quistes en la solución inicial fue de 50 000 quistes/100µL y en la solución de trofozoítos fue de 322 000 trofozoítos/100µL, en ambos casos el número se estableció por conteo en cámara de Neubauer y se realizaron diluciones seriadas hasta 5 y 32 quistes y trofozoítos, respectivamente. La curva de antígenos abarca de 1 000 ng/mL hasta 15 ng/mL. En estos ensayos se consideró positiva la dilución cuyo valor de DO fuera mayor que la DO media de la SSTF-T20, la que se tomó como control negativo, más 3DE (DO + 3DE).

Para estudiar la repetibilidad del sistema se empleó un grupo de 6 muestras negativas y 6 positivas, las cuales fueron probadas 6 veces en la misma placa, y se hallaron la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación. Para determinar la reproducibilidad del sistema se estudió el mismo grupo de 6 muestras positivas y 6 negativas, pero se procesaron 3 d diferentes por 3 personas distintas, a los resultados también se les determinó la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación.

RESULTADOS

Habilidad del ELISA para detectar cantidades conocidas de trofozoítos y quistes. Para determinar el número de trofozoítos y quistes

que era capaz de detectar el sistema, se realizaron diluciones seriadas de trofozoítos provenientes de cultivo axénico y de quistes purificados de las heces, como se describe con anterioridad. La técnica es capaz de detectar 322 trofozoítos y 50 quistes (figura 1).

Concentración mínima de antígenos detectada por la técnica. Para esto se realizó una curva con concentraciones conocidas de antígenos de G. lamblia y se pudo determinar que el sistema detecta hasta 31 ng/mL de antígeno (figura 2).

FIGURA 1. Resultados del ELISA realizado con diluciones seriadas de trofozoítos y quistes de G.lamblia. Para los trofozoítos la solución no diluida (10⁰) representa 322 000 trofozoítos y para los quistes 50 000. Se consideró positiva la dilución cuyo valor de densidad óptica (DO) fuera mayor que 3DE de la media de la DO de la SSTF.

Detección de antígenos de G. lamblia en muestras de heces. La media de la DO a 492 nm de 2 determinaciones de cada una de las 175 muestras estudiadas se presentan en la figura 3. Se toma como valor de corte 0,235 el cual es equivalente a la DO media de las muestras negativas más 2 DE. De las 77 muestras positivas por el examen directo de las heces y/o líquido duodenal, 73 resultaron positivas por la técnica de ELISA, con una DO de 0,945 y de las 61 muestras negativas por examen microscópico, 60 resultaron negativas por ELISA con una DO de 0,141. Los valores de sensibilidad y especificidad fueron de 94,8 y 98,3 %; respectivamente. El valor predictivo de una prueba positiva fue de 98,6 %, y de una prueba negativa de 93,7 % (tabla). Los resultados obtenidos al estudiar 19 muestras negativas a G. lamblia y positivas a otras parasitosis fueron en todos los casos negativos (figura 3).

FIGURA 2. Curva de concentración de antígenos contra valores de DO. Se consideró positiva la concentración mayor que la DO de la SSTF + 3DE.

TABLA. Comparación del ELISA y el examen directo de las heces y/o líquido duodenal de las 157 muestras

	Examen directo
ELISA	Pos.	Neg.	Total
Pos.	73	1	74
Neg.	4	79	83
Total	77	80	157

Pos.: Positivo. Neg.: Negativo.

FIGURA 3. Inmunodetección de antígenos de G. lamblia en 157 muestras de heces. A: 77 muestras positivas a G. lamblia por examen directo de heces y/o líquido duodenal. B: 61 muestras negativas a G. lamblia por examen directo de heces. C: 19 muestras negativas a G. lamblia y positivas a otros parásitos por examen directo de heces (2, E. histolytica; 2, Cryptosporidium sp; 2, E. nana; 5, B. hominis; 3, T. trichiura; 2, F. hepatica).

El examen de 6 muestras positivas y 6 muestras negativas en 6 posiciones diferentes de una misma placa, arrojó variaciones mínimas en los valores de DO, y el estudio del mismo número de muestras durante 3 d diferentes por distintos operadores en un período de 3 semanas, también mostró desviaciones mínimas de los valores de DO, en ambos casos los valores de los coeficientes de variación estaban por debajo del 10 %.

DISCUSIÓN

La confirmación del diagnóstico clínico de la giardiasis presenta dificultades dadas por la baja sensibilidad de los métodos convencionales utilizados en el laboratorio y las molestias causadas a los pacientes cuando se utilizan los métodos más sensibles, como el examen del líquido duodenal y la biopsia de mucosa intestinal.

La técnica presentada en este trabajo muestra valores de sensibilidad y especificidad de 94,8 y 98,3 %, respectivamente, que confirman los resultados de otros investigadores sobre la utilidad de la técnica de ELISA para la detección de antígenos en heces, en el diagnóstico de la giardiasis.^10-14

El sistema es capaz de detectar tanto quistes como trofozoítos y podemos asumir, tentativamente, que es posible encontrar material antigénico producto de las secreciones o excreciones del parásito, o de la destrucción de éste, lo que aumentaría la utilidad de este método; sin embargo, debemos tener en cuenta que el número de casos en que no se encontraron formas parasitarias en las heces, y el diagnóstico se realizó sólo por la observación del líquido duodenal, fue muy bajo en nuestro estudio (3 pacientes).

Los estudios realizados con 18 voluntarios humanos por Nash y otros¹⁵ demuestran que siempre la técnica de ELISA tuvo resultados superiores al examen microscópico de las heces, donde las diferencias fueron mayores en el período prepatente y durante el tratamiento, en este último fueron estadísticamente significativas, lo que hace afirmar que la técnica es positiva en ausencia de quistes y/o trofozoítos en las heces, siempre y cuando exista la infección. Basados en esta posibilidad algunos autores atribuyen los llamados falsos positivos encontrados por la técnica de ELISA a la baja sensibilidad con respecto a ésta del examen microscópico de las heces, Janoff y otros¹⁶ en un estudio de validación de un ELISA para la detección de antígenos en heces, plantean esta posibilidad y toman como base que los porcentajes de falsos negativos son superiores (24 %) cuando el estudio se realiza con muestras de niños procedentes de instituciones infantiles, que cuando se realiza con muestras de adultos (3 %); atribuyen estos resultados al número de casos no diagnosticados en las instituciones infantiles en las que existe una alta prevalencia de esta parasitosis.

Sin embargo, desde nuestro punto de vista, son necesarios otros estudios que incluyan un mayor número de casos para establecer realmente el valor de la detección de antígenos en los pacientes que siempre resultan negativos por el examen de las heces, y por tanto su superioridad concluyente sobre los métodos tradicionales.

Los resultados negativos obtenidos por ELISA en 4 casos positivos por el examen microscópico, pudieran estar motivados porque la concentración de los antígenos detectados por la técnica estuvieran por debajo del límite de detección de ésta, aspecto no comprobado; sin embargo, también debemos tener en cuenta que entre las diferentes cepas de G. lamblia han sido identificados antígenos comunes y antígenos no comunes, los que se ha visto que están sometidos a una gran variabilidad.^17,18 En nuestro estudio no determinamos a cuál de estos 2 grupos pertenecen los antígenos mayormente reconocidos por el inmunosuero, lo que hace pensar que si pertenecen al segundo grupo esto podría ser una causa de la aparición de falsos negativos; aunque esta posibilidad se presenta con mayor frecuencia en los métodos que se basan en la detección de un antígeno específico y no cuando se detecta un número elevado de antígenos, que es nuestro caso.

Dentro de las muestras negativas se encontró 1 caso considerado como falso positivo; el cual puede ser causado por la presencia en las heces de inmunógenos diferentes de G. lamblia, pero que comparten epítopes con este parásito y por lo tanto son reconocidos por el inmunosuero. Jokipii y otros¹⁹ reportaron la presencia de títulos de anticuerpos contra antígenos de G. lamblia en individuos parasitológicamente negativos y provenientes de áreas no endémicas, lo que justifica la presencia de estos inmunógenos. No consideramos la posibilidad de una infección no diagnosticada, ya que la muestra proviene de un niño de menos de 1 mes de nacido el cual aún estaba bajo los cuidados maternos directos, alimentado con leche materna.

Nuestros resultados prueban la utilidad del ELISA para la detección de antígenos como un complemento del examen microscópico y la aplicación de éste claramente facilitaría y mejoraría el diagnóstico de la giardiasis.

SUMMARY

An ELISA sandwich for the detection of Giardia lamblia antigens in human faeces was standardized. 175 samples were studied: 77 positive, 61 negative to cysts and/or trophozoites by direct faeces test, and 19 positive to other parasite different from G. lamblia. The sensitivity of the technique was 94,8 % and the specificity 98,3 %. The method detects an antigen concentration of 31 ng. The procedure is simple, sensitive and specific so, it may be useful for diagnosis and in epidemiological studies.

Subject headings: GIARDIA LAMBLIA/immunology; ANTIGENS, PROTOZOAN; ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY/methods; FAECES/parasitology.

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Recibido: 2 de septiembre de 1996. Aprobado: 27 de noviembre de 1996.

Lic. Dinorah Torres. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.