Instituto de Medicina Tropical “Pedro KourÍ”

Pigmentación de cepas de Cryptococcus neoformans sobre agar semilla de girasol

Lic. Iliana del C. Valdés Hernández,1 Dr. Gerardo Martínez Machín,2 Lic. Carlos M. Fernández Andreu3 y Dra. María Teresa Illnait Zaragozí4

Resumen

Se determinó la producción de melanina sobre el medio agar extracto de semilla de girasol de 86 cepas de Cryptococcus neoformans, pertenecientes al Laboratorio de Micología del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”; de estas, 54,7 % produjo colonias con pigmento carmelita intenso, 5,8 % un pigmento claro y 37,2 % una tonalidad intermedia. Se creó un cuarto grupo para aquellas cepas que presentaron un pigmento verdínico (2,3 %). Con este trabajo se contribuyó de forma importante a una mejor caracterización de las cepas pertenecientes a la colección de la institución y sirve de base a estudios posteriores de patogenicidad y susceptibilidad.

DeCS: CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS; HELIANTHUS; SEMILLAS; AGAR; SINDROMES DE INMUNODEFICIENCIA.

 

Cryptococcus neoformans es una levadura capsulada que presenta una baja virulencia en individuos inmunocompetentes, pero que puede comprometer seriamente la vida de pacientes inmunodeprimidos.1,2 La forma más frecuente y devastadora de la enfermedad es la meningoencefalitis, que se acompaña de una marcada reducción de la expectativa de vida en los pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).1 El incremento de los casos de criptococosis al nivel mundial, especialmente aquellos asociados con el SIDA, ha motivado el interés por profundizar en el conocimiento de su agente causal y sus marcadores de virulencia. De estos los más ampliamente estudiados han sido la cápsula y la producción de enzima fenoloxidasa.3 La función de esta enzima en los nichos ecológicos naturales de la levadura es desconocida; en otros hongos ha sido asociada a la degradación de lignina, al desarrollo conidial y a la senescencia.4 Por otro lado, se ha podido conocer que las células melanizadas inhiben la fagocitosis mediada por anticuerpos y reducen la susceptibilidad a los agentes antifúngicos.5-8

Se estudiaron 86 aislamientos de C. neoformans pertenecientes al cepario del Laboratorio de Micología del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” (IPK). Como control negativo fue usada una cepa de Candida albicans (ATCC 90028). Las cepas se encontraban conservadas en agua destilada estéril a temperatura ambiente.

Para determinar la actividad de la fenoloxidasa, las colonias fueron transferidas a agar Sabouraud dextrosa (ASD) durante 7 d a 37 °C y luego a agar extracto de carne sin glucosa (Lab-Lemco powder, OXOID LMT, Basingstoke, Hamphire, England) bajo las mismas condiciones. Una vez obtenido el crecimiento, se tomaron colonias aisladas y se inocularon en agar semilla de girasol (ASG) (creatinina 780 mg/L, diphenil 100 mg/L, extracto de semilla 200 mL/L, glucosa 10 mg/L, agar 10 g/L) durante 5 d a 28 °C, porque la actividad de la enzima parece ser inhibida por temperaturas cercanas a los 37 °C.9

La producción de pigmento carmelita fue tomada como indicador de la producción de fenoloxidasa y las cepas fueron agrupadas atendiendo a la intensidad de este (fig.). Del total de los aislamientos estudiados, 54,7 % produjo pigmento café intenso, 5,8 % una pigmentación débil y 37,2 % un color intermedio entre los 2 grupos anteriores. Kwon-Chung y otros utilizaron este mismo criterio para comparar la actividad de la fenoloxidasa entre aislamientos clínicos y ambientales de C. neoformans var. gattii.10

 

Fig. Intensidad de la pigmentación sobre el ASG. Parte superior pigmento intenso; a la derecha pigmentación intermedia; abajo pigmentación débil; a la izquierda cepa no pigmentada (control negativo).

Además de encontrar un predominio de cepas intensamente pigmentadas, se comprobó la presencia de 2 cepas (2,3 %) que produjeron pigmento verde. El efecto verde sobre el medio ASG fue reportado por Staib, quien lo relacionó con una fuerte asimilación de la creatinina por el microorganismo con la consecuente alcalinización del medio. Este fenómeno fue descrito para la mayoría de los aislamientos de Sporothrix schinckii y para algunas cepas de C. laurentii y C. neoformans, aisladas en su totalidad de casos clínicos,11 esto concuerda con los hallazgos en el presente estudio.

El conocimiento que brinda este trabajo, constituye un paso de avance en la caracterización de las cepas de C. neoformans pertenecientes a la colección del IPK y puede servir de base a posteriores estudios de patogenicidad y susceptibilidad in vitro.

Summary

The production of melanin on a medium of sunflower seeds extract agar from 86 strains of Cryptococcus neoformans belonging to the Mycology Laboratory of “Pedro Kouri” Institute of Tropical Medicine was determined. 54.7 % of them produced colonies with dark brown pigment, 5.8 % a light pigment and 37.2 % an intermediate tonality. A fourth group was created for those strains with a true pigment (2.3 %). This paper is an important contribution to attain a better characterization of the strains from the collection of the institution and serves as a basis to further studies of pathogenicity and susceptibility.

Subject headings: CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS; HELIANTHUS; SEEDS; AGAR; IMMUNOLOGIC DEFICIENCY SYNDROMES.

Referencias bibliográficas

1. Mitchell TG, Perfect JR. Cryptococcosis in the era of AIDS-100 years after the discovery of Cryptococcus neoformans. Clin Microbiol Rev 1995;8(4):515-48.
   
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3. Buchanan KL,Murphy JW. What makes Cryptococcus neoformans a pathogen? Emerg Infect Dis 1998;4(1):71-83.
   
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5. Wang Y, Casadevall A. Susceptibility of melanized and non melanized Cryptococcus neoformans to nitrogen-and oxigen-derivates oxidants. Infect Immun 1994;67(2):3004-7.
   
6. Wang Y, Aisen P, Casadevall A. Cryptococcus neoformans melanin and virulence: Mechanism of action. Infect Immun 1995;63(2):3131-6.
   
7. Nasanchuk DJ, Casadevall A. Cellular charge of Cryptococcus neoformans: Contribution of the capsular polisaccharide, melanin and monoclonal antibody binding. Infect Immun 1997;65(5):1836-41.
   
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9. Jacobson ES, Jenkins ND, Tood JM. Relationship between superoxidedismutase and melanin in a pathogenic fungus. Infect Immun 1994;62:4085-6.
   
10. Kwon-Chung kj, Kozel tr, edman jc, polacheck i, ellis d, shinoda t, dromer f. Recent advances in biology and immunology of cryptococcus neoformans. J med Vet mycol 1992;30(1):133-42.
    
11. Staib F. Cryptococcus neoformans and cryptococcosis. Peculiarities and challenge: Opening lecture. Second Conference on Cryptococcus and cryptococcosis. J Mycol Med 1994;4(1):56-60.

Recibido: 31 de julio de 2000. Aprobado: 4 de enero de 2003.
Dra. María Teresa Illnait Zaragozí. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: [e-mail]

 

1 Máster en Bacteriología-Micología. Licenciada en Microbiología. Aspirante a Investigadora.
2 Especialista de II Grado en Microbiología. Investigador Agregado.
3 Máster en bacteriología-Micología. Licenciado en Microbiología. Investigador auxiliar.
4 Máster en Bacteriología-Micología. Especialista de I Grado en Microbiología. Investigadora Agregada.