Comunicaciones breves

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, U.N.A.M., México

Evaluación de la transcripción del locus rfb para la biosíntesis de LPS en Leptospira interrogans subtipo Hardjoprajitno

Dra. Erika Margarita Carrillo Casas,¹ Téc. Raquel Rojano Ríos,² Dr. Dieter Bulach,³ Prof. Ben Adler⁴ y Dr. Alejandro de la Peña-Moctezuma⁵

Resumen

Se construyó el plásmido pGL4W15-96 a partir del vector sin promotor para kanamicina pGL4W74 y una secuencia de 480pb que contenía al supuesto promotor J15, con el objetivo de confirmar el papel de la secuencia J15 como promotor para Leptospira; el cual restauró la transcripción del gen de resistencia a kanamicina en Escherichia coli y Leptospira biflexa, confirmando así la función del inserto como promotor para ambos organismos.

Palabras clave: Leptospira, LPS, promotor, plásmido.

 

Además de ser antigénicamente indistinguibles, los 2 subtipos de la serovariedad hardjo: hardjobovis y hardjoprajitno tienen una organización genética similar en sus loci rfb.^1-9 La presencia de transposasas similares a la familia IS5 entre los marcos de lectura abiertos H14 (polimerasa del antígeno O) y H15 (flipasa) en hardjobovis, anticipaba la transcripción del locus rfb en 2 unidades. Esto fue confirmado por RT-PCR.² En contraste, hardjoprajitno tiene una región intergénica J14 - J15 de longitud similar a su homólogo en hardjobovis pero sin transposasas. Análisis de transcripción por RT-PCR revelaron una sola unidad de transcripción en hardjoprajitno desde J1 hasta J31. Análisis más detallados mediante extensión del iniciador (PE) demostraron un sitio de inicio de la transcripción asociado con secuencias similares a promotores s⁷⁰ de E. coli arriba de J15 en hardjoprajitno.^{1, 8}

Para confirmar el papel de esas secuencias como promotores para Leptospira, se construyó un vector sin promotor para kanamicina, pGL4W74 utilizando como base el vector pGKLep4.⁷ Un fragmento doble Sau3AI de 480 bp que contenía el supuesto promotor arriba de J15, fue clonado en pGL4W74. La E. coli que contenía el plásmido recombinante, pGL4W15-96, fue cultivada en caldo LB con 0, 5, 10, 25, 50, 100 y 250 mg/mL de kanamicina en agitación a temperaturas de 25, 30, 37 y 42 °C. Se midió la OD₆₀₀ por triplicado a las 0, 1, 2, 3 y 24 h y cada ensayo fue también repetido por triplicado.

El constructo, pGL4W15-96, restauró la transcripción del gen de resistencia a kanamicina, lo que resultó en colonias Ka^R de E. coli y Leptospira biflexa, confirmando así, la función del inserto como promotor para ambos organismos. E. coli recombinantes mostraron una absorvancia de hasta 1,7 en todas las concentraciones de kanamicina a 30 y 37 °C; pero absorvancias tan bajas como 0 a 25 y 42 °C en concentraciones de 50 mg/mL de kanamicina.

La transcripción de los loci rfb de ambos subtipos de la serovariedad hardjo en 2 unidades está conservada a pesar de las diferencias estructurales en sus regiones intergénicas orf14-orf15. La transcripción regulada por el fragmento de 480 bp de esta región intergénica en hardjoprajitno, es dependiente de temperatura, siendo activa a 30 y 37 °C, pero no activa a 25 ni 42 °C.

 

Evaluation of the transcription of locus rfb for the biosynthesis of LPS in Leptospira interrogans subtype hardjoprajitno

Summary

Plasmid pGL4W15-96 was constructed from the pGL4W74 vector without promoter for kanamycin and a sequence of 480pb containing the supposed Jl5 promoter with the objective of confirming the role of J15 sequence as a promoter for Leptospira, which restored the transcription of the gene of resistance to kanamycin in Escherichia coli and Leptospira biflexa, corroborating this way the function of the insertion as a promoter for both organisms.

Key words: Leptsopira, LPS, promoter, plasmid.

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Recibido: 27 de diciembre de 2004. Aprobado: 10 de marzo de 2005.
Dr. Alejandro de la Peña-Moctezuma. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, U.N.A.M., México.

¹ Médico Veterinario Zootecnista. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, U.N.A.M., México.
² Técnico. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, U.N.A.M., México.
³ Doctor en Medicina. Departamento de Microbiología, Universidad de Monash, Clayton, Victoria, Australia.
⁴ Doctor en Medicina. Profesor. Departamento de Microbiología, Universidad de Monash, Clayton, Victoria, Australia.
⁵ Médico Veterinario. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, U.N.A.M., México.