ARTÍCULO ORIGINAL

 

Normalización de un ELISA de captura para la detección de anticuerpos de tipo IgM al virus de la parotiditis

 

Standardization of a capture ELISA for detection of IgM antibodies to parotiditis virus

 

 

Gretel Acosta Renom^I; María de los Ángeles Ribas Antúnez^II; Yahisel Tejero Suárez^III; Susana Vázquez Ramudo^IV; Daynelid Piedra Pérez^V; Yanislet Cordero Aguilar^VI

^I Licenciada en Microbiología. Máster en Virología. Departamento de Virología. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
^II Doctora en Medicina. Departamento de Virología. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
^III Técnico en Química Industrial. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
^IV Doctora en Ciencias. Profesora Titular. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
^V Técnico en Farmacia Industrial. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
^VI Técnico en Procesos Biológicos. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.

 

 

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RESUMEN

INTRODUCCIÓN: la parotiditis es una enfermedad contagiosa aguda, que afecta fundamentalmente a los niños en edad escolar entre 5 y 14 años y requiere de técnicas rápidas para su diagnóstico.
OBJETIVOS: se normalizó un ELISA de captura para la detección de anticuerpos de tipo IgM al virus de la parotiditis y se comparó con la inhibición de la hemaglutinación.
MÉTODOS: se estudiaron 177 monosueros y 285 pares de suero que procedían de la vigilancia seroepidemiológica al virus de la parotiditis, enviados por las diferentes provincias del país en el período comprendido entre enero 2004-diciembre 2006. Fueron analizados con la técnica de inhibición de la hemaglutinación y se emplearon en la normalización del sistema. Se determinó la precisión del ensayo y se realizó el estudio de la reactividad cruzada a otros agentes virales.
RESULTADOS: al evaluar el sistema, se obtuvieron valores de sensibilidad de 98,9 %, especificidad 98,5 % y concordancia 98,7 %; se encontró una buena relación en los valores del coeficiente de variación intraensayo e interensayo en todos los casos estudiados. No se observó reactividad cruzada con otros agentes infecciosos.
CONCLUSIONES: este sistema demostró ser de gran utilidad para el diagnóstico temprano de la parotiditis, resultó ser más sensible y rápido que la inhibición de la hemaglutinación.

Palabras clave: Parotiditis, ELISA, anticuerpos IgM, técnica de inhibición de la hemaglutinación.

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ABSTRACT

BACKGROUND: parotiditis is an acute contagious disease that mainly affects children aged 5-14 years and requires rapid diagnostic techniques.
OBJECTIVES: a capture ELISA was standardized to detect IgM antibodies to parotiditis virus and this method was compared with hemagglutination inhibition.
METHODS: one hundred and seventy seven monosera and 285 serum pairs sent by the different provinces from January 2004 to December 2006, as part of the seroepidemiological surveillance of the parotiditis virus, were studied. They were analyzed by the hemagglutination inhibition technique and used for the system standardization. Accuracy of the test was determined and the cross reactivity to other viral agents was also studied.
RESULTS: the system evaluation yielded 98.9 % sensitivity, 98.5 % specificity and 98.7 % concordance; good relation was found in the variation coefficient values intra-assays and inter-assay for all the studied cases. No cross reactivity was observed with other infectious agents.
CONCLUSIONS: this system proved to be useful for the early diagnosis of parotiditis, more sensitive and rapid than the hemagglutination inhibition.

Key words: Parotiditis, ELISA, IgM antibodies, hemagglutination inhibition technique.

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INTRODUCCIÓN

La parotiditis es una enfermedad contagiosa aguda, caracterizada por un aumento de volumen sin supuración de una o ambas glándulas parótidas. Aparece fundamentalmente en niños en edad escolar entre 5 y 14 años.¹

En Cuba, en 1986, se aplicó por primera vez la inmunización contra la parotiditis formando parte de la vacuna triple viral: parotiditis, rubéola y sarampión (PRS). Desde esta fecha, se puso en práctica un programa para la eliminación de estos virus que disminuyó grandemente el número de personas positivas a esta entidad. A partir de 2004 se produjeron brotes en diferentes provincias del país en adolescentes mayores de 12 años y adultos jóvenes.²

En el Laboratorio Nacional de Referencia de parotiditis del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", la técnica actualmente utilizada para establecer el diagnóstico serológico de esta enfermedad es la inhibición de la hemaglutinación. Este ensayo demuestra que existe un aumento del título de anticuerpos de tipo IgG entre los sueros de las fases aguda y de convalecencia, para lo cual se debe tomar la muestra al inicio y de 2 a 3 semanas después del comienzo de los síntomas.³ A pesar de ser una prueba que se utiliza tradicionalmente por su alta especificidad en los resultados, presenta como desventaja el requerimiento de muestras de sueros pareados para su realización y constituye además una técnica demorada en su ejecución.

En la presente investigación, el propósito fue normalizar y aplicar un ELISA de Captura para la detección de anticuerpos de tipo IgM al virus de la parotiditis, porque es una técnica ampliamente usada en el campo virológico, que ofrece un resultado temprano de la enfermedad y a diferencia de la técnica de IH, requiere de un solo suero tomado en la fase aguda de la infección, que ofrece con fácil manejo, un diagnóstico rápido e indicativo a su vez, de una infección reciente.⁴

 

MÉTODOS

Muestras

El estudio fue realizado con 177 monosueros y 285 pares de suero procedentes de la vigilancia seroepidemiológica al virus de la parotiditis, estos fueron enviados por las diferentes provincias del país en el período comprendido entre enero de 2004 y diciembre de 2006, los cuales fueron recibidos en el Laboratorio Nacional de Referencia de Parotiditis del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí".

Técnicas empleadas

Técnica IH

Se realizó la técnica siguiendo el procedimiento descrito por Clarke y Casals en 1958.⁵

Criterio de positividad de infección por la técnica de IH

Se consideraron como casos positivos al virus de la parotiditis, aquellos pares de suero que presentaron seroconversión o aumento de 4 veces o más, del título de anticuerpos del segundo suero con respecto al primero.⁵

Tratamiento de las muestras con 2 a-mercaptoetanol

Los pares de sueros seleccionados como controles positivos estudiados por la técnica de IH fueron tratados con 2 a-mercaptoetanol, con el objetivo de determinar si había variación en el título de los anticuerpos IH después de tratados. Se tomaron 300 mL de los sueros a estudiar y se inactivaron a 56 °C por 30 min en baño de María (Gallenkamp). Posteriormente se añadieron 300 mL de la solución 2 a-mercaptoetanol 2M, se almacenaron a 4 °C durante toda la noche y quedaron listos para ser estudiados al día siguiente.⁶

Estandarización del sistema ELISA de captura de tipo IgM

Se emplearon placas de poliestireno (Maxisorp) de 96 pocillos, las cuales se recubrieron con 100 mL de IgG de carnero anti-IgM humana (Sigma, EE.UU.) a diferentes concentraciones (2,5, 5, 10, 15 mg/mL) diluidas en tampón carbonato bicarbonato pH= 9,6 con el objetivo de encontrar la dilución óptima de recubrimiento.

Para determinar la dilución de trabajo de los sueros, se realizaron diluciones 1/10, 1/15 y 1/20 en solución de tampón fosfato salina (PBS) y albúmina bovina sérica (ABS) 0,5 %; se escogió aquella dilución que mostró una mayor discriminación entre los sueros controles positivos y negativos.

La dilución óptima del antígeno fue determinada realizando las diluciones 1/10, 1/15, 1/20 y 1/25 en PBS suplementado con 5 % de suero humano negativo (SHN) de anticuerpos al virus de la parotiditis; se seleccionó la dilución que presentara una mejor discriminación entre los sueros controles positivos y negativos.

La conjugación se realizó por el método del peryodato según Nakane y Kawoi en 1974.⁷ Se efectuaron diluciones desde 1/500 hasta 1/2 000 con PBS y SHN 5 %; se escogió aquella que mostró una mayor discriminación entre los sueros controles positivos y negativos.

Procedimiento del ELlSA de captura de IgM

Se recubrieron las placas de poliestireno de 96 pocillos con 100 mL de anti-IgM humana, las cuales fueron diluidas en tampón carbonato/bicarbonato 0,05 M a pH= 9,6 y se incubaron a TA de 18 a 24 h en cámara húmeda. Al día siguiente se realizaron 5 lavados con PBS en un lavador Washer 430 (Biomérieux). Se le adicionaron 150 mL de solución de bloqueo (ABS 1 % + sacarosa 50 mg/mL) a todos los pocillos y se incubó 1 h a 37 °C en cámara húmeda. Luego se realizaron 5 lavados con PBS. Se colocaron 50 mL de los sueros controles positivos y negativos y 50 mL de los sueros a estudiar por duplicado diluidos en PBS + ABS 0,5 %. Después de 1 h de incubación a 37 °C en cámara húmeda se lavó 4 veces la placa con PBS-Tween 20 (T20) (BDH) 0,05 % y se añadieron 50 mL del antígeno diluido en tampón PBS más T20 0,05 % y SHN 5 %. Se incubó 1 h a 37 °C en cámara húmeda y se realizaron 4 lavados con PBS-T20, se añadieron 50 mL de conjugado diluido en tampón PBS 1X y SHN 5 %. Posteriormente se incubó 1 h a 37 °C en cámara húmeda y se realizaron 6 lavados. A continuación se añadieron 100 mL de sustrato (10 mL de tampón fosfato-citrato 0,1 M pH 5,0, 10 mg de ortofenilendiamina (OPD) (Merck) y 2 mL de peróxido de hidrógeno (BDH) 30 %), se incubó la placa 20 min a temperatura ambiente (TA) al abrigo de la luz y se detuvo la reacción con 100 mL de ácido sulfúrico (H₂SO₄) 12,5 %. La lectura se realizó en un lector de placas Reader 250 (Biomérieux) con filtro de longitud de onda de 492 nm y filtro de referencia de 620 nm.

Precisión del ensayo (repetibilidad y reproducibilidad del ELISA)

Se escogieron 12 pares de suero, previamente estudiados con el ELISA de captura de IgM en su validación, cuyos valores de densidad óptica (DO) fueron altos, medios, bajos y negativos; se incluyeron también en el estudio los controles positivos y negativos. Los ensayos se realizaron durante 3 d consecutivos en igualdad de condiciones, fueron repetidas 5 veces las muestras en diferentes posiciones dentro de la misma placa de reacción.

Estudio de la reactividad cruzada a otros agentes virales

Se estudiaron 85 muestras positivas de anticuerpos de tipo IgM a otros virus, como son: adenovirus, virus Epstein Barr, virus sincitial respiratorio, dengue, hepatitis, sarampión, rubéola y parainfluenza.

Análisis estadístico

Se determinaron los valores de sensibilidad, especificidad, concordancia, valor predictivo positivo (VPP), valor predictivo negativo (VPN), coeficiente de variación (CV), Índice de Kappa, razón de verosimilitud (RV), precisión (repetibilidad, reproducibilidad) del ensayo, así como el test t paramétrico, con el empleo para ello del paquete estadístico contenido en el programa GraphPad Prim 2.0 (1995). La interpretación en función del valor de p fue la siguiente: p= 0,05, no significativo (ns); p< 0,05, diferencia significativa.

 

RESULTADOS

La detección de anticuerpos de tipo IgM ha resultado de gran importancia en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. En el caso del virus de la parotiditis esta técnica es de extrema utilidad tanto en el diagnóstico de casos clínicamente sospechosos como en los sistemas de vigilancia epidemiológica para la enfermedad.⁸

Tratamiento de muestras con 2 a-mercaptoetanol para la búsqueda de controles positivos

En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos por la técnica IH en 13, de los 40 pares de sueros estudiados antes y después del tratamiento con 2 a-mercaptoetanol. Se observó en estos una ligera disminución en el título de los anticuerpos una vez recibido el tratamiento.

 

Estandarización del sistema ELISA de captura de tipo IgM

Los resultados obtenidos de los valores de DO a diferentes concentraciones de la anti-IgM, permitieron establecer 10 µg/mL como la concentración óptima de recubrimiento. Al estudiarse los controles positivos y negativos en las diferentes diluciones, se observó que la dilución 1/15 fue donde mejor relación positivo/negativo se obtuvo. La dilución del antígeno seleccionada fue 1/20 y en el caso de la dilución óptima del conjugado fue 1/1 500.

Estudio de las muestras tratadas con 2 a-mercaptoetanol mediante el ELISA de captura de IgM

Una vez establecidas las condiciones óptimas del ensayo se estudiaron los pares de sueros tratados con 2 a-mercaptoetanol mediante la técnica de ELISA de captura de tipo IgM ya normalizada, con el objetivo de comprobar la existencia de este tipo de anticuerpo en las muestras estudiadas. En la figura se observa una marcada disminución en los valores de DO de todas las muestras tratadas al ser comparadas con las obtenidas antes del tratamiento, lo que permite apreciar la utilidad del sistema en la detección de los anticuerpos de tipo IgM al virus de la parotiditis, con una diferencia significativa entre los valores de DO (p< 0,0001).

En el ensayo se definió un valor de corte de 0,150, (media más 3 desviaciones estándar, 0 + 3 DE), se consideró como positiva toda muestra que presentó valores de absorbancia por encima de este. Por causa de los cambios propios que se producen en los ensayos tipo ELISA, se consideraron dudosas todas aquellas muestras cuyo valor estuvo entre 0,130 y 0,149; se definió como negativa a la que poseía un valor de DO menor que 0,130.

Se establecieron 3 criterios de validez del sistema: la relación de la media de los positivos (Xp) y la de los negativos (Xn) debió ser igual o mayor que 5 (Xp > 5 Xn); la media Xn debió ser en todos los casos menor que 0,100 (Xn< 0,100) y, por último, el valor de Xp debió alcanzar un valor mínimo de 0,6 (Xp= 0,600).

Si estas condiciones no eran cumplidas, no se consideró válida la prueba.

Precisión del ensayo (repetibilidad y reproducibilidad del ELISA)

El estudio intraensayo se realizó durante 3 d consecutivos, con el coeficiente de variación (CV) en los rangos siguientes: 1,40-7,04; 1,18-4,40 y 1,11-7,54, respectivamente. En el estudio interensayo el rango del CV fue de 2,32-20,7.

Evaluación del ELISA de captura de tipo IgM

Se realizó el análisis de las muestras positivas mediante el ELISA/IgM con los resultados obtenidos en el primer suero (73,2 %; 71/97) y en aquellos casos donde este fue negativo, se tomó el resultado obtenido en el segundo suero (26,8 %; 26/97). Estas muestras que fueron negativas en el primer suero y positivas en el segundo, se tomaron en los 3 primeros días de iniciados los síntomas, lo cual no permitió que la IgM pudiera ser detectada por el ELISA de captura.

Al comparar los resultados del ELISA de captura de IgM con la IH, se obtuvieron los resultados presentados en la tabla 2. De las 232 muestras estudiadas, resultaron 97 positivas y 132 negativas por ambas técnicas y 3 discordantes, 1 muestra que fue positiva por IH y negativa por el ELISA y 2 que fueron positivas por el ELISA y negativas por IH.

Se obtuvo una sensibilidad de 98,9 % (IC 95 %, 96,9-100), una especificidad de 98,5 % (IC 95 %, 96,4-100) y una concordancia de 98,7 % (IC 95 %, 97,7-100). Los VPP y VPN fueron de 97,9 % (IC 95 %, 95,2-100) y 99,2 % (IC 95 %, 97,7-100), respectivamente. Se encontró 0,01 % (3/232) de discordancia.

El índice de Kappa obtenido en el estudio fue de 0,97 % (IC 95 %, 0,94-1,00), lo que representa una buena concordancia entre ambas técnicas.

La razón de verosimilitud (RV) positiva fue de 87,01 y la negativa fue de 0,01.

Reactividad cruzada del ELISA de captura de IgM a otros agentes infecciosos

Al realizar los estudios de reactividad cruzada a otros virus, se encontró que no hubo reactividad cruzada con ninguno de ellos.

 

DISCUSIÓN

Tratamiento de muestras con 2 a-mercaptoetanol para la búsqueda de controles positivos

En la tabla 1 se observó en los pares de suero una ligera disminución en el título de los anticuerpos una vez recibido el tratamiento, lo que probablemente se deba a la reducción que produjo el reactivo en el título de anticuerpos IgM presentes en los sueros estudiados.

Se consideró seleccionar a estos pares de suero como controles positivos en la normalización del ELISA de captura de IgM, porque su primer suero fue extraído en la fase aguda de la enfermedad y al ser estudiados por IH presentaron seroconversión; además porque se observó una disminución, aunque pequeña, en el título de anticuerpos después de tratados con 2 a-mercaptoetanol, lo que pudo ser por causa de la presencia de anticuerpos de tipo IgM. Apoyado todo esto por el diagnóstico clínico y epidemiológico de un cuadro típico de parotiditis.

Se ha reportado en la literatura que el tratamiento de los sueros con el 2 a-mercaptoetanol, técnica empleada por diferentes autores hace algunos años, permite, dada las propiedades reductoras que presenta, obtener una disminución del título de anticuerpos IgM, estos son fácilmente reducidos después del tratamiento.^6,9

Estudio de las muestras tratadas con 2 a-mercaptoetanol mediante el ELISA de captura de IgM

Se ha utilizado el 2 a-mercaptoetanol para distinguir entre los anticuerpos de tipo IgG y los de tipo IgM y como se planteó antes, estos últimos son los que se reducen más fácil con el tratamiento.⁶ Se conoce que para demostrar la presencia de anticuerpos de tipo IgM se requiere de una reducción de la DO de 4 veces o más en el suero después del tratamiento.⁶ Respecto a lo encontrado en el presente estudio, se pudo observar que en 94,4 % de las muestras se logró esta disminución en los valores de DO.

Precisión del ensayo (repetibilidad y reproducibilidad del ELISA)

Los valores obtenidos en el presente estudio muestran una buena relación en todos los casos según los criterios empleados por Foscecco y Curtis en 2003.¹⁰ Estos autores consideraron que la imprecisión intraensayo debía ser menor que 10 y de 20 % en el caso de la interensayo.

Evaluación del ELISA de captura de tipo IgM

Los resultados discordantes encontrados al comparar los 2 sistemas estudiados, fueron por causa de la presencia de falsos positivos por el ELISA/IgM y la baja o no respuesta de anticuerpos IgM después de la reactivación. Se ha planteado por diferentes autores que existe respuesta de anticuerpos de tipo IgM frente a agentes infecciosos diferentes, que pueden estar o no relacionados genéticamente, lo cual está condicionado por la presencia de infecciones víricas simultáneas o sucesivas, el empleo de antígenos que contienen epítopes comunes (por ejemplo, entre los parainfluenzavirus y virus de la parotiditis, o entre los diferentes enterovirus), por persistencia en el tiempo de estos anticuerpos, la estimulación clonal inespecífica de los linfocitos B o la reactivación de virus latentes con viremias asociadas.^11-13

En el caso de la muestra negativa por ELISA/IgM y positiva por IH, la cantidad de anticuerpos de tipo IgM que normalmente se producen después de una reactivación, ya sea por haber sido infectado de nuevo por el virus o por la vacunación, es menor que la producida en la infección primaria; esto depende de las características individuales de la respuesta inmune y de la sensibilidad del sistema empleado para el diagnóstico.¹⁴

La RV está acorde con lo reportado en la literatura, de que mientras más elevada sea la RV (+) en una prueba positiva, mucho mejor se considerará el ensayo para diagnosticar la enfermedad; y mientras más baja sea la RV (-) en una prueba negativa, mejor es la prueba para excluir la enfermedad. Como regla general, son útiles clínicamente las pruebas con RV (+) mayor que 10 y con RV (-) menor que 0,1.¹⁵

Los valores de sensibilidad y especificidad encontrados en el estudio fueron similares a los hallados por Warrener y otros en 2006 (sensibilidad: 98,8 %, especificidad: 100 %, VPP: 100 % y VPN: 98,5 %), quienes normalizaron un ensayo inmunoenzimático de captura de IgM al virus de la parotiditis utilizando muestras de suero y fluido oral.⁸ Meurman y otros reportaron en estudios realizados en ELISA de captura de IgM valores de sensibilidad de 96 %, con la utilización como muestra para el ensayo del suero en la fase aguda de la enfermedad, resultados semejantes a los encontrados en la presente investigación.¹⁶ A su vez, Perry y otros en un estudio similar reportaron datos de sensibilidad y especificidad entre 90 y 100 % para diferentes ensayos de detección de IgM al virus de la parotiditis, con el empleo en estos casos como muestra clínica de la saliva.¹⁷

Reactividad cruzada del ELISA de captura de IgM a otros virus

En investigaciones realizadas por Glikrman y otros en 1986, en 20 pacientes que presentaban enfermedades respiratorias causadas por el virus parainfluenza tipo-1, ninguno mostró una respuesta de anticuerpos IgM al virus de la parotiditis.¹⁸ Chomel y otros estandarizaron un ELISA de captura de anticuerpos de tipo IgM al virus de la parotiditis, con el objetivo de contar con un diagnóstico rápido y temprano ante la presencia de casos de meningitis, y no observaron reactividad cruzada a los virus parainfluenza tipo-1, 2 y 3.¹⁹

Se puede concluir que el ELISA de captura de IgM normalizado en nuestro estudio es un ensayo de gran utilidad para llevar a cabo el diagnóstico temprano de la parotiditis; resultando ser un sistema más fácil y rápido que la IH, técnica empleada hasta el momento en el laboratorio del IPK.

A pesar de la existencia de estuches comerciales de ELISA de captura de IgM al virus de la parotiditis, la normalización de este sistema en Cuba resulta de gran importancia, porque representa un gran ahorro económico por causa de su alto costo en el mercado internacional.

 

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Recibido: 22 de julio de 2008.
Aprobado: 4 de septiembre de 2008.

 

 

Dra. María de los Ángeles Ribas Antúnez. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí ". Autopista Novia del Mediodía Km 6 ^½_, La Lisa, Ciudad de La Habana, Cuba. Teléf.: 2020450. Correo electrónico: [e-mail]