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Introducción
Helicobacter pylori es la principal causa de cáncer gástrico (CG), especialmente de la parte distal del estómago y ha sido categorizado como carcinógeno humano tipo I. La infección por este microorganismo desencadena distintos grados y tipos de lesiones gástricas como gastritis crónica, la cual puede evolucionar a gastritis atrófica, metaplasia intestinal, displasia y finalmente cáncer.1H. pylori infecta aproximadamente a la mitad de la población mundial, pero solo una pequeña proporción desarrolla enfermedades de significación clínica. Del total de los pacientes infectados con H. pylori, aproximadamente un 5-6 % padecerá en ambos casos úlceras pépticas y menos del 1 % llegará a tener CG.2,3
Estudios recientes reportan diferencias en la prevalencia mundial de la infección por H. pylori entre países desarrollados (25-50 %) y aquellos en vía de desarrollo (50-90 %). La prevalencia de H. pylori es mayor en países de África (79,1 %), América Latina y el Caribe (63,4 %) y Asia (54,7 %); mientras que es menor en los países de América del Norte (37,1 %), Oceanía (24,4 %) y Europa (39,8 %). Dichas diferencias son explicadas por deficiencias en los sistemas de salud, baja higiene y a un menor nivel socioeconómico de los países en vías de desarrollo.3,4,5,6)
H. pylori es un bacilo gramnegativo, microaerofílico, que se transmite principalmente por vía fecal-oral u oral-oral en núcleos familiares, en los que factores como el hacinamiento, nivel socioeconómico bajo y mala higiene son determinantes.3,7 Después de la colonización del estómago, se produce un proceso inflamatorio crónico en el que tanto el grado de inflamación como el sitio de colonización de H. pylori, determinan el tipo de enfermedad gastroduodenal. La virulencia de H. pylori se asocia a la citotoxicidad provocada por un sistema de secreción tipo IV que está codificado por la región genómica de 37 kb denominada isla de patogenicidad Cag.8 Asimismo, el gen VacA se ha relacionado con un aumento en la virulencia, dado que la presencia del alelo i de este gen tiene una asociación significativa con la producción de CagA.9
A partir de la producción de estos factores de virulencia, se han clasificado las cepas de H. pylori en tres grupos: tipo I (CagA y VacA positiva), tipo II (CagA y VacA negativa) y cepas triple positiva (positiva para BabA, CagA y VacA).10 Las cepas tipo II y triple positiva se han reportado con una mayor virulencia que las cepas tipo I, y son las más virulentas y causantes de lesiones premalignas.11 La infección también induce una infiltración de neutrófilos, macrófagos y linfocitos B y T, pero a pesar de esta robusta respuesta inmunitaria, la infección persiste. La inflamación en el antro gástrico sin atrofia da como resultado hipersecreción ácida, la cual puede conducir a úlceras gastroduodenales, mientras que la gastritis atrófica en el cuerpo y antro se asocia a la úlcera gástrica y al posterior desarrollo de lesiones premalignas y al riesgo de padecer adenocarcinoma gástrico tipo intestinal o difuso.7,8,12,13,14,15
El proceso inflamatorio crónico que provoca la infección por H. pylori desencadena una cascada histopatológica que comienza con la aparición de gastritis crónica difusa. Posteriormente, la gastritis crónica difusa da origen a lesiones premalignas. Finalmente, se puede desarrollar el adenocarcinoma gástrico tipo intestinal o difuso.13,14,15 Cada lesión premaligna se clasifica según el grado de gravedad o progresión usando el sistema histológico Operative Link on Gastritis/Intestinal-Metaplasia Assessment (OLGA y OLGIM).15,16
En Guatemala, se han realizado pocos estudios sobre la prevalencia de los genes de virulencia de H. pylori y su relación con gastritis, lesiones premalignas y CG. El presente estudio tiene como propósito identificar las lesiones premalignas gástricas y su relación con la infección por H. pylori, que presentan los genes de virulencia CagA y VacA, en pacientes sintomáticos que acudieron a las unidades de gastroenterología de dos hospitales de la Ciudad de Guatemala.
Métodos
El estudio se realizó en las unidades de consulta externa de gastroenterología de los hospitales General San Juan de Dios y Roosevelt de la Ciudad de Guatemala. A todos los pacientes que accedieron a participar, se les solicitó la firma del consentimiento informado para la obtención de muestras de biopsias gástricas y sangre periférica. Además, se revisaron datos clínicos y datos demográficos de los expedientes médicos en relación con la infección por H. pylori.
Recolección de muestra: Las biopsias gástricas fueron tomadas de las regiones del antro y cuerpo por medio de una endoscopía llevada a cabo por un médico gastroenterólogo. Las biopsias obtenidas fueron transportadas en pocillos tipo cassette al Centro de Investigaciones Biomédicas en cadena de frío a -20 °C y posteriormente fueron almacenadas en congelador a -70 °C. Además, se tomó una muestra de 10 mL de sangre periférica, que fue almacenada en un tubo con anticoagulante. Las biopsias para diagnóstico histopatológico, posteriormente fueron conservadas en formol. Las muestras de sangre periférica fueron almacenadas a -20 °C para el diagnóstico serológico. Las biopsias destinadas al diagnóstico de H. pylori por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fueron almacenadas en solución buferada fosfatada (PBS).
Diagnóstico histopatológico: En el Laboratorio de Patología una de las biopsias se conservó en formol para efectuar las tinciones de H & E y de Giemsa. El diagnóstico histopatológico fue realizado por un médico patólogo, utilizando para ello la clasificación de OLGA para gastritis y OLGIM para metaplasia intestinal.11,13 Cada lesión premaligna fue clasificada según el grado de gravedad o progresión. De tal manera, la atrofia gástrica fue clasificada a partir del sistema OLGA, con grados de gravedad de 0 hasta IV: OLGA III y IV fueron las de mayor riesgo para CG. Asimismo, la metaplasia intestinal gástrica se clasificó según el sistema OLGIM (Operative Link on Gastritis/Intestinal-Metaplasia Assessment), la cual se basa en función del riesgo estratificado y progresión a CG: los grados OLGIM III y IV fueron los de mayor riesgo. Por último, la displasia epitelial gástrica se clasificó en bajo y alto riesgo con respecto a la progresión a CG.11,13 En el presente estudio se selecciona como la definición de caso la combinación de diagnóstico histológico y de cultivo.
Diagnóstico de H. pylori por cultivo: Las biopsias conservadas en cadena de frío fueron trituradas de forma homogénea en un tubo Eppendorf con 100 µL de solución salina, 50 µL del triturado se inocularon en agar Columbia suplementado con un 5 % de sangre de carnero e incubadas en una jarra BD BBL GasPak (BD, Estados Unidos) con condiciones de microaerofilia a 37 °C por 8 días. Los cultivos positivos compatibles con H. pylori fueron inoculados en agar sangre para obtener colonias aisladas e incubados por 8 días más. La presencia de H. pylori se confirmó por medio de pruebas de la ureasa y oxidasa.
Diagnóstico de H. pylori por serología: Se llevó a cabo el estudio serológico mediante un ensayo de fase sólida acoplado a enzimas (ELISA) usando el kit H. pylori IgG ELISA (HP013G, Calbiotech, Estados Unidos). Se separó el suero de la sangre periférica por medio de centrifugación. El suero sanguíneo fue almacenado en congelación a -20 °C hasta el momento del análisis. Las muestras fueron analizadas siguiendo las instrucciones del fabricante. La lectura se realizó en un lector de ELISA modelo Stat Fax 2100 ELISA Microplate Reader (Awareness Technology, Estados Unidos) a una longitud de onda de 45 nm.
Diagnóstico de H. pylori por PCR: Las biopsias almacenadas en PBS, se procesaron para la extracción de ADN, con amortiguador de lisis Tris EDTA (TE) (50 mmol/L TRIS, 1 mmol/L EDTA pH 8,5), con Tween 20 al 0,5 % y 200 µg/mL de proteinasa K. Las muestras fueron incubadas durante 12 horas a 55 °C. Al finalizar las 12 horas de incubación, la proteinasa K fue inactivada con un aumento de temperatura a 90 °C por 10 min. El diagnóstico molecular de H. pylori se realizó mediante la amplificación de glmM y se realizó una genotipificación de los genes CagA y VacA, por medio de PCR múltiple usando cebadores previamente descritos (Tabla 1).14
La mezcla de reacción de PCR se realizó con un volumen final de 50 µL, Hot Start Taq Polimerasa xs 1,25 U, cebadores VAI y VAG 25 µmol, cebadores CAG 10 µmol. La PCR se llevó a cabo en un termociclador modelo GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Las condiciones de reacción fueron: desnaturalización inicial a 94°C por 10 min, 40 ciclos a 94 °C por un minuto, alineamiento a 58 °C por un minuto, extensión inicial a 72 °C por un minuto y extensión final a 72°C por 10 minutos. Los amplicones fueron visualizados con bromuro de etidio por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1 %, marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder (G210A, Promega) y buffer de carga Blue/Orange 6X Loading Dye (G190A, Promega), y un transiluminador UV. La interpretación de resultados se realizó como se indica en la figura 1.
Tabla 1 Secuencias de cebadores
| Región amplificada | Oligo | Secuencia de oligonucleótido | Tamaño de amplicón (pb) |
|---|---|---|---|
| vacAs1/vacAs2 | VAI-F | 5’-ATGGAAATACAACAAACACAC-3’ | 259/286 |
| VAI-R | 5’-CTGCTTGAATCGCGCCAAAC-3’ | ||
| vacAm1/vacAm2 | VAG-F | 5’-CAATCTGTCCAATCAAGCGAG-3’ | 567/642 |
| VAG-R | 5’-GCGTCAAAATAATTCCAAGG-3’ | ||
| cagA | CagA-F | 5’-GATAAACAGGCAAGCTTTTGA-3’ | 350 |
| CagA-R | 5’-CTGCAAAAGATTGTTTGGCA-3’ | ||
| glmM | glmM-F | 5’-GGATAAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGG-3’ | 300 |
| glmM-R | 5’-GCATTCACAAACTTATCCCCAATC-3’ |
Fig. 1 Interpretación de resultados de diagnóstico molecular por PCR múltiple. Línea 1: marcador de peso molecular (100bp DNA Ladder); línea 2: control negativo; líneas 4, 5 y 6: VacA M2 (642 pb), CagA (350 pb) y VacA S1 (259 pb).
Análisis estadístico: Se empleó la prueba de chi-cuadrado para analizar la relación entre variables clínicas, demográficas y la infección por H. pylori.
Resultados
En la tabla 2 se presentan las características demográficas y clínicas de los pacientes estudiados. Se evaluaron 353 casos de los cuales el 76 % corresponde a pacientes femeninos. El mayor número de casos femeninos estudiados fue de 46-55 años; mientras que el número de casos masculinos se distribuyeron de manera homogénea por edad. No se encontraron asociaciones significativas entre la infección por H. pylori y las características demográficas o la presencia de lesiones premalignas. De los 353 pacientes evaluados, 204 casos fueron positivos para la infección por H. pylori, por lo que la prevalencia de infección por H. pylori fue del 58 %. De estos casos el 43 % de los pacientes femeninos presentaron infección por H. pylori. El mayor número de casos evaluados provenía de la región metropolitana 309 (88 %); mientras que otras regiones presentaron un menor número de casos.
Tabla 2 Características demográficas de la población de estudio e infección por H. pylori
| Características | n | |
|---|---|---|
| Infección por H. pylori | ||
| Positiva | 204 | |
| Negativa | 149 | |
| Infección por H. pylori | ||
| Sexo | Positiva | % |
| Femenino | 152 | 56,7 |
| Masculino | 52 | 61,2 |
| Infección por H. pylori positiva | ||
| Rango de edad (años) | Femenino | Masculino |
| 15-25 | 9 | 7 |
| 26-35 | 20 | 11 |
| 36-45 | 25 | 7 |
| 46-55 | 50 | 8 |
| 56-65 | 31 | 11 |
| Más de 66 | 17 | 8 |
En la tabla 3 se presentan los resultados del diagnóstico de H. pylori a partir de las pruebas de histopatología, cultivo, serología (IgG) y PCR. Además, incluye los valores predictivos negativo y positivo para cada prueba. Las pruebas diagnósticas que proporcionaron el mayor número de resultados positivos fue la combinación histopatológica + cultivo, mientras que la prueba serológica (IgG) y la de PCR fueron las pruebas con menor cantidad de positivos. La prueba histopatológica presentó los valores más altos en valor predictivo negativo y valor predictivo positivo.
Tabla 3 Detección de la infección por H. pylori a partir de cuatro pruebas diagnósticas
| Resultado | Prueba diagnóstica | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Histopatología | Cultivo | Serología (IgG) | PCR | Histopatología y cultivo | |
| Positivo | 158 | 124 | 131 | 127 | 204 |
| Negativo | 195 | 229 | 222 | 226 | 149 |
| VVP (%) | 98,73 | 96,77 | 95,42 | 97,64 | - |
| VPN (%) | 76,41 | 65,07 | 67,12 | 65,93 | - |
| Total | 353 | 353 | 353 | 353 | 353 |
La tabla 4 contiene los resultados obtenidos para la identificación de los genes CagA y VacA y su genotipificación. El genotipo más frecuente fue CagA+/M1S1, seguido de CagA-/M2S2. Los genotipos CagA-/M1S1 y CagA+/M2S2 fueron las menos frecuentes.
Tabla 4 Gen CagA y tipificación del gen VacA en cepas de H. pylori
| Genotipo VacA | Gen CagA | |
| CagA + n (%) | CagA - n (%) | |
| M1S1 | 91 (72) | 8 (6) |
| M2S2 | 1 (1) | 27 (21) |
La asociación entre los tipos de lesiones premalignas y la infección por H. pylori se presenta en la tabla 5. De los 353 casos estudiados, 293 presentaron alguna lesión premaligna (atrofia, metaplasia y displasia), lo que corresponde al 83 % de casos estudiados. La lesión premaligna más frecuente fue la atrofia gástrica con 249 casos (70 %), seguida de metaplasia intestinal gástrica con 38 casos (11 %) y la displasia con 6 casos (2 %). La mayoría de los pacientes con lesiones premalignas gástricas presentaron la infección por H. pylori: atrofia (62 %), metaplasia intestinal (66 %) y displasia epitelial gástrica (67 %). La edad media para presentar lesiones premalignas fue de 56 años.
Discusión
La infección por H. pylori representa un importante problema de salud pública en todo el mundo. Estudios anteriores indican que la prevalencia de la infección es mayor en regiones de África (79,1 %), América Latina y el Caribe (63,4 %), América Central (53 %) y Asia (37,1 %).4 En Guatemala se ha constatado una elevada prevalencia de la infección por H. pylori (65 %), por lo que los resultados del presente estudio coinciden con el reporte de Matta de Gracia.5 En cambio, la prevalencia encontrada en este país resulta superior a la encontrada en otros países de América como México (52,4 %) y Panamá (54,1 %).6,18,19) Alonzo y otros, en 2009, reportaron que 778 pacientes presentaron la infección por H. pylori de un total de 1468 pacientes, correspondiente al 53 %.
También notifican que 415 (28,3 %) pacientes presentaron gastritis crónica no atrófica, y esta fue la afección gástrica más frecuente.20 En 2018 se reportaron 1797 nuevos casos de CG en Guatemala, que ocupó la segunda posición en incidencia, solamente detrás del cáncer de próstata. Se informaron, además, 1535 muertes y una prevalencia de la enfermedad en los últimos 5 años de 2190 casos por cada 100 000 habitantes.21 Otro aspecto importante es que, como se ha descrito anteriormente, no se encontró una asociación significativa entre el sexo del paciente y la infección por H. pylori (Tabla 2). Asimismo, la edad y la infección por H. pylori no presentaron una asociación estadística significativa, lo cual contrasta con reportes que indican que, tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo, la infección por H. pylori es más común en la población adulta. A pesar de ello, la edad media para presentar lesiones premalignas fue de 56 años, lo que sugiere una relación entre la infección y el desarrollo de lesiones premalignas en la población adulta.3,22
Con respecto a las pruebas serológicas, es importante destacar que, a pesar de tener una sensibilidad alta, estas poseen una baja especificidad, razón por la que se puede obtener un alto número de resultados falsos positivos. Ejemplo de ello es el estudio realizado por Duquesne y otros quienes hallaron un 28,3 % de falsos positivos para la serología por IgG.22 Sin embargo, en este estudio se encontró una buena correlación entre el cultivo y la serología. En el caso de nuestro estudio, el mayor número de falsos negativos se encontró en la prueba de cultivo y del PCR. Es interesante resaltar que la combinación de la prueba de cultivo y el resultado histopatológico identificó el mayor número de casos positivos en nuestro estudio, en comparación con las otras pruebas.
Se ha comunicado que la histopatología en combinación con cultivo permiten identificar con certeza los casos positivos de H. pylori.23 Por ese motivo, se selecciona como la definición de caso en este estudio. Los cebadores seleccionados para la amplificación del gen glmM dan como resultado de la amplificación, un fragmento de 300 pb. Este gen se ha descrito como un gen constitutivo, por lo que es de suma utilidad para detectar la infección por H. pylori,17 a pesar de que en nuestro estudio la prueba de PCR tuvo una menor sensibilidad, presentando un valor predictivo negativo de 65,93 %, aunque una buena especificidad. Esto mostró un valor predictivo positivo del 97,64 % para el diagnóstico de infección por H. pylori, al ser comparada con la definición de caso, por lo que actualmente se recomienda su uso combinado con la histopatología para el diagnóstico de esta infección.24) Las pruebas moleculares se emplean para una detección más rápida y específica de H. pylori. Dichas pruebas también permiten cuantificar la carga bacteriana y la detección de resistencia a antibióticos como la claritromicina, por lo que recomendamos estudios que evalúen su utilidad para diagnóstico en Guatemala.25,26
Las técnicas basadas en PCR cuentan con la ventaja de poder detectar diferentes factores de virulencia como los genes CagA y VacA. En el presente estudio el genotipo más frecuente correspondió a CagA+/M1S1 (72 %). Dicho genotipo tiene una alta asociación con la presencia de lesiones premalignas y representa un factor de riesgo para el desarrollo de lesiones premalignas y progresión a CG.27,28,29,30
Los resultados histopatológicos obtenidos (Tabla 5) son similares a los presentados en un estudio realizado en Perú en que la frecuencia de la infección por H. pylori fue del 76,5 % para pacientes con atrofia gástrica, 65,5 % para aquellos con metaplasia intestinal completa, 55,4 % para metaplasia intestinal incompleta y 16,7 % para displasias; para una relación total del 61 % entre infección y presencia de lesión premaligna.11 Se ha reportado que el riesgo de progresión de lesiones premalignas a CG asociadas a H. pylori depende de la duración, distribución y gravedad de la enfermedad para el desarrollo de CG.31 Por ello recomendamos que en Guatemala se lleven a cabo más estudios prospectivos longitudinales en los que se evalúe la relación entre la infección de H. pylori con las lesiones premalignas y CG. Finalmente, los altos porcentajes de infección por H. pylori asociados a lesiones premalignas sugieren que en Guatemala se deben realizar esfuerzos para erradicar la infección en los pacientes que presentan lesiones premalignas. Estudios previos reportan que programas de erradicación de la infección en pacientes que presentan lesiones premalignas en etapas tempranas previene la progresión a CG, por lo que se debe considerar entre las estrategias de prevención en Guatemala junto a proyectos que evalúen el costo-beneficio de la implementación de programas de detección sistemática y periódica.32,33,34
Sabemos que el presente estudio tiene ciertas limitantes, como una predominante población urbana de la zona metropolitana. A pesar de que no se encontraron asociaciones significativas entre la infección por H. pylori y las características demográficas o la presencia de lesiones premalignas, también es importante señalar que el tamaño de la muestra y su distribución es otra limitante. Por lo tanto, recomendamos que se lleven a cabo estudios con tamaños de muestra mayores y más representativos, con un énfasis regional o departamental que pudiera representar de mejor manera la heterogeneidad étnica y diferentes parámetros demográficos de Guatemala.
