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Introducción
La OMS considera al VIH uno de los mayores problemas de salud pública a nivel global. Solo en el 2017 se presentaron 1,8 millones de casos nuevos.1 Ecuador se encuentra entre los países de la región de las Américas con las tasas más altas de prevalencia de la infección por el VIH -338 por 100 000 habitantes-, lo cual representa la séptima causa de muerte general, con una tasa de mortalidad de 7,15 por 100 000 habitantes.2
El Ministerio de Salud Pública ecuatoriano declaró al VIH como una epidemia,3 que en el 2017 reportaba 36 000 habitantes infectados, entre niños y adultos,2 y existían grupos de riesgo en todas las poblaciones: hombres que tienen relaciones con hombres, mujeres embarazadas, individuos que tienen sexo con parejas ocasionales4 y el consumo de drogas intravenosas,5 entre otros factores que predisponen al contagio del virus y a la susceptibilidad de infección por diversos patógenos oportunistas como Cryptosporidiumspp.6
Este parásito se caracteriza por causar infecciones gastrointestinales y respiratorias, con diferentes rutas de transmisión que abarcan tanto la vía zoonótica como de persona a persona.7 Afecta a individuos inmunocompetentes e inmunocomprometidos y, aunque se le reconoce mayoritariamente por sus síntomas gastrointestinales, también abarca diferentes manifestaciones pulmonares de las cuales existe muy poca información acerca de su prevalencia.8
Entre los individuos inmunocomprometidos que tienen elevado riesgo de ser infectados por Cryptosporidium spp. se encuentran pacientes con hipogammaglobulinemia, receptores de trasplantes, deficientes en IgA, y pacientes con VIH;9,10 no obstante, existe mayor vulnerabilidad en los pacientes con VIH con conteos de linfocitos T CD4+ menores de 100 células/µL.11,12 En los últimos años el número de casos de criptosporidiosis en pacientes con VIH ha disminuido, debido a la reconstitución inmunitaria con terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA).13 Sin embargo, aún existen numerosos sectores de recursos limitados, cuyos programas no cubren a todos los infectados, especialmente en América Latina.14 Los síntomas que se han reportado mayoritariamente en infecciones pulmonares consisten en tos crónica, disnea y fiebre.15
Las infecciones pulmonares se suelen identificar mediante muestras obtenidas por lavado broncoalveolar (BAL), esputo y biopsias pulmonares, a través de microscopía por tinción de Ziehl-Neelsen e inmunoensayos como ELISA y EIA.16,17,18,19 Aunque la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más adecuada para su identificación debido a su alta sensibilidad y especificidad, los elevados costos de la prueba impiden que se logre implementar en todas las comunidades.17,20
La necesidad de establecer las características clínicas más frecuentes dela infección por Cryptosporidiumspp y su asociación con la presencia del parásito han motivado este estudio. El propósito es detectar Cryptosporidium spp. en el lavado broncoalveolar (BAL) de pacientes VIH positivos y con síndrome respiratorio.
Métodos
Se realizó un estudio de corte transversal, observacional, en el periodo de junio de 2013 a septiembre de 2014 en el Hospital de Infectología Dr. José Daniel Rodríguez Maridueña. Esta unidad hospitalaria pertenece a la red de salud estatal para el tratamiento de pacientes con VIH/sida, y está situado en la ciudad de Guayaquil, que queda en la región costera del país a 4 m sobre el nivel del mar.
Las muestras de esputo se habían obtenido para detectar Pneumocystis jiroveci por PCR en un estudio previo e iban a ser descartadas, por lo que se decidió investigar también la presencia de Cryptosporidium spp. El universo estuvo constituido por todos los pacientes con enfermedad respiratoria que acudieron al Hospital y cumplieron con los criterios de inclusión/exclusión. Los criterios de inclusión fueron pacientes con VIH/sida, mayores de 18 años y sintomatología clínica respiratoria. Los criterios de exclusión consistieron en desestimar las muestras inadecuadas para el procesamiento.
Los procedimientos fueron desarrollados en los laboratorios de microbiología de la Universidad de Especialidades Espíritu Santo (UEES) y de Biología Molecular del Centro de Referencia de Parasitología del Instituto de Investigación en Salud Pública (CRNP-INSPI).
Se recolectaron 60 muestras de lavado BAL pertenecientes a pacientes con VIH/sida con sintomatología respiratoria. Las muestras fueron obtenidas mediante broncoscopía por un profesional competente, utilizando solución salina al 9 % y trampas de moco. Además, se recolectaron los respectivos datos clínicos y epidemiológicos como edad, sexo, procedencia, enfermedades coexistentes y hábitos, anotados en la historia clínica de cada paciente.
Tinción con Ziehl-Neelsen
Las muestras fueron separadas en dos alícuotas: una se envió al Laboratorio de Microbiología para ser teñida con Ziehl-Neelsen modificado y observada por microscopía a un objetivo de 100x, y la otra fue enviada al Laboratorio de Biología molecular para la extracción del ADN.18
Obtención de ADN genómico
Para el procedimiento se utilizó un estuche comercial DNeasy® Blood & Tissue Handbook, de Qiagen ®. El ADN extraído se almacenó a -80°C hasta su amplificación por la PCR.
Protocolo de amplificación por PCR de punto final
Se amplificaron las muestras de ADN mediante el método de Yu y otros, 2009, modificado.21 Se realizó una PCR anidada (nPCR) que se dirige al gen COWP utilizando por cada muestra dos conjuntos cebadores externos (Fig. 1).
Leyenda: M1: marcador de peso molecular 100 pb; cont N: control negativo.
Fig. 1 -Gel de agarosa, muestra N.o 40 positiva (marcada por la flecha), primera PCR para Cryptosporidium sp., con 796 pb. Control positivo N.° 638-2.
Para la primera PCR se utilizaron BCOWP-F 5'-ACCGCTTCTCAACAACCATCTTGTCCTC-3' y BCOWP-R 5'-CGCACCTGTTCCCACTCAATGTAAACCC-3'. La primera PCR se realizó en un volumen total de 50 µL, que contenía agua 28 µL; buffer PCR 10 por 5 µL; MgCl2 50 mM 1,5 µL; dNTP 2 mM 5 µL; 2,5 µL de cada cebador, taq polimerasa 0,5 µ y ADN 5 µL. Las condiciones de amplificación en la primera PCR fueron: primera etapa, un ciclo de 2 min a 98 °C, segunda etapa de 30 ciclos por 50 s a 94 °C, 30 s a 55 °C y 50 s a 72 °C, respectivamente; tercera etapa a 10 min a 72 °C, última etapa a 4 °C. El fragmento obtenido fue de fue de 796 pb.18
Para la segunda PCR se utilizaron cry-15- F 5'-GTAGATAATG-GAAGAGATTGTG-3' y cry-9-R 5'-GGACTGAA ATACAG-GCATTATCTTG-3'. La segunda PCR se realizó en un volumen total de 50 µL, que contenía agua 31 µL; buffer PCR 10 x 5 µL; MgCl2 50 mM 1,5 µL; dNTP 2 mM 5 µL; 2,5 µL de cada cebador, taq polimerasa 0,5 u y ADN 2 µL. Las condiciones de amplificación en la segunda PCR fueron desnaturalización, 98 °C por 2 min; 30 ciclos, 94 °C por 60 s, 48 °C por 30 s, 72°C por 1 min; una extensión final a 72 °C por 10 min. Tercera etapa a 10 min a 72 °C, última etapa a 4 °C. El fragmento obtenido fue de 553 pb.18
Verificación de la amplificación
Se usó TAE 1x como tampón de corrida, al gel de agarosa se le adicionó 10 µL del colorante Syber® 1x (10 000x) (invitrogenThermo Fisher Scientific, USA). Como tampón de carga se utilizó Blue/orangeLoadingDye 6x (Promega, USA), como marcador de peso molecular TracKltTM 100 bp (0,1 µg/L). Como controles positivos, se utilizó ADN de Cryptosporidium spp. del Centro de referencia de Parasitología extraído de muestras de heces positivas para Cryptosporidium por QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Qiagen) y como controles negativos agua grado biología molecular Invitrogen™ Agua destilada UltraPure™ sin ADNasa/ARNasa.
La corrida electroforética se realizó con la fuente de poder marca Biorad (BioRadPowerPac™HC, USA) a 80 V por 55 min. Los resultados se visualizaron en un fotodocumentador (Biorad Chemi Doc XRS, BioRad, USA), para lo cual se utilizó el programa Quality One, incluido en la plataforma del fabricante.
Aspectos éticos
El procedimiento detallado y su finalidad fueron explicados a los individuos participantes, que ratificaron su aprobación a través de la firma del consentimiento informado. El estudio fue examinado y aprobado por el Comité de Ética del Hospital Clínica Kennedy, reconocido por las autoridades del Ministerio de Salud Pública de Ecuador.
Análisis estadístico
La información se registró en una base de datos de Microsoft Excel 2010 (14.0) y posteriormente se realizó el análisis con el software estadístico IBM SPSS 20.0. Se realizaron tablas de resultados con las frecuencias en porcentajes, se obtuvo el valor p y se realizó un chi cuadrado con corrección de Fisher.
Resultados
Entre el periodo de junio 2013 a septiembre 2014, se recolectaron 60 muestras de individuos que cumplieron con los criterios de inclusión y exclusión. La tabla 1 muestra las características epidemiológicas de los individuos estudiados. El 73% de la población estudiada fueron hombres.
Tabla 1 - Características epidemiológicas de los pacientes con VIH/sida incluidos en el estudio
| Características epidemiológicas | No. | % |
| Sexo | ||
| Hombres | 44 | 73,33 |
| Mujeres | 16 | 26,67 |
| Factores de riesgo | ||
| Histoplasmosis | 2 | 3,33 |
| Hipertensión arterial* | 3 | 5,00 |
| Diabetes mellitus* | 3 | 5,00 |
| Tuberculosis* | 16 | 26,67 |
| Neumocistosis* | 25 | 41,66 |
| Alcohol | 14 | 23,33 |
| Tabaco | 8 | 13,33 |
| Uso de drogas recreativas | 5 | 8,33 |
| Origen | ||
| Urbano | 40 | 66,67 |
| Rural | 20 | 33,33 |
*Enfermedad actual.
Fuente: Historia clínica.
En la tabla 2 se recogen las características clínicas de los pacientes estudiados. El 81,67 % presentaron alza térmica, el 60 % sufría de tos crónica y el 41,65 % disnea. En cuanto a las características clínicas obtenidas mediante laboratorio destaca que el 73,08 % de los individuos tuvieron valores de hemoglobina por debajo del intervalo de referencia.
Tabla 2 -Características clínicas de los pacientes con VIH/sida incluidos en el estudio
| C aracterísticas clínicas | No. | % |
|---|---|---|
| Signos | ||
| Alza térmica | 49 | 81,67 |
| Diaforesis | 9 | 15,00 |
| Expectoración | 30 | 50,00 |
| Disnea | 25 | 41,67 |
| Signo de Muguet | 1 | 1,67 |
| Aleteo nasal | 0 | 0,00 |
| Tiraje intercostal | 1 | 1,67 |
| Respiración paradójica | 0 | 0,00 |
| TARGA | 60 | 100,00 |
| Frecuencia respiratoria ≥ 20 respiraciones/min | 15 | 25,00 |
| Síntomas | ||
| Tos | 36 | 60,00 |
| Dolor torácico | 12 | 20,00 |
| Escalofríos | 30 | 50,00 |
| Diarrea | 23 | 38,33 |
| Astenia | 16 | 26,67 |
| Auscultación | ||
| Normal | 9 | 15,00 |
| Crepitante | 5 | 8,33 |
| Hipoventilado | 2 | 3,33 |
| Datos de laboratorio | ||
| Hematócrito ≤ 35 % | 27 | 45,00 |
| Hemoglobina ≤ 12 g/dL | 38 | 63,33 |
| Leucocitos ≤ 4 x 109/L | 8 | 13,33 |
| Patrón radiográfico | ||
| Normal | 1 | 1,67 |
| Intersticial | 7 | 11,67 |
| Miliar | 1 | 1,67 |
| Mixto | 0 | 0,00 |
| Condensación | 1 | 1,67 |
Fuente: Historia clínica.
Todos los pacientes tuvieron recuentos de T CD4 + por debajo de 150 y todos habían sido diagnosticados con HIV más de 5 años atrás. De las 60 muestras analizadas con PCR, 3 fueron positivas para Cryptosporidium spp. (Figs. 1 y 2), con una prevalencia del 5 % con mayor presentación en el grupo etario de 31-40 años, seguido del grupo de 41 a 50 años. En la observación microscópica de las láminas teñidas con Ziehl-Neelsen. no se encontraron parásitos ni se observaron bacilos ácido alcohol resistentes (Tabla 3).
Leyenda: M1: marcador de peso molecular 100 pb; cont N: control negativo.
Fig. 2 -Gel de agarosa, segunda PCR para amplificación de Cryptosporidium spp., muestra N.o 27588 positiva (marcada por la flecha), con 553 pb. Controles Positivos 1:10 y 1:100.
Tabla 3 -Presencia de Cryptosporidium spp. en muestras de BAL de acuerdo con el grupo etario
Fuente: Historia clínica.
Las tres muestras positivas para Cryptosporidium spp. pertenecían a dos hombres y a una mujer, pero no se encontró relación estadísticamente significativa con la variable sexo. En cuanto a las demás características epidemiológicas y clínicas, no se observó asociación con ninguna de las variables descritas, y ninguno de los tres pacientes positivos presentó tuberculosis ni un patrón radiográfico anormal.
Dos de los individuos positivos para VIH y Cryptosporidium spp. eran de origen urbano, entre los signos y síntomas frecuentes que presentaron se encontró: alza térmica, disnea y tos; entre las características de laboratorio destacó que todos los individuos presentaban Hb ≤ 12 g/dL, dos individuos con un hematócrito ≤ 35 % y leucocitos ≤ 4 x 109/L. Únicamente el 3 % de los individuos del total de la población tenían tratamiento con TARGA.
Discusión
Cryptosporidium spp. es un parásito que afecta al aparato intestinal y al respiratorio en niños y adultos, y es más conocido por causar diarrea19 que como causa de problemas respiratorios, por lo que existe un bajo número de casos reportados de criptosporidiosis extraintestinal.20 Las complicaciones respiratorias con antecedentes de criptosporidiosis intestinal son comunes en pacientes inmunodeprimidos,21 especialmente los infectados con VIH. Sin embargo, existen pocos casos donde solo se presenten síntomas respiratorios.22,23
Se postula que el medio de transmisión de criptosporidiosis pulmonar incluye la inhalación de oosquistes de Cryptosporidium spp. expulsados a través de la tos provenientes de un individuo infectado.24
Recientemente, los métodos de PCR e inmunodiagnóstico se han vuelto más populares en el diagnóstico de la criptosporidiosis para superar las limitaciones de la microscopía. En comparación con la microscopía, los métodos de detección basados en el ADN presentan varias ventajas, como una mayor sensibilidad y especificidad, la posibilidad de tipificación molecular y un tiempo de respuesta optimizado.25
Se han comparado las sensibilidades diagnósticas de las pruebas de rutina, lo que demuestra el rendimiento superior de la microscopía de inmunofluorescencia y la PCR sobre los rendimientos comparables de los EIA y las tinciones fluorescentes, que a su vez fueron mejores que la tinción ácido-resistente y los ensayos inmunocromatográficos de flujo lateral.25
En este estudio la prevalencia por microscopía fue menor que la encontrada en otro estudio en Malasia donde se observó una prevalencia del 16 % por PCR y del 5 % por microscopía26 y mayor que la del estudio en Uganda, donde se detectó, mediante PCR de muestras de esputo, prevalencias del 1,3 % en pacientes con VIH comparado con el 4,4 % de pacientes sin VIH.28 Pero fue similar a la observada en la República Democrática del Congo con un 5,4 % por PCR-RFLP y 4,1 % por microscopía.27
En Recife, de un total de 130 pruebas de esputo realizadas hasta el momento, Cryptosporidium spp. fue el único agente identificado en 2 (1,5 %) de esos pacientes; el diagnóstico se realizó mediante la identificación de ooquistes de Cryptosporidium spp. en el examen de esputo teñido con Ziehl-Neelsen.21
El bajo número de casos diagnosticados de criptosporidiosis extraintestinal, especialmente de localización pulmonar, se debe en gran parte a la ausencia de signos clínicos específicos, así como a la presencia de anomalías radiológicas que pueden confundirse con otras infecciones oportunistas que suelen afectar a pacientes con otras inmunodeficiencias.28
La enfermedad pulmonar es una rara manifestación extraintestinal de la infección por Cryptosporidium y su presencia en un huésped inmunocompetente la hace aún más rara.22 Las manifestaciones clínicas de la criptosporidiosis pulmonar son inespecíficas y suelen incluir tos crónica, fiebre y disnea como síntomas más frecuentes, con o sin cambios radiológicos.23
En las variables epidemiológicas y clínicas no se encontró una asociación estadísticamente significativa con Cryptosporidium spp., lo que concuerda con estudios donde se menciona la falta de especificidad de sus signos clínicos y patrones radiográficos comúnmente confundidos con otras infecciones oportunistas.24
Dos de los tres individuos positivos para VIH y Cryptosporidium spp. eran de origen urbano, y se presentó mayor número de casos en hombres que en mujeres, condiciones atribuidas a los riesgos de infección del virus, mas no del patógeno oportunista.29
Ninguno de los individuos afectados con VIH y positivo para Cryptosporidium presentó tuberculosis en comparación con la asociación leve presentada en estudios previos.30
Entre los datos obtenidos por laboratorio se destaca que todos los individuos presentaban hemoglobina, hematócrito y leucocitos disminuidos, lo que es característico en pacientes inmunodeprimidos; sin embargo, no se obtuvieron datos acerca de la carga viral ni del número de linfocitos totales del paciente.
Existen preguntas sin respuesta como si los ooquistes inhalados se ingieren inmediatamente o si la infección comienza en el árbol respiratorio y si la infección en cualquiera de los sitios puede ocurrir independientemente del otro. Se asume, quizás incorrectamente, que Cryptosporidium invade primero el árbol respiratorio, seguido de la infección del tracto gastrointestinal. Por el contrario, la infección puede comenzar en el intestino y extenderse al tracto respiratorio a través de la circulación o aspiración de contenido gastrointestinal, ya que los vómitos son frecuentes en esta enfermedad. Las investigaciones futuras deberían abordar primero estas cuestiones en modelos animales adecuados.24
En Ecuador los tratamientos antirretrovirales siguen siendo un tabú, y muchos individuos empiezan el tratamiento y consecuentemente lo abandonan,31 lo que se constató en el presente estudio donde solo el 3 % de los individuos del total de la población tenían tratamiento con TARGA.
Conclusiones
En el país no existen registros acerca de la prevalencia de Cryptosporidium spp. en muestras de lavado broncoalveolar en pacientes con VIH/sida y síndrome respiratorio. Este constituye el primer estudio en obtener una prevalencia, que es inusualmente alta en comparación a países cercanos como Brasil. Se presentaron signos y síntomas frecuentes como fiebre, tos, y disnea.
Sin embargo, no se puede establecer si la infección fue causada por este patógeno o si únicamente se trató de una colonización. Se sugiere estudios que incluyan una mayor población, contengan otros patógenos respiratorios y se analice la carga viral de los individuos estudiados para establecer su relación con la presencia de patógenos oportunistas.
