Técnicas

Instituto de Hematología e Inmunología

Micrométodo para la detección de clases y subclases de inmunoglobulinas en el eluido de eritrocitos de pacientes con AHAI

Lic. Yalile Alfonso Valdés, Lic. Antonio A. Bencomo Hernández, Dra. Marta Díaz Salazar y Dra. María Elena Alfonso Valdés

Resumen

Se estudiaron 40 pacientes con anemia hemolítica autoinmune caliente (AHAI) y 15 pacientes con deficiencia de G-6PD, todos diagnosticados en el Instituto de Hematología e Inmunología en el período un 2 años.El objetivo fue evaluar una técnica en microplacas (TM) de fondo V para la detección de clases de Ig y subclases de IgG en el eludio de eritrocitos de estos pacientes, y compararla con la prueba de antiglobulina directa (PAD). Se comprobó que la TM fue más ventajosa, pues permitió la determinación de las clases de Ig de las muestras que no fueron posibles de identificar en la PAD. Igualmente resultó útil en la determinación de las subclases de IgG en todas las muestras con presencia de esta inmunoglobulina.

DeCS: ANEMIA HEMOLITICA AUTOINMUNE; INMUNOGLOBULINA IgG/análisis.

La hemólisis inmune se produce como consecuencia de la unión de inmunoglobulinas (Ig) a la membrana de los eritrocitos. Los anticuerpos pueden estar dirigidos contra antígenos de la superficie eritrocitaria como en las anemias hemolíticas autoinmunes (AHAI), reacciones transfusionales hemolíticas (RTH) y la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN), o adsorbidos al eritrocito por la deposición del complejo droga-anti-droga.1

Los anticuerpos pueden unir células diana a células efectoras como los macrófagos del bazo e hígado por medio de receptores Fc presentes en estos últimos. Los anticuerpos también pueden activar la vía clásica del complemento; este sistema contribuye a la hemólisis a través del depósito del complejo C5b-9 de ataque a la membrana sobre la célula diana y a su fagocitosis por el depósito de C3b, el cual es reconocido por las células efectoras con receptores para este último.1

La prueba de antiglobulina directa (PAD) es un proceder cualitativo muy empleado en inmunohematología para determinar el papel desempeñado por las Ig en las hemólisis de naturaleza inmune y en el diagnóstico de procesos hemolíticos mediados por anticuerpos. En algunos pacientes, la cantidad de Ig fijada a los eritrocitos es capaz de producir hemólisis, y sin embargo, no alcanza el umbral crítico para una aglutinación eficaz.2 La determinación de clases y subclases de Ig unidas a eritrocitos es difícil cuando el resultado de la PAD es débil o negativa en pacientes AHAI.

Se han informado excelentes resultados al identificar las Ig en el eluido de los eritrocitos del paciente, a diferencia de su detección directa en los eritrocitos. Este hallazgo se explica por la fuerte sensibilización in vitro observada cuando se utilizan el eluido y eritrocitos alogénicos.3,4

Con este trabajo nos proponemos evaluar, una técnica en microplacas (TM) de fondo V para la detección de clases de Ig y subclases de inmunoglobulina G (IgG), en eluido de eritrocitos de pacientes con AHAI.

Métodos

Se estudiaron 40 pacientes con AHAI caliente y 15 pacientes con deficiencia de G6PD (glucosa 6 fosfato deshidrogenasa); todos los pacientes se diagnosticaron en el Instituo de Hematología e Inmunología en un período de 2 años; en el estudio se incluyó además un grupo de 50 donantes de sangre. A todas las muestras se les realizó la PAD con reactivo antiglobulínico poliespecífico y monoespecífico anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM y anti-C3 obtenidos en nuestra institución. El eluido de los eritrocitos se realizó por el método del éter.5

Para la determinación de las clases y subclases de Ig en la TM se utilizaron microplacas de fondo V Greiner; 10 mL de una mezcla de eritrocitos de donantes de fenotipo O R1R1, R2R2 y rr se resuspendieron por separado con 100 mL de cada muestra de eluido a estudiar; la incubación se efectuó a 37 °C durante 45 minutos. Posteriormente los eritrocitos sensibilizados se lavaron 3 veces con solución salina al 0,9 % y se resuspendieron con la misma solución al 0,4 %.3 Para las 2 técnicas se utilizaron como control positivo eritrocitos sensibilizados con anticuerpos conocidos y como control negativo eritrocitos del grupo O no sensibilizados.

Las clases y subclases de Ig se determinaron con reactivos previamente estandarizados y diluidos con solución salina balanceada con fosfato 0,15 mol/L, pH 7,2 - suero fetal al 1 %.

La clasificación en clases de Ig se realizó con las diluciones de los siguientes reactivos: anti-IgG (Dako) dilución 1:20, anti-IgA (Behring) dilución 1:40, y anti-IgM (Behring) dilución 1:20. La clasificación en subclases de IgG se aplicó únicamente al grupo de pacientes con AHAI y a los controles positivo y negativo de la TM se realizó con las diluciones de los siguientes reactivos procedentes del CLB, Amsterdam: anti-IgG1 dilución 1:40, anti-IgG2 dilución 1:60, anti-IgG3 dilución 1:40, y anti-IgG4 dilución 1:40.

En las microplacas se mezclaron 25 mL de las diluciones de los reactivos. La incubación se realizó a 4 °C durante 12 h y se leyó por sedimentación. Se calculó la sensibilidad (S), la especificidad (Sp) y los valores predictivos, tanto positivos (vpp) como negativos (vpn) de la PAD y la TM, para la determinación de las clases de Ig. Con este fin se aplicó la tabla de contingencia siguiente:6

Ensayo	Inmunoglobulina
	Presente	Ausente	Total
Positivo	(a) verdadero +	(b) falso +	(a + b)
Negativo	(c) falso -	(d) verdadero -	(c + d)
Total	(a + c)	(b + d)	N = (a + b + c + d)

Y las fórmulas siguientes:

Sensibilidad (S) = a / (a + c)
Especificidad (Sp) = d / (b + d)
Valor predictivo positivo (vpp) = a / (a + b)
Valor predictivo negativo (vpn) = d / (c + d)
Se multiplicó por 100 para expresar los datos en por ciento.

Estos indicadores de calidad no se analizaron para la determinación de las subclases de IgG, ya que los reactivos que se emplean en este caso son de alta cotización en el mercado y existía poca disponibilidad de los mismos.

Se utilizó la prueba Chi cuadrado (X2) con el 95 % de intervalo de confianza7 con el objetivo de comparar la PAD con la TM para la detección de las clases de Ig. Los resultados se expresaron en probabilidad y se consideró significativo un valor de p < 0,05.

El grado de hemólisis en los pacientes se clasificó según la concentración de hemoglobina (Hb) y el porcentaje de reticulocitos. Se consideró con hemólisis grave a aquellos casos que presentaron cifras de Hb menores de 70 g/L y conteo de reticulocitos mayor del 10 % (100 ´ 10-3); con hemólisis moderada a aquellos que mostraron cifras de Hb entre 70-90 g/L y conteo de reticulocitos del 3-5 % (30-50 ´ 10-3), y con hemólisis ligera los que presentaron cifras de Hb de 100 g/L o superior y conteo de reticulocitos menor del 3 % (30 ´ 10-3).

Resultados

Con la utilización de la PAD se detectaron inmunoglobulinas y complemento en todas las muestras de pacientes con AHAI, excepto en 2 de ellos. La TM identificó inmunoglobulinas en todos estos casos, e iguales resultados se obtuvieron en la determinación de las subclases de IgG con esta técnica para este mismo grupo (tabla 1). Tanto para el grupo de pacientes con deficiencia de G6PD como para el grupo de donantes, se obtuvieron resultados negativos con las 2 técnicas, los cuales se esperaban y se entendió innecesaria su tabulación.

Tabla 1. Resultados de la prueba de antiglobulina directa (PAD) y la técnica de microplaca (TM) en pacientes con AHAI

Paciente	PAD Clase de Ig y C3	TM Clase de Ig	TM IgG1	Subclase de IgG
				IgG2	IgG3	IgG4
1	IgG, C3	IgG	0	+	0	0
2	C3	IgG	+	0	0	0
3	C3	IgG	+	0	0	0
4	IgG, IgA, IgM	IgG, IgA, IgM	+	0	0	0
5	C3	IgG	+	0	0	0
6	IgG, C3	IgG	+	0	+	0
7	IgG, IgA	IgG, IgA	+	0	0	0
8	C3	IgG	0	+	0	0
9	IgG, C3	IgG	+	+	+	0
10	IgG, C3	IgG	+	0	0	0
11	IgG, C3	IgG	+	0	0	0
12	IgG, C3	IgG	+	0	0	0
13	IgG, C3	IgG	+	0	0	0
14	IgG, IgA, C3	IgG, IgA	0	+	+	+
15	IgG, IgA	IgG, IgA	+	+	+	0
16	C3	IgG	+	0	0	0
17	IgG, C3	IgG	+	0	0	0
18	IgG	IgG, IgA	+	+	+	0
19	IgG	IgG, IgA	+	0	+	0
20	IgG	IgG	+	0	0	0
21	IgG	IgG	+	0	0	0
22	O	IgG	+	0	0	0
23	IgG, IgA, C3	IgG, IgA	+	0	+	0
24	IgG, IgM, C3	IgG, IgA, IgM	+	0	+	0
25	IgG, IgA, IgM, C3	IgG, IgA, IgM, C3	+	0	0	+
26	IgG, C3	IgG	+	0	+	0
27	IgA, C3	IgG, IgA	+	0	0	+
28	IgA, C3	IgG, IgA	+	0	0	+
29	IgG, IgA, C3	IgG, IgA, IgM	+	+	0	+
30	IgG, IgA, IgM, C3	IgG, IgA, IgM, C3	+	+	0	+
31	IgG	IgG	+	0	0	+
32	IgG	IgG, IgA	+	0	0	0
33	IgG, C3	IgG	+	0	0	0
34	IgA, C3	IgG, IgA	+	0	0	0
35	IgG, IgA, IgM, C3	IgG, IgA, IgM	+	0	0	0
36	IgG, C3	IgG	+	0	0	0
37	IgG, C3	IgG	+	+	+	0
38	IgG, C3	IgG	+	0	0	0
39	0	IgG	+	0	0	0
40	IgG, C3	IgG	+	0	0	0

Los indicadores de calidad para la determinación de las clases de Ig mediante la PAD y la TM fueron:

Para la PAD:
S = 62 %, Sp = 100 %, vpp = 100 %, vpn = 81 %

Para la TM:
S = 100 %, Sp = 100 %, vpp = 100 %, vpn = 100 %

En la tabla 2 se observan los porcentajes de detección de Ig para la PAD y la TM: 82,50 y 100 %, respectivamente. Nótese que las sensibilidades de ambas técnicas difieren (p = 0,0176), ya que la PAD no identificó Ig en el 17,50 % de las muestras.

Tabla 2. Relación entre la PAD y la TM en la detección de clases de inmunoglobulinas en pacientes con AHAI

Técnica	Positivo	%	Negativo	%	P
PAD	33	82,50	7	17,50
					0,0176
TM	40	100	0	0

PAD: prueba de antiglobulina directa; TM: técnica de microplaca.

Resultados similares se obtienen al comparar ambas técnicas en la identificación de Ig por clases. Para la IgG la diferencia fue estadísticamente significativa (p = 0,0023), no así para la IgM (p = 1,0000) y la IgA (p = 0,4819).

Aunque no se observaron diferencias significativas, desde el punto de vista estadístico, en la determinación de IgM e IgA sí se aprecian diferencias al analizar los porcentajes de detección (tabla 3).

Tabla 3. Relación entre el tipo de técnica empleada y la clase de inmunoglobulina determinada en pacientes con AHAI

Clase de Ig	Técnica	Ig	%	P
IgG	PAD	30	75,00
				0,0023
	TM	40	100
IgM	PAD	5	12,19
				1,0000
	TM	6	14,63
IgA	PAD	12	29,26
				0,4819
	TM	16	39,02

PAD: prueba de antiglobulina directa; TM: técnica de microplaca.

La tabla 4 resume la incidencia de subclases de IgG. La IgG1 fue la más frecuente (55,0 %) y se hallaron combinaciones de subclases en 16 muestras (40,00 %); la combinación IgG1 + IgG3 fue la más observada (12,50 %).

Tabla 4. Subclases de IgG detectadas en eluidos de pacientes con AHAI

Subclases de IgG	No. de pacientes	%
Subclases de IgG simple	24	60,00
IgG1	22	55,00
IgG2	2	5,00
IgG3	0	0
IgG4	0	0
Combinaciones entre subclases	16	40,00
IgG1 + IgG3	5	12,50
IgG1 + IgG4	4	10,00
IgG1 + IgG2 + IgG3	4	10,00
IgG1 + IgG2 + IgG4	2	5,00
IgG2 + IgG3 + IgG4	1	2,50

La combinación entre subclases de IgG se asoció principalmente con la hemólisis grave (69,23 %). La subclase IgG1 simple se encontró predominantemente en las hemólisis moderada (70,58 %) y ligera (70,00 %); solo en pocos casos se hallaron combinaciones entre subclases (29,41 y 20,00 %, respectivamente), estas siempre se asociaron con la subclase IgG3, nunca con la IgG2 o IgG4 (tabla 5).

Tabla 5. Subclases de IgG detectadas en pacientes con AHAI grave, moderada y ligera

Hemólisis	No. de pacientes	IgG1 simple	%	IgG1asociada con otras subclases (%)
Grave	13*	3	23,07	9 (69,23) 5 con IgG3
Moderada	17	12	70,58	5 (29,41) 3 con IgG3
Ligera	10*	7	70,00	2 (20,00) 2 con IgG3

* Un caso con IgG2 únicamente.

Los controles positivo y negativo de la PAD y la TM se comportaron según lo esperado.

Discusión

Cuando la aglutinación en la PAD es débil o negativa se dificulta el diagnóstico serológico de pacientes con síntomas y signos de AHAI, ya que resulta complicada la determinación y clasificación de las Ig involucradas. Algunos autores atribuyen estos resultados débiles o negativos cuando el número de moléculas de Ig por eritrocito es menor de 500.3 Se ha planteado que al eluir las Ig que recubren los eritrocitos del paciente in vivo, es decir, obtenerlas en un eluido, y unirlas in vitro con eritrocitos de donantes (preferentemente una mezcla de varios), se obtiene una sensibilización más fuerte, porque se obtiene un número mayor de moléculas de Ig por eritrocito (500 - 10 000), independiente de la cantidad inicial in vivo.3

Los resultados de nuestro trabajo corroboran los hallazgos descritos anteriormente, ya que en la TM se utilizaron eritrocitos de donantes sensibilizados con eluidos, a diferencia de la PAD, en la que se determinó la Ig directamente en el eritrocito del paciente. Estas diferencias son significativas al comparar ambas técnicas.

De todos los isotipos, la IgG es la más frecuente, constituye aproximadamente el 75 % del total de Ig séricas y es capaz de fijar complemento con diferencias entre sus subclases.5 Es una Ig muy involucrada en la respuesta inmune e importante en el diagnóstico de las AHAI, porque con excepción del síndrome de aglutininas frías, se presenta en los restantes tipos de AHAI.2 En nuestro estudio exhibió una alta frecuencia; se encontraron diferencias significativas en el empleo de ambas técnicas que favorecieron a la TM, por la cual se demostró IgG en todos los casos. Resultados similares se han informado en la literatura.3,8-10

Se observaron diferencias entre técnicas al analizar los porcentajes de detección de IgM e IgA; aunque su presencia fue discreta comparada con la igG, no se debe restar importancia a estas clases de Ig. Ninguno de nuestros pacientes presentó AHAI causada sólo por autoanticuerpos IgM o IgA. Estos anticuerpos, en todos los casos, se encontraron acompañados por isotipo IgG y/o complemento. La IgM representa el 10 % de las Ig en el suero y es una aglutinina eficaz que activa el complemento eficientemente.5 Algunos autores plantean que un aumento de moléculas de IgM por eritrocito ligado con una reducción de moléculas de IgG, puede ser indicativo de desarrollo de respuesta autoinmune.11

La AHAI sin el concurso de autoanticuerpos IgG y causada únicamente por IgM es poco frecuente, cuando se presentan las moléculas de IgM, reaccionan óptimamente a 37 °C, la hemólisis es severa y en muchos casos la anemia hemolítica es fatal. Se ha planteado una asociación de la hemólisis in vitro a 37 °C de eritrocitos con enzimas y la presencia del isotipo IgM. Los casos en los que no se detectan IgG y complemento, pero sí IgM, a veces no se informan o se clasifican Coombs directo negativo, porque la identificación de la IgM por la PAD es difícil y se deben aplicar procederes más sensibles.12

La IgA predomina en secreciones corporales y es capaz de fijar complemento a través de la vía alterna si se encuentra agregada.5 Los autoanticuerpos de esta clase no son comunes y se encuentran en bajo porcentaje en pacientes con AHAI; aún no está bien definido su desempeño en la transfusión y su significado clínico no ha sido dilucidado suficientemente.11

La IgA actúa sinérgicamente con otras Ig (usualmente IgG) para provocar la hemólisis, sin embargo, estudios recientes plantean casos raros de hemólisis inmune donde sólo se identifican los anticuerpos de la clase IgA que actúan por mecanismos similares a los observados en la IgG.11

Por lo expuesto hasta aquí puede inferirse que la determinación de las clases de Ig en la AHAI es importante, ya que si no se detectan puede dificultar e influir en su diagnóstico. Por ejemplo, en la muestra No. 2 (tabla 1), mediante la PAD no se detectaron Ig; la anemia hemolítica en este paciente podría atribuirse a otras causas no inmunes, sin embargo, al estudiar el eluido resultó que contenía autoanticuerpos de la clase IgG, lo que confirmó el diagnóstico de anemia de causa autoinmune.

Con la Tm se caracterizaron autoanticuerpos contenidos en los eluidos, mientras que la determinación del fragmento C3 del complemento asociado con los eritrocitos de los pacientes, solo es posible realizarlo con la PAD; con esta técnica se obtienen buenos resultados para detectar esta inmunoproteína.

En las AHAI, los eritrocitos de los pacientes están principalmente sensibilizados con la subclase IgG1, normalmente es la única subclase que se encuentra y el resto rara vez se encuentran solas.8 La IgG1 fue la más frecuente de las encontradas en toda la muestra de estudio (92,50 %). Este resultado es similar al de otros trabajos, donde se encuentran en el 87 %,8 96 %,9 98 %10 y 95 %.3 También la detección de una subclase y de las combinaciones entre subclases fue similar con las proporciones halladas en otros trabajos.3,8-10

En otras investigaciones, la alta incidencia de combinaciones entre subclases de IgG se asoció con el número elevado de anticuerpos de este isotipo que se encontraban sensibilizando los eritrocitos.3,4,13 Este mismo análisis se puede aplicar a nuestros resultados, si tenemos en cuenta la alta sensibilidad de la técnica, influenciada por el uso de eluidos, donde se garantiza que un mayor número de anticuerpos se una con los eritrocitos.

En algunos estudios se ha observado que la acción sinérgica de diferentes clases de Ig y diferentes subclases de IgG, son las responsables de la hemólisis grave en pacientes con AHAI.4,10,11 En nuestros casos con hemólisis grave, la minoría presentó IgG1, el resto múltiples subclases de IgG (en este grupo en el 61,53 % se hallaron múltiples clases de Ig).

La literatura informa de casos en los que la sensibilización con IgG3 no se relaciona con una anemia hemolítica evidente. Se ha identificado esta subclase en donantes de sangre y pacientes con otras enfermedades con una PAD positiva sin una hemólisis obvia, y en neonatos con PAD positiva con anti-D y signos de EHRN.8 Otros autores, sin embargo, han observado la IgG3 siempre asociada con una hemólisis manifiesta.14,15 La sensibilización con IgG3 es frecuente en las AHAI, sin embargo, su presencia en nuestro estudio no puede asociarse con el grado de hemólisis en los pacientes.

Podemos concluir que la técnica en microplacas de fondo en V es más ventajosa que la PAD, para la determinación de las clases de Ig, ya que detectó Ig en el 32,50 % de las muestras que no fueron posibles de identificar en la PAD. También resulta útil en la determinación de las subclases de IgG, las cuales se clasificaron en todas las muestras con presencia de autoanticuerpos de esta clase. La TM, a diferencia de la PAD, ofrece como ventajas la utilización de volúmenes menores de reactivo y una mayor fiabilidad en la lectura de aglutinación.

Se han desarrollado otros procederes más sofisticados para detectar y cuantificar clases y subclases de Ig fijadas a los eritrocitos en diferentes enfermedades como la AHAI y la EHRN; estos son los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) y la citometría de flujo.16,17 Es innegable la calidad de los resultados obtenidos mediante estos métodos; la citometría de flujo es una herramienta rápida, sensible y específica para detectar IgG y sus subclases. A través del ELISA puede predecirse la severidad de la EHRN en embarazadas aloinmunizadas, sin embargo, el equipamiento y los reactivos que utilizan estas técnicas son costosos, lo cual limita su uso, y hace necesaria la implementación de procedimientos como la TM.

Agradecimientos

A M. García y L. Orbeal por su asistencia técnica.

Summary

Forty patients with autoimmune hemolytic anemia and 15 patients with G-6PD deficiency, all of them diagnosed in the Hematology and Immunology Institute for two years, were studied. The objective was to evaluate a technique of bottom microplates V for the detection of Ig classes and IgG subclasses in a sample of erythrocytes from these patients and compare it with the direct antiglobulin test. It was confirmed that the technique of bottom microplates V offered more advantages since it allowed determining Ig classes of samples that were not identified by the direct antiglobulin test. Likewise, it was useful in determining IgG subclasses in all the samples with this type of immunoglobuline.

Subject headings: ANEMIA HEMOLYTIC; INMUNOGLOBULINS; IgG/analysis.

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Recibido: 23 de Febrero de 2003. Aprobado: 10 de marzo del 2003.
Lic. Antonio A. Bencomo Hernández. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La Habana, Cuba. Tel [phone], 544214. Fax [phone]. e-mail: [e-mail]