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Revista Cubana de Investigaciones Biomédicas

versión On-line ISSN 1561-3011

Rev Cubana Invest Bioméd v.22 n.3 Ciudad de la Habana jul.-sep. 2003

 

Centro de Química Farmacéutica
Centro Nacional de Investigaciones Científicas
Istituto di Ricerche Farmacologiche "Mario Negri", Italia

VIMANGÒ y mangiferina inhiben la expresión de ICAM-1 en células endoteliales estimuladas con citocinas proinflamatorias

Dra. Amada E. Beltrán Núñez, Dra. Nurys Ledón Naranjo, Dra. Cheyla Romay Penabad, Dra. Marina Sironi, Téc. Gypsy Quintero Rodríguez, Dr. Gabino Garrido Garrido y Dr. René Delgado Hernández


Resumen

Se demostró que VIMANGÒ (extracto acuoso de la corteza de Mangifera indica L.) posee acciones antioxidante, inmunomoduladora y antiinflamatoria; también que VIMANGÒ y la mangiferina aislada de este inhibieron la expresión de la molécula de adhesión ICAM-1. Estudios de adhesión en células endoteliales con una línea celular leucocitaria (HL-60) permitieron demostrar la inhibición sobre la expresión del receptor de ICAM-1, al comprobar que el pretratamiento de las células endoteliales con el extracto de M. indica y la mangiferina mantuvieron valores similares a los controles sin estímulo. Ambos productos inhibieron la actividad quimiotáctica (mediada por ICAM-1) de leucocitos polimorfonucleares estimulados con N-formil-metionil-leucil-fenilalanina. Estos estudios permitieron incursionar en nuevos aspectos relacionados con los mecanismos de acción antiinflamatoria del extracto acuoso de Mangifera indica L., lo que demuestra el potencial terapéutico de este extracto para el tratamiento de una variedad de enfermedades inflamatorias que incluyen la adhesión celular y el tráfico de leucocitos.

DeCS: MANGIFERA INDICA; MOLECULAS DE ADHESION CELULAR; ACCION FARMACODINAMICA DEL MEDICAMENTO HOMEOPATICO.



La adhesión de los leucocitos a las células endoteliales ha sido implicada en la patogénesis de una variedad de enfermedades que ocasionan la afectación de órganos, como aterosclerosis, úlceras gástricas, choque hemorrágico, infarto de miocardio, entre otras.1,2 En estas interacciones participan familias de glicoproteínas de adhesión que son las responsables, entre otros factores, de que los leucocitos se adhieran firmemente al endotelio y migren hacia los tejidos, lo que produce posteriormente el daño. Es por esta razón que, en los últimos años, los esfuerzos de los investigadores se han dirigido a la búsqueda de compuestos capaces de modular los mediadores y receptores que intervienen en estos procesos de reconocimiento celular.

ICAM-1 (intracellular adhesion molecule-1) es una de las principales glicoproteínas pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas presentes en el endotelio vascular, responsable de la adhesión y migración leucocitaria. Esta molécula incrementa su expresión en la superficie vascular después de estimulación con estímulos proinflamatorios, como el factor necrosante de tumores a (TNFa) y la interleucina-1 (IL-1b).3 En numerosos estudios realizados tanto in vitro como in vivo se ha demostrado que diversos factores tanto químicos como físicos pueden influenciar en el tiempo y la magnitud en que los leucocitos son capaces de adherirse al endotelio vascular.1,2

El Centro de Química Farmacéutica ha desarrollado un nuevo producto obtenido a partir de la experiencia en el uso etnomédico en Cuba del extracto acuoso de la corteza de Mangifera indica L. (familia Anacardiaceae) y que se comercializa como suplemento nutricional antioxidante bajo la marca registrada VIMANGÒ. En el análisis fitoquímico realizado a este extracto se ha comprobado la presencia de 9 compuestos fenólicos cuyo componente mayoritario es la glucosilxantona mangiferina. También se determinaron azúcares libres, ácidos grasos y polioles.4 En investigaciones recientes se ha podido demostrar que posee una acción antioxidante potente,5-9 así como efecto inmunomodulador,10 antigenotóxico11 y antiinflamatorio12,13 Debido a estos antecedentes, en el presente trabajo se estudió la actividad del extracto acuoso de Mangifera indica y la mangiferina sobre el proceso de adhesión de células leucocitarias (HL-60) a endotelio vascular activado con TNFa e IL-1b, así como la acción moduladora sobre la actividad quimiotáctica de leucocitos polimorfonucleares (PMN) estimulados con N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) y la expresión de ICAM-1 en células endoteliales activadas.

Métodos

Obtención del extracto estandarizado de Mangifera indica L. y mangiferina: M. indica fue colectada en campos cultivados en la región de Pinar del Río, Cuba. Muestras de la planta (código: 41722) fueron depositadas en el Herbario de la Academia de Ciencias, bajo la custodia del Instituto de Ecología y Sistemática, Ministerio de Ciencia, Tecnología y Medio Ambiente, La Habana, Cuba. El extracto de la corteza fue preparado por decocción durante 1 h y posteriormente concentrado por evaporación y atomización para obtener un polvo fino de color carmelita. Este funde a 210-215 ºC con descomposición. La composición química del extracto ha sido caracterizada por cromatografía (plana, líquida y gaseosa), espectrometría de masa y espectroscopia UV/VIS.4

La mangiferina (2-b-D-glucopiranosil-1,3,6,7-tetra-hidroxi-9H-xanten-9-ona) fue obtenida en el laboratorio de Química Analítica del Centro de Química Farmacéutica. Esta fue purificada del extracto estandarizado de la corteza del árbol de M. indica por extracción con metanol y su pureza (90 %) fue comparada con un patrón (Sigma, St. Louis, EE.UU.) por métodos espectroscópicos.4

Para los diferentes ensayos, tanto el extracto como la mangiferina se disolvieron en una disolución de dimetil sulfóxido (DMSO) a 0,4 % y agua estéril.

Líneas celulares: las células HUVEC, fueron obtenidas a partir de un cultivo primario de endotelio aislado de vena de cordón umbilical humano por tratamiento con colagenasa 0,02 % (Sigma, St. Louis, EE.UU.) y mantenidas en medio M199 (Sigma, St. Louis, EE.UU.) suplementado con glutamina (2 mM), y penicilina-estreptomicina (100 mg/mL) y 10 % de suero fetal bovino (Hyclone Lab. Inc., Logan, EE.UU.), en frascos T25 cm2 estériles (Costar, EE.UU.), según metodología descrita por Lampugnani y otros14 Posteriormente, las células fueron transferidas a placas de 96 pocillos (100 mL/pozo) y se mantuvieron en el mismo medio suplementado, además, con heparina 100 mg/mL (Sigma, St. Louis, EE.UU.) y un suplemento de crecimiento celular (50 mg/mL) en una atmósfera de (5 % de CO2 y 37 ºC) hasta que alcanzaron el estado de confluencia.

La línea celular leucocitaria HL-60 fue gentilmente donada por el Instituto de Inmunología Molecular (La Habana, Cuba) y mantenidas en medio RPMI 1640 (Seromed, Berlín, Alemania) suplementado con glutamina (2 mM), penicilina-estreptomicina (100 mg/mL) y suero fetal bovino 10 % en atmósfera de 5 % de CO2 y 37 ºC.

Expresión de ICAM-1. ELISA celular: las células HUVEC cultivadas en placas de 96 pozos se estimularon con IL-1b (1 ng/mL) durante 24 h en medio de cultivo M199 (Sigma, St. Louis, EE.UU.) suplementado con 10 % de suero suero fetal bovino inactivado (FCS, Hyclone Lab. Inc., Logan, EE.UU.) y simultáneamente con el estímulo se añadieron las diferentes concentraciones del extracto de M. indica y mangiferina (50-100 mg/mL). Posteriormente, se retiró el medio de cultivo de los pozos y las células se lavaron 2 veces con medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 2,5 % de FCS y 0,1 % de azida sódica. Luego se incubaron con el primer anticuerpo anti-ICAM-1 (50 mL/pozo) a temperatura ambiente durante 60 min. Después, se lavaron 2 veces con medio RPMI 1640 suplementado con 2,5 % de FCS y se fijaron con paraformaldehído (3 %) por 15 min a temperatura ambiente (se mantuvo la placa en la oscuridad). Después se lavaron 3 veces (5 min por lavado) con 200 mL/pozo de disolución salina tamponada con fosfato (DSTF) y 2,5 % de FCS. El último lavado se realizó a temperatura ambiente durante 1 h. Se añadieron 100 mL/pozo del conjugado anti-mouse-peroxidase (DAKO, Dinamarca) y se incubaron 1 h a temperatura ambiente. Se lavaron 2 veces con DSTF y 2,5 % de FCS y una vez con DSTF. Posteriormente, se añadieron 100 mL del cromógeno (sustrato ABTS peroxidasa) y se realizó la medición de la absorbancia, a una longitud de onda de 405 nm en un lector de microplacas (PR-521SUMA, Cuba).15 Los datos fueron expresados como porcentaje de la expresión de ICAM-1 respecto al control de 3 experimentos independientes.

Ensayo de quimiotaxis: el método para el análisis de la quimiotaxis fue una modificación del empleado por Valentino y otros.16 La actividad quimiotáctica fue analizada mediante cámaras quimiotácticas apropiadas (Boyden) que forman parte de un kit comercial (FAR S.R.L., Italia). Se aislaron los leucocitos polimorfonucleares (LPMN) de donantes adultos sanos y se emplearon en los ensayos 106 células/mL. Posteriormente, fueron añadidos el agente quimiotáctico N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP 10-7 M) y el extracto de M. indica (50-200 mg/mL), mangiferina (20 mg/mL) o ácido nordihidroguaiarético (NDGA, 50 mM) como fármaco o sustancia de referencia de inhibición de la actividad quimiotáctica. Estos fueron incubados durante 1 h a 37 ºC y 5 % de CO2.

Los resultados fueron expresados como porcentaje de migración de los LPMN a través del filtro de la cámara Boyden.

Marcaje de las células HL-60 con MTT: se preparó una disolución patrón de 5 mg/mL de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT; Sigma, St. Louis, EE.UU.) en DSTF sin calcio y magnesio y se pasó a través de un filtro de 0,45 mm (Costar, EE.UU.). Posteriormente, las células HL-60 que se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Seromed, Berlín, Alemania) suplementado con glutamina (2 mM), y penicilina-estreptomicina (100 mg/mL) y suero fetal bovino 10 %, se incubaron a 37 ºC por espacio de 1 h con el MTT a un volumen de 1/5 (v/v). Al final del tiempo de incubación las células HL-60 marcadas con MTT se centrifugaron a 1 100 rpm por 5 min a temperatura ambiente y posteriormente se lavaron 2 veces con medio RPMI 1640 (Seromed, Berlín, Alemania) suplementado con 10 % de suero fetal bovino.15

Ensayo de adherencia celular: las células HUVEC cultivadas en placas de 96 pozos se activaron por espacio de 24 h con TNF (50 ng/mL) e IL-1b (100 ng/mL), según metodología descrita por Miki y otros,15 en presencia y ausencia del extracto de M. indica (50, 100 y 200 mg/mL) y mangiferina (50 mg/mL), respectivamente. Después, las células HUVEC se lavaron con M199 (Sigma, St. Louis, EE.UU.) suplementado con 2 % de suero fetal bovino y se incubaron con la suspensión de HL-60 marcadas con MTT (100 mL), previamente ajustadas a una concentración de 3 x 106 células/mL, en medio de cultivo RPMI 1640 (Seromed, Berlín, Alemania) por 30 min a 37 ºC y 5 % de CO2. Se realizaron 3 lavados con medio RPMI 1640 (Seromed, Berlín, Alemania) suplementado con 2 % de suero fetal bovino para remover las células no adheridas y se añadieron 100 mL de DMSO a cada pozo para disolver los cristales de formazán. Finalmente se realizó la medición de la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm, en un lector de microplacas (PR-521SUMA, Cuba) de 3 experimentos independientes.

Análisis estadístico: para comparar las medias de los datos obtenidos en cada ensayo se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de clasificación simple y prueba de Bonferroni a posteriori. Todos los análisis fueron realizados utilizando el paquete estadístico Statistics sobre Windows (Release 4.0, Statsoft, Inc. 1993). Valores probabilísticos (p) inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. Análisis de regresión fueron usados para calcular la concentración inhibitoria 50 (CI50), definida como la concentración de cada droga necesaria para producir 50 % del efecto esperado. En todos los casos en que se calculó el porcentaje de inhibición, se hizo a través de la relación siguiente:

% inhibición = 100 - (media valores de la muestra / media valores controles) x 100

Resultados

Los resultados del ELISA celular demostraron que tanto el extracto acuoso de M. indica como la mangiferina inhibieron significativamente la expresión de ICAM-1 en células endoteliales activadas con IL-1b. Las células HUVEC, obtenidas a partir de cultivo primario de endotelio aislado de vena de cordón umbilical humano, fueron estimuladas con IL-1b (1 ng/mL) y simultáneamente, se añadieron las diferentes concentraciones del extracto de M. indica y mangiferina (50-100 mg/mL), después, se incubaron con anticuerpos anti-ICAM-1 y se realizó ELISA celular de acuerdo con la metodología descrita en métodos. La figura 1 representa los valores de la media ± e.e.m. (error estándar de la media) para 3 experimentos independientes. Los porcentajes de inhibición para el extracto fueron de 23,3 y 30,1 % para las concentraciones de 50 y 100 mg/mL, respectivamente; mientras que para mangiferina fueron de 36,9 y 48,8 para las concentraciones de 50 y 100 mg/mL, respectivamente.

* p £ 0,05 respecto al control, según análisis estadístico realizado (ANOVA y prueba de Bonferroni a posteriori).

Fig. 1. Efecto inhibitorio del extracto acuoso de M. indica (Mi) y mangiferina (M) sobre la expresión de ICAM-1 en células endoteliales estimuladas con IL-1.


Al estudiar el efecto del extracto de M. indica y de la mangiferina sobre la actividad quimiotáctica de los leucocitos estimulados con fMLP, se pudo comprobar que ambos compuestos, inhibieron esta actividad con un efecto dependiente de la concentración. El método empleado para el análisis de la quimiotaxis y el aislamiento de los LPMN fueron realizados según se describe en métodos. Mi (50, 100 y 200 mg/mL), mangiferina (20 mg/mL) y NDGA (50 mM) fueron incubados con los LPMN durante 1 h a 37 ºC y 5 % de CO2. El NDGA fue utilizado como control positivo de inhibición. La figura 2 representa los valores de la media ± e.e.m. para 3 experimentos independientes. Para el extracto la CI50 fue de 114,0 mg/mL y los porcentajes de inhibición fueron 47,4; 57,7 y 78,9 % para las concentraciones de 50, 100 y 200 mg/mL, respectivamente. Mangiferina (20 mg/mL) tuvo un porcentaje de inhibición de 66,5 %, mientras que el fármaco de referencia NDGA inhibió en proceso de quimiotaxis en 98,3 %.

*p £ 0,05 respecto al control (fMLP), según análisis estadístico realizado (ANOVA y prueba de Bonferroni a posteriori).

Fig. 2
. Efecto inhibitorio del extracto acuoso de M. indica (Mi) y la mangiferina (M) sobre la actividad quimiotáctica de leucocitos polimorfonucleares estimulados con fMPL (10-7M).


Por otra parte, se analizó el efecto del extracto de M. indica y la mangiferina purificada sobre el proceso de adhesión de una línea celular leucocitaria (HL-60) a células endoteliales activadas con citocinas proinflamatorias. Esta actividad fue inhibida de forma significativa, con un efecto dependiente de la concentración utilizada. Los niveles de adhesión en las células estimuladas con IL-1 y TNF fueron superiores (63,5 %) a los niveles alcanzados en el caso de las células no estimuladas. Sin embargo, el pretratamiento de las células endoteliales con el extracto de M. indica y la mangiferina mantuvieron valores similares a los controles sin estímulo. Las células HUVEC se activaron durante 24 h con TNF (50 ng/mL) e IL-1 (100 ng/mL) en presencia o no del extracto (50, 100 y 200 mg/mL) o mangiferina (100 mg/mL), según se describe en métodos. Posteriormente se añadió una suspensión de células HL-60 marcadas con MTT (3 x 106 células/mL) por 30 min a 37 oC y se realizó la medición de la absorbancia a 550 nm. La figura 3 representa los valores de la media ± e.e.m. para 3 experimentos independientes. Los porcentajes de inhibición para el extracto fueron de 9,1; 16,0 y 21,2 % para las concentraciones de 50, 100 y 200 mg/mL, respectivamente; mientras que para mangiferina (100 mg/mL) fue de 27,5 %.

* p < 0,05 respecto al control (IL-1-TNF), según análisis estadístico realizado (ANOVA y prueba de Bonferroni a posteriori).

Fig. 3
. Efecto del extracto acuoso de M. indica (Mi) y la mangiferina (M) sobre la adhesión de células HL-60 a las células endoteliales estimuladas con IL-1-TNF.

Discusión

En el presente estudio se aplicaron diferentes ensayos in vitro para la evaluación de la acción anti-inflamatoria del extracto de M. indica. Además, se evaluó la posible implicación de su componente mayoritario, la mangiferina, en los estudios realizados. Este extracto, obtenido de la corteza de variedades seleccionadas de la especie Mangifera indica L. y que se comercializa en Cuba bajo la marca registrada VIMANGÒ, contiene una mezcla estandarizada de polifenoles, terpenoides, esteroides, ácidos grasos y microelementos.4

Estudios previos han demostrado que el extracto de M. indica presenta una poderosa actividad secuestradora de radicales hidroxilos y ácido hipocloroso, un significativo efecto inhibitorio sobre la peroxidación de fosfolípidos de cerebro de rata e inhibe el daño al ADN inducido por bleomicina o el sistema cobre-fenantrolina y la producción de H2O2 en macrófagos peritoneales estimulados in vivo con TPA.5,6 Mangiferina (que se encuentra en el extracto aproximadamente en 20 %) ha sido evaluada in vitro por sus propiedades antioxidante,17 inmunoestimulante y antiviral.18 Su aglicona (noratiriol) ha sido evaluada in vitro como inhibidor del estallido respiratorio inducido por fMLP en neutrófilos de rata.19 Noratiriol también ha sido ensayada en un modelo de pleuresía y algesia inducidas en ratones por el ionóforo de calcio A23187.20 Estos autores demostraron que la aglicona inhibía los metabolitos del ácido araquidónico como prostaglandinas y leucotrienos y que esta acción probablemente sería la responsable, al menos en parte, de los efectos analgésico y antiinflamatorio de este compuesto.

Por otra parte, se han comprobado los efectos del extracto estandarizado de M. indica como antioxidante in vitro, sobre la generación de radicales libres en leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos) estimulados con PMA y zimosán13 y efecto antiinflamatorio en ratones, ratas y cobayos en un modelo de edema plantar inducido por formalina o carragenano;12 así como en los modelos de inducción de edema en la oreja del ratón por agentes irritantes.13

Estos antecedentes sirvieron de base para que en el presente estudio se identificara una nueva acción del extracto de M. indica, que contribuye a su mecanismo de acción antiinflamatoria; el cual fue capaz de interferir en una de las etapas iniciales de la reacción inflamatoria aguda al inhibir la expresión de ICAM-1, una de las glicoproteínas más significativas de los procesos de reconocimiento celular y que median las interacciones entre el endotelio vascular y los leucocitos. Esta proteína es una de las moléculas de adhesión intercelular miembro de la superfamilia de las moléculas de adhesión, perteneciente a las inmunoglobulinas que son inducidas después de una estimulación (por ejemplo: LPS, IL-1, TNFa, etc.) de los leucocitos y las células endoteliales. Estas moléculas de adhesión modulan, en parte, las interacciones leucocito-leucocito y leucocito-célula endotelial.21 La inhibición encontrada estuvo en estrecha relación con las concentraciones empleadas tanto para el extracto de M. indica como para la mangiferina. Este efecto inhibitorio sobre la expresión de ICAM-1 (fig. 1), corroborado tanto en el ELISA celular como en los experimentos de adhesión de la línea celular HL-60 a las células endoteliales estimuladas con IL-1 y TNF (fig. 3), pudiera estar regulado al nivel transcripcional.22 Existen evidencias in vitro de que una serie de flavonoides extraídos de plantas utilizadas en el tratamiento de varias enfermedades, son capaces de inhibir la expresión de genes relacionados con proteínas de adhesión celular que son expresadas en las células endoteliales después de la estimulación con citocinas.22

El extracto de M. indica también inhibió significativamente la quimiotaxis de neutrófilos activados (fig. 2), uno de los procesos que está mediado igualmente por la expresión de ICAM-1. De este modo, el extracto pudiera ofrecer un importante potencial terapéutico para una variedad de enfermedades inflamatorias, en las que la adhesión y la migración de leucocitos desempeña un papel trascendental.

Se concluye que estos resultados representan una importante contribución para la elucidación de los mecanismos por los que el extracto de M. indica desarrolla su actividad antiinflamatoria; y permite comprobar que, no solo inhibe la adhesión de leucocitos al endotelio vascular en condiciones de inflamación, sino que también bloquea la migración de las células inflamatorias al tejido y la expresión en el endotelio de uno de los receptores (ICAM-1) que participan en el proceso de adhesión leucocitaria.

Agradecimientos

Este trabajo fue parcialmente financiado por el Ministerio de Ciencia, Tecnología y Medio Ambiente (Proyecto CITMA No. 00403238).

Summary

It was proved that VIMANGÒ (aqueous extract of the cortex of Mangifera indica L.) has antioxidant, immunologic adjuvants and antiinflammatory actions. In the present paper it was demonstrated that VIMANGÒ and the mangiferin isolated from it inhibited the expression of the ICAM-1 adhesion molecule. Studies of adhesion in endothelial cells with a leucocytic cellular line (HL-60) allowed to show the inhibition on the expression of the ICAM-1 receptor, on proving that the pretreatment of the endothelial cells with the extract of M. indica and mangiferin had values similar to the controls without stimulus. Both products inhibited the chemotactic activity (mediated by ICAM-1) of polymorphonuclear leucocytes stimulated with N-formyl-methyonil-leucyl-phenylalanine. These studies allowed to know new aspects connected with the mechanisms of the antiinflammatory action of the aqueous extract of Mangifera inidca L., which shows the therapeutic potential of this extract for treating a variety of inflammatory diseases including cellular adhesion and the leucocytes traffic.

Subject headings: MANGIFERA INDICA; CELL ADHESION MOLECULES; PHARMACODYNAMIC ACTION OF HOMEOPATHIC DRUGS.

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Recibido: 26 de marzo de 2003. Aprobado: 3 de julio de 2003.
Dra. Amada E. Beltrán Núñez. Laboratorio de Farmacología, Centro de Química Farmacéutica, Apartado Postal 16042, Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: ggarrido@cqf.co.cu

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