ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

Estrías grasas en la aorta de conejos machos tratados con etanol y dieta hipercolesterolémica

Fatty streaks in-ethanol and hypercholesterolemic diet- treated male rabbit´s aorta

Aleida Herrera Batista^I; Isis Lebredo Álvarez^II; Liana Yanet Rojas Ramírez^III

^IDoctora en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Histología. Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana. La Habana, Cuba.
^IIMáster en Ciencias. Especialista de I Grado en Histología. Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana. La Habana, Cuba.
^IIIMáster en Ciencias. Especialista de I Grado en Medicina General Integral e Histología. Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana. La Habana, Cuba.

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RESUMEN

Se determinaron los efectos del etanol sobre las características histológicas de las aortas de conejos tratados con dieta hipercolesterolémica y etanol para evaluar el posible efecto protector de este último en la aterosclerosis. Se utilizaron 20 conejos machos de 100 días y se conformaron 4 grupos de animales: tratados con etanol, con dieta hipercolesterolémica, con etanol y dieta hipercolesterolémica y un grupo control. El experimento se extendió por 16 semanas. Se utilizaron las técnicas histológicas: Sudán IV, Hematoxilina y Eosina, Orceína, Picro-Ponceau y Tricrómica de Mallory. Los animales con dieta hipercolesterolémica mostraron denudación del endotelio con tumefacción moderada de las células endoteliales, células espumosas en el subendtelio y agregados extracelulares de lípidos e infiltrado linfocitario moderado. Los animales con dieta y alcohol presentaron alteraciones más extensas, grandes áreas de denudación endotelial, células endoteliales con tumefacción intensa, subendotelio muy engrosado con células espumosas de gran tamaño, extensas áreas de lípido extracelular e infiltrado linfocitario, abundantes fibras colágenas y láminas elásticas internas con evidencias de estar fragmentadas. Estos resultados revelaron que el etanol no posee efecto protector eficiente, al menos a las dosis y condiciones utilizadas.

Palabras clave: Adolescencia, alcoholismo, aterosclerosis, dieta hipercolesterolémica, aorta.

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ABSTRACT

ects of ethanol on the histological characteristics of ethanol- and hypercholesterolemic diet-treated rabbits´ aorta were determined to evaluate the possible protective effect of this element on atherosclerosis. Twenty male rabbits were used for 100 days, divided into 4 groups: the first treated with ethanol, the second with hypercholesterolemic diet, the third with both ethanol and hypercholesterolemic diet, and a control group. The experiment lasted 16 weeks. The histological techniques were Sudan IV, Hematoxillin, Eosin, Orcein, Picro-Ponceau and Mallory´s Tricrómica. The animals under hypercholesterolemic diet showed denudation of the endothelium with moderate tumefaction in endothelial cells, foaming cells in the subendothelium and extracellular aggregates of lipids and moderate lymphocytic infiltrate. The rabbits subjected to ethanol and diet presented with more extensive alterations, larger endothelial denudation areas, endothelial cells with intense tumefaction, very thickened subendothelium with big foaming cells, extensive extracellular lipid areas and lymphocytic infiltrate, abundant collagen fibers, and internal elastic plates with signs of fragmentation. These results revealed that ethanol does not have any protective effect, at least at the doses and under the conditions used in this study.

Key words: Adolescence, alcoholism, atherosclerosis, hypercholesterolemic diet.

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INTRODUCCIÓN

El alcoholismo es un problema de salud en todos los países desarrollados.^1-4 El alcohol es una sustancia fácilmente disponible y su consumo está amparado por costumbres sociales y culturales. En España se relaciona directamente con unas 8 000 muertes al año, se asocia al 35% de los suicidios, al 75% de los casos de violencia doméstica y al 50 % de los accidentes de tráfico.¹ Se plantea que alrededor del 70 % de la población mundial, por encima de los 15 años, ingiere alcohol en determinada cantidad, del 3 al 5 % son dependientes y, de ellos, el 10 % se convertirán en bebedores-problemas en algún momento de su vida.²

En las últimas décadas se ha comprobado que la ingestión de bebidas alcohólicas se ha ido incrementando de forma alarmante e indiscriminada entre los jóvenes y adolescentes.⁵

El consumo abusivo de bebidas alcohólicas entre los jóvenes y adolescentes, puede ser el resultado del estilo de vida actual, de niveles elevados de estrés, ansiedad, baja autoestima, sentimientos depresivos, susceptibilidad a la presión de los pares y problemas escolares.⁵ Hace más de dos décadas el alcohol ocupa el primer lugar de consumo entre los estudiantes a nivel mundial y presenta un patrón de consumo esporádico, intensivo, fuera del hogar y con sus pares.^2,5,6

En Cuba se ha elevado el consumo de bebidas alcohólicas entre los adolescentes, no obstante, son limitadas las investigaciones sobre el uso de alcohol en estas poblaciones.

La aterosclerosis y sus principales consecuencias orgánicas se consideran la primera causa de muerte en todos aquellos países en los que las infecciones no ocupan este lugar preponderante.^7,8 En investigaciones realizadas se ha planteado que los factores de riesgo de la enfermedad cardiovascular aterosclerótica están también presentes en los niños y adolescentes.⁹

La relación entre el consumo de alcohol y la aterosclerosis es un tema controversial entre diversos investigadores. Muchos autores plantean que el consumo de etanol puede ser un factor de riesgo en el desarrollo de aterosclerosis y enfermedad coronaria.^10-12 Otros, en cambio, le confieren al etanol un efecto protector contra la aterosclerosis, al menos, a dosis moderadas.^13,14

Todo lo antes expuesto hace que el estudio del alcoholismo en la adolescencia sea un importante problema para la salud pública, y por otra parte, la utilización de modelos experimentales animales puede servir para aclarar aspectos importantes en el estudio de esta enfermedad, sus consecuencias y en su tratamiento

En el presente trabajo se pretende determinar los efectos del etanol sobre las características histológicas de las aortas de conejos machos que ingieren dieta hipercolesterolémica durante la adolescencia.

MÉTODOS

Se emplearon 20 conejos raza Nueva Zelanda, machos de 100 días de vida posnatal. Con ellos se conformaron cuatro grupos de idéntico tamaño: A, B y C experimentales; D control. La asignación a cada uno de los grupos se realizó utilizando una tabla de números aleatorios. Los grupos quedaron conformados del siguiente modo: A tratado con etanol, B tratado con dieta hipercolesterolémica. C tratado con etanol y dieta. D control

Para el tratamiento con etanol utilizó este al 40 % diluido en agua, a razón de 3 g por kg de peso corporal en una sola dosis diaria durante 5 días de la semana por un período de 16 semanas. La vía de administración fue la oral, ad libitum. Se midió la cantidad de agua ingerida diariamente por los animales y se halló una media de estas cantidades. Se les suministró sólo esa cantidad de agua diaria para procurar que consumieran la dosis total de etanol diario.

Para el tratamiento con dieta rica en colesterol se utilizó pienso experimental código CME 1403 elaborado en la fábrica de pienso del Centro para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). El pienso experimental fue elaborado con colesterol al 1,5 %. A los conejos alimentados con dieta no aterogénica se les suministró pienso habitual para conejos elaborado en el centro antes citado. Todos los conejos se colocaron en jaulas individuales con agua ad libitum y se mantuvieron en iguales condiciones ambientales e higiénicas.

Los conejos se pesaron todas las semanas y con los valores obtenidos se calculó la cantidad de etanol a suministrar cada día de la semana. Para efectuar la pesada se utilizó una balanza marca Yamamoto LM-3200. Los valores obtenidos se expresaron en kilogramos. Al finalizar las 16 semanas los conejos fueron sometidos a eutanasia y se procedió a extraer la aorta desde el arco aórtico hasta la bifurcación.

Las aortas se fijaron en formol al 4 % taponado se colorearon con Sudán IV¹⁵para observar lesiones macroscópicas de estrías grasa, se tomaron fragmentos para estudio histológico que se procesaron por el método de la parafina. Para este tipo de estudio se obtuvieron cortes de 7 micrómetros que se colorearon con hematoxilina y eosina (H/E),¹⁵ para estudiar las túnicas de la arteria. Se utilizó la técnica de orceína para observar las membranas elásticas¹⁵ y para estudiar las fibras colágenas se utilizó las técnicas de Picro-Ponceau y tricrómica de Mallory.¹⁵

Se valoraron los siguientes indicadores histopatológicos: tumefacción y denudación del endotelio. En el subendotelio se valoró la presencia de células espumosas, lípido extracelular y presencia de infiltrados de células inflamatorias. Para evaluar estas variables histopatológicas se utilizó la siguiente escala convencional:

- Tumefacción de las células endoteliales:¹⁶ se definió como tal a aquella alteración protoplasma celular, en la que este aumenta de volumen y se vuelve opaco. Se consideró ligera cuando el citoplasma estaba ligeramente aumentado de tamaño y con el núcleo protruyendo hacia la luz. Se estimó como tumefacción moderada al aumento franco del citoplasma celular y con aparente aumento del tamaño del núcleo, el cual ya no protuye hacia la luz del vaso. Por último se consideró tumefacción intensa al aumento del citoplasma con abundantes vesículas claras en su interior y con un núcleo de gran tamaño.
- Denudación del endotelio:¹⁷ se consideró denudación ligera a la presencia de células endoteliales aisladas con signos de muerte celular por apoptosis que alternan con células en mitosis. Se estimó de moderada a zonas focales y pequeñas desprovistas de células endoteliales y con células de este linaje en mitosis en los extremos. Y por último se consideró denudación intensa a aquellas áreas extensas desprovistas de células endoteliales, donde no se observan células en mitosis.
- Células espumosas:¹⁶ son células localizadas en el subendotelio con núcleos bien definidos, límites celulares precisos y citoplasma donde se observan vacuolas de lípido que se tiñen con la técnica de Sudan IV.
- Lípido extracelular:¹⁶ se definió como tal al material depositado en el subendotelio y entre las células que no se colorea con H/E y que resultó positivo con la técnica de Sudán.
- Inflamación:¹⁶ como criterio de este indicador se tomó en consideración la presencia o no de leucocitos de la sangre de la íntima arterial.

Se evaluó la lámina elástica interna de la arteria para lo cual se valoraron los siguientes indicadores:¹⁷

- Conservada: lámina elástica interna bien definida que se colorea de forma intensa y homogénea con la técnica de orceína.
- Fragmentada: lámina elástica interna aparentemente disgregada, con fibras elásticas dispersas.
- Se valoró además la presencia de fibras colágenas y elásticas en el subendotelio y la presencia de lípido en otras localizaciones fuera de la íntima.

RESULTADOS

La íntima de las aortas de los conejos controles mostró un aspecto normal. No se observó tumefacción en las células endoteliales, ni signos de regeneración celular. Tampoco se observaron vacuolas de lípido en el interior de las células endoteliales. El subendotelio apareció muy delgado y no se observaron células espumosas, ni agregados de lípido extracelular. Tampoco se observaron células inflamatorias. La lámina elástica interna apareció conservada (figura 1).

Los conejos tratados con etanol mostraron alteraciones ligeras en la íntima de sus aortas. Dichas alteraciones consistieron en la presencia de tumefacción moderada de las células endoteliales. No se observó ninguna zona de denudación endotelial. Tampoco se observaron signos de regeneración en estas células. Algunos animales presentaron un engrosamiento muy ligero del subendotelio debido a la presencia de células espumosas. No se observaron depósitos extracelulares de lípidos aunque sí se comprobó infiltrado leucocitario subendotelial ligero. La lámina elástica interna permaneció conservada (figura 2).

Los conejos tratados con dieta hipercolesterolémica mostraron extensas alteraciones en la íntima de sus aortas. Las mismas se caracterizaron por la presencia de tumefacción moderada de las células endoteliales y denudación del endotelio. Se observaron células endoteliales binucleadas. El subendotelio estuvo muy engrosado con abundantes células espumosas las que en su gran mayoría presentaron núcleos muy heterocromáticos. Se observaron también células espumosas con núcleos que dieron la impresión de estar fragmentándose. En el espacio subendotelial se observaron agregados extracelulares de lípidos y un infiltrado linfocitario moderado. Se observaron abundantes células binucleadas y células en mitosis. Se observó fragmentación de la lámina elástica interna (figura 3).

Los animales alimentados con dieta y alcohol presentaron grandes alteraciones en la íntima de sus aortas. Las células endoteliales presentaron tumefacción intensa en las zonas donde persistieron. Se apreciaron, además, extensas áreas de denudación endotelial. El subendotelio apareció muy engrosado con células espumosas de gran tamaño. En algunas los núcleos presentaron signos de lisis; en otras, no se observaron. Se apreció infiltrado linfocitario subendotelial moderado. Se comprobaron extensas áreas que no se colorearon con H/E y con reacción sudanófila. Se observaron abundantes fibras colágenas en el subendotelio. La lámina elástica interna mostró evidencias de estar fragmentada (figura 4).

DISCUSIÓN

En el presente trabajo se observó que los conejos que ingirieron dieta hipercolesterolémica y aquellos que ingirieron dieta y alcohol, desarrollaron lesiones ateroscleróticas en la aorta, principalmente en la porción torácica. Esto se comprobó al realizar la tinción macroscópica de Sudán con la que se visualizaron las lesiones presentes en la íntima de las aortas. Estas lesiones pueden ser catalogadas como estrías adiposas teniendo en cuenta los datos publicados en la literatura.¹⁷

Los hallazgos antes mencionados fueron corroborados por resultados de investigaciones anteriores,¹² donde se utilizaron técnicas de morfometría microscópica y microscópica. En estas investigaciones se observa que la superficie ocupada por estrías adiposas, así como los valores de grosor intimal y el número de células espumosas, son superiores en los animales que ingieren dieta hipercolesterolémica.¹²

Otros investigadores informan que en animales a los cuales se les induce aterosclerosis con ayuda de una dieta rica en colesterol se desarrollan lesiones aterogénicas a las pocas semanas de haber iniciado el tratamiento^10,18 Más aún, la hipercolesterolemia es un factor de riesgo de aterosclerosis sintomática en humanos.¹⁹

Los animales de la presente serie que ingirieron sólo etanol presentaron alteraciones muy ligeras en la íntima de sus aortas. En trabajos anteriores se ha comprobado mediante macróscopica que los animales que ingieren etanol presentan pequeñas áreas ocupada por estrías adiposas.¹² El presente estudio histológico confirmó la presencia de alteraciones histopatológicas que se manifiestan con un engrosamiento ligero del espacio subendotelial, con células espumosas e infiltrado linfocitario ligero. Por otra parte, los animales tratados con dieta y alcohol presentaron áreas ligeramente mayores ocupadas por estrías adiposas que en el grupo dieta. Estos resultados hacen pensar que el alcohol no posee un efecto protector eficiente al menos a las dosis empleadas en el presente estudio.

Más aún, el hecho de presentar alteraciones ligeras la íntima de las aortas de los animales tratados con etanol, hace pensar que quizás, con una dosis más elevada de etanol y/o con un tiempo más prolongado de tratamiento pudieran desarrollarse lesiones ateroscleróticas severas en estos animales.

El presente trabajo mostró grandes alteraciones en la íntima de las aortas de estos animales. A nivel del endotelio se observaron amplias zonas carentes de células endoteliales y células endoteliales en mitosis. Por debajo del endotelio se observó un ligero infiltrado de linfocitos, gran cantidad de células espumosas de gran tamaño con núcleos muy pequeños, así como grandes depósitos de lípido extracelular. Estos hallazgos revelaron un mayor desarrollo de la lesión aterosclérotica en estos animales con respecto a los del grupo tratado sólo con dieta rica en colesterol, lo cual corroboró la hipótesis que el alcohol lejos de proteger provoca mayor daño aterogénico.

La ausencia de células endoteliales y la presencia de algunas células mitóticas fueron interpretadas como signos de denudación endotelial. Al explicar este fenómeno algunos autores han planteado que el daño repetido al endotelio puede resultar en la pérdida de la capacidad de replicación de las células en las márgenes de la herida. Esto trae como consecuencia la no reparación de la lesión.¹⁷

Lo planteado hasta aquí confirma que el conejo es un modelo adecuado para el estudio de esta enfermedad como ha sido planteado en otros trabajos de investigación.^12,20

Los resultados del presente estudio son similares a otros informes de la literatura,^10-12 sin embargo, difieren de los planteados por otros autores.^13,14,21 Las diferencias encontradas pueden deberse a varios factores como son: la dosis, la vía y forma de administración del etanol. En el presente estudio se utilizó el etanol a razón de 3g/kg de peso corporal, al 40 % diluido en agua. La dosis diaria fluctuó entre 6-12mL de etanol en 500 mL de agua, de acuerdo al peso del animal. En uno de los trabajos antes mencionados se registran dosis de 2,5 mL de etanol en 500mL de agua.²¹ Esta es una dosis menor que la utilizada en el presente estudio lo cual pudiera explicar las diferencias entre los resultados del presente estudio y los de referencia.

Otro de los factores que pudiera explicar las diferencias mencionadas, es el tiempo de tratamiento. En este estudio los animales fueron tratados durante un período de 16 semanas. En otros trabajos el tratamiento fue de sólo 10 semanas.²¹ Quizás se pueda pensar que el efecto protector del etanol declina con el tiempo de tratamiento. Para corroborar esta idea serían necesarios estudios en esta dirección.

Por todo lo anterior se ha arribado a la siguiente conclusión: la administración de una dieta hipercolesterolémica a conejos adolescentes provoca lesiones ateroscleróticas en la íntima de la aorta que se corresponden con estrías grasas que la ingestión de dosis moderadas de etanol no evitan.

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Recibido: febrero de 2009.
Aprobado: marzo de 2009.

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