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Introducción
La medicina natural utilizada como tratamiento alternativo y/o complementario para contrarrestar enfermedades que son de gran preocupación en materia de salud pública, está cobrando cada vez más importancia.1,2,3 Por ello, la Organización Mundial de Salud considera a los productos naturales como fuente de nuevos fármacos a partir de extractos y/o aceites esenciales, extraídos de las plantas por diferentes métodos, tales como: el método de arrastre por deshidratación y destilación; y, el método de separación e identificación por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG/EM), con lo cual se obtienen compuestos químicos con actividad antimicrobiana, entre ellos flavonoides, fenoles, glicoles, y saponinas, entre otros.4,5,6,7) Adicionalmente, para evaluar la capacidad inhibitoria del crecimiento de microorganismos se pueden aplicar los métodos de difusión de Kirby - Bauer en discos o pocillos, también el de citofluorimetría (citometría de flujo), o bioluminiscentes, que valoran la sensibilidad de diferentes patógenos que pueden afectar la salud bucal, entre ellos: Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Cándida albicans (ATCC 10231).8,9,10,11
El Perú cuenta con una megadiversidad de plantas de más de 50 mil especies nativas, entre las que se encuentra la Minthostachys mollis (muña) Su aceite esencial es considerado como una de las grandes promesas de la etnofarmacología, de manera similar a algunos fármacos obtenidos por la vía industrial. (9,10
Existen pocas investigaciones sobre el efecto del aceite esencial de Minthostachys mollis frente a diferentes bacterias y hongos.12,13 Sin embargo, en estos estudios, se ha atribuido el efecto inhibitorio del aceite esencial de la muña a componentes químicos, tales como, terpenoides, monoterpenos, neomentol, pulegona, mentona, geraniol y citronelol, y se ha demostrado una buena efectividad antibacteriana frente al Staphylococcus aureus.
Otros estudios,9,14) reportaron resultados discrepantes en cuanto a la actividad antimicótica del aceite esencial de Minthostachys mollis frente a Cándida albicans, a diferentes concentraciones, comparado con el fluconazol.
Algunos experimentos in vitro10,15 con aceite esencial de Minthostachys mollis al 100 % a las 24 horas, llevados a cabo con el método Kirby Bauer, reportaron mayor efectividad antibacteriana frente a la Porphyromonas gingivalis, en comparación con la doxiciclina (50 mg) y la gentamicina sulfato (0,016 mg/mL). Además, Fuertes y Munguía,16 realizaron un estudio in vitro, para comparar la efectividad antibacteriana del aceite esencial de la muña, procedente de tres regiones del Perú: Tarma, Ancash y Huancavelica, y encontraron mayor efectividad de la muña que procedía de la región de Huancavelica, lo que puso en evidencia que la muña puede presentar variación de la composición química, en dependencia del lugar donde se desarrolla. Esto constituye un factor importante a considerar al evaluar su acción antimicrobiana.
Por lo antes expuesto, es que se planteó como objetivo de la investigación determinar la actividad del aceite esencial de Minthostachys mollis (muña), en diferentes concentraciones: 100 %, 75 %, 50 % y 25 %, comparado con la doxiciclina y el fluconazol frente a Porphyromonas gingivalis, Staphylococcus aureus y Candida albicans a las 24, 48 y 72 horas.
Métodos
Tipo y delimitación de la investigación
Esta investigación experimental in vitro, longitudinal y analítica fue aprobada por un comité de investigación de la Universidad Nacional Federico Villarreal en Perú, con resolución RR-75-2020-CU-2020. La parte experimental se llevó a cabo en el laboratorio de Microbiología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos de julio a noviembre del 2020.
Cálculo de tamaño de muestra y muestreo
La muestra estuvo constituida por 15 réplicas (n = 15) por subgrupos (24 h, 48 h y 72 h) y se calculó a partir de un estudio piloto por medio de la fórmula de comparación de medias, que consideró un α = 0,05 y un poder estadístico de 1- β = 0,80, con varianzas S1 2 = 0,8 y S2 2 = 1,1.
Las unidades de estudio se seleccionaron por muestreo aleatorio simple sin reposición. Los grupos se conformaron de la siguiente manera:
45 réplicas con Minthostachys mollis al 100 %.
45 réplicas con Minthostachys mollis al 75 %.
45 réplicas con Minthostachys mollis al 50 %.
45 réplicas con Minthostachys mollis al 25 %.
45 réplicas con Doxiciclina 50 mg/mL [Control (+)].
45 réplicas con Dimetilsulfóxido [Control (-)].
45 réplicas con Fluconazol 50 mg/mL [Control (+)].
45 réplicas con Poli Sorbato - 80 [Control (-)].
Cada grupo de 45 réplicas fue dividido en 3 subgrupos de 15 réplicas cada uno, para evaluar el efecto inhibitorio a las 24, 48 y 72 horas.
Recolección y elaboración del aceite esencial
Se recolectaron 80 kg de Minthostachys mollis del departamento de Huancavelica, Perú a 3000 metros sobre el nivel del mar. Posteriormente, una muestra de 2 kg de la planta fue remitida al herbario del Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos para su reconocimiento taxonómico, y la muestra fue identificada como Minthostachys mollis (021-USM-2019). Posteriormente, se seleccionaron las hojas y se retiraron otros elementos biológicos de la planta. Luego a los 80 kg de Minthostachys mollis se aplicó el método de arrastre de vapor de agua, del cual se extrajeron 22 mL de aceite esencial con un decantador o vaso Florentino. Seguidamente, el aceite esencial de Minthostachys mollis fue diluido con dimetilsulfóxido en concentraciones de 100 %, 75 %, 50 % y 25 %.
Procedimiento microbiológico
Las cepas de Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Cándida albicans (ATCC 10231), fueron obtenidas del laboratorio GenLab®.
Sobre la activación de las cepas, la bolsa que mantuvo la cepa liofilizada (Microbiologics®) permaneció a una temperatura entre 2 y 8 °C. Las cepas fueron activadas por un proceso de hidratación. Se presionó la ampolla con las cepas en la parte superior del empaque justo debajo del menisco para liberar el hidratante hasta que la suspensión estuvo homogénea. Acto seguido, se transfirió al caldo de tioglicolato (Merck®) y luego se colocó en la jarra de anaerobiosis (bbl GasPak®) durante 48 h a 37 °C en la incubadora Memmert®, junto con Anaerocult C®.
Se realizó el control de calidad del patrón de turbidez de 0,5 de McFarland bd bbl®. Para ello se agitó vigorosamente el patrón en un vórtice Thermolyne® y se comprobó la densidad de éste, determinando la absorbancia mediante un espectrofotómetro DR 6000 UV-VIS® con un haz luminoso a una distancia de 1 cm. La absorbancia a 625 nm dio un valor entre 0,08 y 0,10, luego se procedió con la preparación de la suspensión del inóculo de tal manera que se ajustara a 1,5 × 108 UFC/mL, de acuerdo con la turbidez estándar de 0,5 de McFarland. Esto se logró mediante el método de diluciones seriadas 1:10. La eficacia antimicrobiana fue evaluada mediante el método de difusión de Kirby-Bauer (pozo) en agar columbia + 5 % de sangre de cordero para la Porphyromonas gingivalis y en agar Mueller Hinton para el Staphylococcus aureus y Cándida albicans. Una vez temperado se vertieron 25 mL del agar en las placas Petri estériles, para dar un fondo uniforme de 2 mm, con 90 mm de diámetro y se dejó solidificar a temperatura ambiente.
Los halos de inhibición bajo el método de Kirby-Bauer fueron medidos a las 24, 48 y 72 horas con un vernier digital calibrado (Vogel, Alemania)® y se anotó en hoja de cálculo de Microsoft Excel 2019®. Para disminuir al máximo el sesgo de medición se utilizó la técnica de doble ciego, porque tanto el que midió los halos de inhibición, como el que hizo el análisis estadístico, desconocían la asignación de los grupos de acuerdo al producto empleado. Por otro lado, se hizo una calibración de medición de los halos inhibitorios del investigador principal, tanto intraexaminador (EP), como interxaminador (EP y CC) y se obtuvo un coeficiente de correlación R de Pearson de 0,96 y 0,91 respectivamente, lo que demostró muy buena concordancia.
Análisis estadístico
Los datos fueron recolectados en una ficha ad hoc e ingresados a una hoja de cálculo de Microsoft Excel 2019®, posteriormente fueron exportados y procesados con el paquete estadístico SPSS® (Statistical Package for the Social Sciences) versión 24. Para el análisis descriptivo se utilizaron medidas de tendencia central y dispersión, como la media y la desviación estándar y los resultados fueron resumidos en tablas de frecuencias. Adicionalmente, se realizó la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk y la prueba de homocedasticidad de Levene, cuyos resultados demostraron que los datos reunían los requisitos para aplicar pruebas paramétricas. Por ello se decidió contrastar la hipótesis con el análisis de ANOVA con un test de ajuste post hoc de Tukey y, además, se consideró un nivel de significancia al 95 % y un error tipo I.
Resultados
Por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas se identificaron 36 compuestos químicos que comprenden el 100 % de la composición total del aceite esencial de Minthostachys mollis proveniente de la ciudad de Huancavelica. A continuación, se reportan los principales compuestos identificados, de mayor a menor concentración (Tabla 1).
Tabla 1- Composición química del aceite esencial de Minthostachys mollis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
| Compuesto | Porcentaje en la muestra (%) |
|---|---|
| Pulegona | 30,17 |
| Mentona | 16,55 |
| Mentol | 15,23 |
| p-Mentanona | 10,49 |
| β -Cariofileno | 5,00 |
| Otros | 22,56 |
| Total | 100,00 |
Los halos de inhibición que logra el aceite esencial del Minthostachys mollis frente a la Porphyromonas gingivalis, tienden a disminuir respecto a la concentración y el tiempo. Por otro lado, la Minthostachys mollis al 25 %, tanto a las 24, 48 y 72 horas, no presentó actividad antimicrobiana frente al Porphyromonas gingivalis, tal como se puede apreciar al compararlo con el control negativo (Tabla 2).
Tabla 2- Variación de los halos de inhibición del aceite esencial de Minthostachys mollis, al 100 %, 75 %, 50 % y 25 % frente a la Porphyromonas gingivalis, a las las 24, 48 y 72 horas
| Grupo | h | n | Media | Desviación estándar | ANOVA p-valor | Prueba Tukey p-valor | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 48 h | 72 h | ||||||
| Minthostachys Mollis 100 % | 24 | 15 | 10,2 | 0,2 | 0,001* | 0,001* | 0,001* |
| 48 | 15 | 9,8 | 0,2 | - | 0,001* | ||
| 72 | 15 | 9,6 | 0,1 | - | - | ||
| Minthostachys Mollis 75 % | 24 | 15 | 9,1 | 0,3 | 0,001* | 0,001* | 0,001* |
| 48 | 15 | 8,8 | 0,2 | - | 0,001* | ||
| 72 | 15 | 8,5 | 0,2 | - | - | ||
| Minthostachys Mollis 50 % | 24 | 15 | 7,8 | 0,5 | 0,001* | 0,001* | 0,001* |
| 48 | 15 | 7,2 | 0,3 | - | 0,001* | ||
| 72 | 15 | 6,9 | 0,3 | - | - | ||
| Minthostachys Mollis 25 % | 24 | 15 | 6,0 | 0,0 | 0,988 | - | - |
| 48 | 15 | 6,0 | 0,0 | - | - | ||
| 72 | 15 | 6,0 | 0,0 | - | - | ||
| Control (+) | 24 | 15 | 11,0 | 0,3 | 0,001* | 0,001* | 0,001* |
| 48 | 15 | 10,3 | 0,2 | - | 0,001* | ||
| 72 | 15 | 9,2 | 0,3 | - | - | ||
| Dimetilsulfóxido Control (-) | 24 | 15 | 5,9 | 0,3 | 0,765 | - | - |
| 48 | 15 | 5,9 | 0,4 | - | - | ||
| 72 | 15 | 5,9 | 0,3 | - | - | ||
*Diferencias significativas (p < 0,05); h: horas, n: número de réplicas.
Los halos de inhibición que logra el aceite esencial del Minthostachys mollis frente a la Staphylococcus aureus, tiende a disminuir respecto a la concentración y el tiempo. Por otro lado, la Minthostachys mollis al 25% tanto a las 24, 48 y 72 horas, no presentaron actividad antimicrobiana frente al Staphylococcus aureus, tal como se puede apreciar al compararlo con el control negativo. (Tabla 3).
Tabla 3 Variación de los halos de inhibición del aceite esencial de Minthostachys mollis al 100 %, 75 %, 50 % y 25 % frente al Staphylococcus aureus, a las 24, 48 y 72 horas
*Diferencias significativas (p < 0,05); h: horas, n: número de réplicas.
Los halos de inhibición que logra el aceite esencial del Minthostachys mollis frente a Candida albicans, tienden a disminuir respecto a la concentración y el tiempo. Por otro lado, la Minthostachys mollis al 25 %, tanto a las 24, 48 y 72 horas, no presentó actividad antimicrobiana frente a Candida albicans, tal como se puede apreciar al compararlo con el control negativo (Tabla 4).
Tabla 4- Variación de los halos de inhibición del aceite esencial de Minthostachys mollis al 100 %, 75 %, 50 % y 25 % frente a Candida albicans, a las 24, 48 y 72 horas
| Grupo | h | n | Media | Desviación estándar | ANOVA p-valor | Prueba Tukey p-valor | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 48 h | 72 h | ||||||
| Minthostachys mollis 100 % | 24 | 15 | 9,8 | 0,6 | 0,001* | < 0,001* | < 0,001* |
| 48 | 15 | 8,9 | 0,7 | - | - | ||
| 72 | 15 | 8,5 | 0,5 | - | - | ||
| Minthostachys mollis 75 % | 24 | 15 | 8,4 | 0,7 | 0,001* | < 0,001* | < 0,001* |
| 48 | 15 | 7,7 | 0,4 | - | - | ||
| 72 | 15 | 7,5 | 0,2 | - | - | ||
| Minthostachys mollis 50 % | 24 | 15 | 7,3 | 0,3 | 0,124 | - | - |
| 48 | 15 | 7,2 | 0,2 | - | - | ||
| 72 | 15 | 7,4 | 0,3 | - | - | ||
| Minthostachys mollis 25 % | 24 | 15 | 6,0 | 0,0 | 0,990 | - | - |
| 48 | 15 | 6,0 | 0,0 | - | - | ||
| 72 | 15 | 6,0 | 0,0 | - | - | ||
| Control (+) | 24 | 15 | 9,4 | 0,6 | 0,001* | < 0,001* | < 0,001* |
| 48 | 15 | 7,7 | 0,8 | - | < 0,001* | ||
| 72 | 15 | 6,6 | 0,4 | - | - | ||
| Control (-) | 24 | 15 | 5,9 | 0,3 | 0,821 | - | - |
| 48 | 15 | 5,9 | 0,4 | - | - | ||
| 72 | 15 | 5,9 | 0,4 | - | - | ||
*Diferencias significativas (p < 0,05); h: horas, n: número de réplicas.
Al comparar los halos de inhibición entre las concentraciones de Minthostachys mollis al 100 %, 75 %, 50 % y 25 % y el control (+) y control (-), de acuerdo al tiempo, se pudo observar que hubo diferencias significativas (p < 0,001) entre las 24, 48 y 72 horas (Tabla 5).
Tabla 5- Halos de Inhibición del aceite esencial de Minthostachys mollis al 100 %, 75 %, 50 % y 25 % frente a Candida albicans a las 24, 48 y 72 horas
| Tiempo | Minthostachys Mollis (%) | ANOVA p-valor | Prueba Tukey p-valor | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 75 % | 50 % | 25 % | Control (+) | Control (-) | |||
| 24 horas | 100 % | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* |
| 75 % | - | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | ||
| 50 % | - | - | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | ||
| 25 % | - | - | - | < 0,001* | < 0,001* | ||
| Control (+) | - | - | - | - | < 0,001* | ||
| 48 horas | 100% | < 0,001* | < 0,001* | <0,001* | <0,001* | < 0,001* | <0,001* |
| 75 % | - | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | <0,001* | ||
| 50 % | - | - | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | ||
| 25 % | - | - | - | < 0,001* | < 0,001* | ||
| Control (+) | - | - | - | - | < 0,001* | ||
| 72 horas | 100 % | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* |
| 75 % | - | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | ||
| 50 % | - | - | < 0,001* | < 0,001* | < 0,001* | ||
| 25 % | - | - | - | < 0,001* | < 0,001* | ||
| Control (+) | - | - | - | - | < 0,001* | ||
*Diferencias significativas (p < 0,05).
Discusión
La comunidad científica y la medicina alternativa y complementaria buscan la obtención de nuevos agentes terapéuticos, que sean de fácil acceso y posean una acción antimicrobiana probada.1,4,7,8 En esta investigación, el aceite esencial de Minthostachys mollis al 100 %, 75 %, 50 % y 25 % logró efectos inhibitorios frente a la Porphyromonas gingivalis, al Staphylococcus aureus y a la Candida albicans, aunque su acción antibacteriana fue superior a la antimicótica, a las 24, 48 y 72 horas.
En este estudio se recolectó Minthostachys mollis proveniente de la ciudad de Huancavelica, ya que en investigaciones anteriores se había reportado que dicha planta, proveniente de esta región, presenta mayor efecto inhibitorio frente a bacterias y hongos, en comparación con las que crecen en otras regiones del Perú.16) Por otro lado, para identificar los componentes químicos de la Minthostachys mollis se empleó la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas de donde se obtuvo: pulegona 30,17 % y mentona 16,55 %. Algunos estudios atribuyen a estos compuestos la acción inhibitoria frente a las bacterias y hongos.12,13) Es probable que el efecto inhibitorio del aceite esencial de Minthostachys mollis en microorganismos, se deba a que tanto los terpenos como la pulegona y la mentona pudieran afectar la actividad de las enzimas catalizadoras a nivel de la membrana citoplasmática y actuar como desacopladores, los cuales obstaculizarían la translocación de protones, y de esta manera interrumpirían su metabolismo celular.10,12,13
Por otro lado, es importante destacar que la presencia de compuestos fenólicos en el aceite esencial de Minthostachys mollis, en dependencia de su concentración, pudiera influir en la estabilidad de las propiedades antimicrobianas que presenta el producto en el transcurso del tiempo,12,17 lo que bien pudiera explicar la disminución del efecto antimicrobiano del aceite esencial de Minthostachys mollis obtenido en la presente investigación desde las 24 horas hasta las 72 horas.
El aceite esencial de Minthostachys mollis al 100 %, presentó efectividad antimicrobiana frente al Staphylococcus aureus a las 72 horas, con un halo inhibitorio de 9,4 mm. Estos resultados fueron concordantes con lo reportado por Campos y otros12 y difieren a la vez de Montero y otros,4 quienes bajo el mismo método empleado en la presente investigación (Kirby - Bauer), con el aceite esencial de Minthostachys mollis al 100 %, obtuvieron a las 24 horas, halos de inhibición de 21,15 mm frente a Staphylococcus aureus. Probablemente estas diferencias se deban a que este último estudio se realizó en otra zona geográfica, lo que bien podría haber influido en la concentración de los componentes químicos antibacterianos y antifúngicos de la Minthostachys mollis.16,17
En la presente investigación se obtuvo una mayor efectividad antimicrobiana frente al Staphylococcus aureus y Porphyromonas gingivalis, comparado con el grupo control positivo empleado (doxiciclina de 50 mg), similar a lo obtenido por Rojas y otros.13 Sin embargo, estos resultados discrepan con el estudio realizado por Huari,15) puesto que diluyó Minthostachys mollis al 100 % con dimetilsulfóxido a las 24 horas, y obtuvo halos inhibitorios de 13,6 mm frente a una bacteria grampositivo como el Streptococcus mutans, mientras que en la presente investigación se obtuvieron halos de 10,4 mm frente a una bacteria grampositivo como el Staphylococcus aureus y 10,2 mm frente a una bacteria gramnegativo como la Porphyromonas gingivalis, bajo la misma concentración y el mismo período de tiempo. Probablemente estas diferencias se deban a que Huari15 empleó aceite esencial de Minthostachys mollis proveniente de otra zona geográfica del Perú, lo que pudiera afectar la concentración de los compuestos químicos antibacterianos presentes en las hojas de la planta.16,17,18)
En la actualidad, es frecuente observar en la cavidad oral las infecciones a causa de bacterias y hongos;19,20) por ello, esta investigación aporta datos importantes sobre las propiedades antibacterianas y antifúngicas de la Minthostachys mollis (M. mollis) frente al Staphylococcus aureus, a la Porphyromonas gingivalis y a la Candida albicans. Esto permitiría recomendar la investigación y la aplicación de la M. mollis en el campo clínico como enjuagatorio bucal o como componente coadyuvante de una pasta dental para prevenir la candidiasis y enfermedades periodontales en poblaciones vulnerables, ya que en América Latina la M. mollis es de fácil acceso y su adquisición presenta un bajo costo.
Dentro de las limitaciones encontradas en la ejecución de este proyecto, se reconoce que el tipo de estudio llevado a cabo no permite extrapolar estos resultados al campo clínico, por lo que resulta importante dar continuidad a esta línea de investigación de la Minthostachys mollis y evaluar su efecto antibacteriano en biofilm proveniente de muestras clínicas.
Se recomienda realizar estudios de efectividad antimicrobiana de los compuestos químicos de la Minthostachys mollis, como la pulegona y mentona frente Staphylococcus aureus, Porphyromonas gingivalis y Candida albicans; ya que, probablemente sean los principales responsables de la acción antimicrobiana de la Minthostachys mollis. Por otro lado, sería importante evaluar la combinación de la Minthostachys mollis con antibióticos sintéticos para verificar si existe sinergia significativa.
En conclusión, el aceite esencial de Minthostachys mollis al 100 % presentó su mejor efectividad inhibitoria frente al Staphylococcus aureus, la Porphyromonas gingivalis y la Candida albicans a las 24 horas. Sin embargo, su efecto fue significativamente menor que la doxiciclina y el fluconazol, cuya eficacia más acentuada se observa frente a las bacterias. Además, el efecto antibacteriano y antimicótico de la Minthostachys mollis al 100 % disminuye significativamente a medida que pasa el tiempo.
