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Introducción
La enfermedad de Wilson (EW, MIM 277 900) se caracteriza por la acumulación de cobre en diversos órganos, fundamentalmente en hígado, cerebro, riñones y córnea. No cuenta con un único criterio de diagnosis y requiere varias pruebas porque se asocia a diferentes manifestaciones clínicas.1 El diagnóstico clínico y molecular se considera muy complejo,2 aunque este último resulta definitivo con gran heterogeneidad mutacional.3
La proteína ATP7B, transportadora de cobre en la célula, depende de la codificación del gen atp7b, cuyas mutaciones provocan la enfermedad de Wilson. Se identificaron más de 900 mutaciones en diversas poblaciones.4 Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés) se distribuyen en todo el gen atp7b y constituyen marcadores moleculares para diagnosticar la enfermedad.
Los polimorfismos p.Arg952Lys y p.Val1140Ala se localizan en los exones 12 y 16 del gen atp7b, respectivamente. Se han identificado en países como China,5 Rusia6 y Taiwán.7 Los SNP se utilizan en la construcción de los haplotipos en familias con al menos un caso de la enfermedad de Wilson; además, posibilitan el diagnóstico molecular.8
Para determinar los marcadores moleculares en el gen atp7b se requiere una adecuada tecnología de cribaje. El polimorfismo conformacional de simple cadena (SSCP, por sus siglas en inglés) constituye una de las técnicas utilizadas para identificar en las muestras de ADN las modificaciones que pueden corresponder a polimorfismos o mutaciones.9 También se utiliza en la secuenciación del ADN.10
Asimismo, la probabilidad combinada (cPdel) estima el cambio aminoacídico en proteínas. Este algoritmo puede combinar los resultados de las cuatro herramientas bioinformáticas más utilizadas (Poly-phen-2, SIFT, PANTHER y PhD-SNP) para evaluar el efecto de los SNP en la función de las proteínas.11
El objetivo del presente trabajo fue identificar los cambios conformacionales en los exones 12 y 16 del gen atp7b, así como detectar polimorfismos en pacientes cubanos con diagnóstico clínico presuntivo de la enfermedad de Wilson.
Métodos
Se realizó un estudio descriptivo en el Centro Nacional de Genética Médica, durante el período 2015-2020. Se incluyeron 70 casos atendidos en las consultas del Instituto de Gastroenterología y diagnosticados con la enfermedad de Wilson. Los pacientes dieron su consentimiento para participar en la investigación, de acuerdo con los principios éticos de la Declaración de Helsinki. Esta investigación se aprobó por los consejos científicos y los comités de ética de las tres instituciones vinculadas al estudio: el Centro Nacional de Genética Médica, el Instituto Nacional de Gastroenterología y el Consejo Científico de la Universidad de Guantánamo.
Las manifestaciones clínicas se evaluaron por un equipo multidisciplinario (gastroenterólogos, genetistas, neurólogos, bioquímicos, hepatólogos, psicólogos y psiquiatras). Se siguieron los criterios establecidos para el diagnóstico de la enfermedad.8 Se seleccionaron los exones 12 y 16 del gen atp7b para detectar los cambios conformacionales e identificar los marcadores moleculares. A los pacientes se les extrajo el ADN mediante el método de precipitación salina,12 a partir de 10 ml de sangre periférica con ácido etildiaminotetraacético (EDTA) (56 mg/ml). Para la amplificación de los exones 12 y 16, mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se emplearon 100ng de ADN, los oligonucleótidos 12L (5´ TCATAGGTTGTAATTTCCCATG 3´), 12R (5´CAGGATCAATGTCAGTAGATTAT3´), 16F (5´ GTTCACAGTGAAATTGGACC 3´) y 16R (5´ ACTGTATTTCTGAGAGACGG 3´); 1mM de dNTPs (Boehringer), 10X tampón PCR, 15mM de MgCl2 y 0,25U de Taq polimerasa (Invitrogen), en un volumen de 25 μL.
Se realizó la electroforesis polimorfismo conformacional de simple cadena (SSCP). El ADN se visualizó gracias al método de tinción con plata, según las instrucciones del juego comercial kit PlusOne DNA Silver Staining (Amersham Biosciences, 2007). Los polimorfismos p.Arg952Lys y p.Val1140Ala se determinaron por comparación de las corridas electroforéticas, mediante la técnica de SSCP de controles positivos heterocigóticos y homocigóticos. Los controles positivos fueron las muestras de ADN de los pacientes heterocigóticos, y los homocigóticos se emplearon para los polimorfismos que donaron investigadores de los laboratorios Ospedale Regionale per le Microcitemie, Cagliari, Italia, y del Hospital Universitario de Munster, en Alemania.
Las muestras se secuenciaron por el método de Sanger, y los ADN se amplificaron por la técnica de PCR. La selección se basó en la cantidad de cambios conformacionales en los exones 12 y 16. Se purificó el producto de amplificación con el uso del juego comercial QIAquick PCR Purification (Qiagen, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó el secuenciador semiautomático ALFexpress II (Amersham Pharmacia Biotech, Suecia).
Cada polimorfismo detectado por secuenciación se confirmó por repetición y se observaron individuos de la misma familia. Los resultados se analizaron mediante el programa informático del equipo y se comparó con la secuencia del ADN de referencia del gen atp7b, GenBank NM000053. Cada muestra se secuenció dos veces. La frecuencia alélica se estimó como el número de alelos del polimorfismo de interés con relación al total de alelos estudiados. El valor de la probabilidad se determinó por la prueba de Fisher's con un nivel de significancia de p < 0,05.
La probabilidad combinada (cPdel) resultó útil para estimar un cambio aminoacídico en proteínas. Este algoritmo combinó los resultados de las cuatro herramientas bioinformáticas más utilizadas: Polyphen-2 (fenotipo de los polimorfismos), SIFT (transformación de características invariante de escala), PANTHER (análisis de proteínas mediante relaciones evolutivas) y PhD-SNP (predictor de la patogenicidad de las variantes). Todas permitieron evaluar el efecto de los polimorfismos de un solo nucleótido en la función de las proteínas.11
Resultados
La edad media de los pacientes con polimorfismo p.Arg952Lys fue de 30,2 años, con una desviación estándar de 12,8. El intervalo estuvo entre 8 (mínimo) y 52 años (máximo). Muy similar resultó el comportamiento etario de los casos con polimorfismo p.Val1140Ala, con una edad media de 31,4 años, una desviación estándar de 14,1; y un intervalo entre 11 (mínimo) y 56 años (máximo). La tabla 1 muestra los datos de los polimorfismos p.Arg952Lys y p.Val1140Ala en los pacientes cubanos con diagnóstico presuntivo de la enfermedad de Wilson y los controles negativos.
Tabla 1 - Polimorfismos p.Arg952Lys y p.Val1140Ala en pacientes y controles cubanos
| n | % | n | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| p.Arg952Lys |
|
G | 56 | 80,0 | 74 | 1 (Ref) | |
| A | 45 | 64,3 | 59 | 0,29 | 1,25 (0,67-2,35) | ||
| GG | 25 | 35,7 | 41 | 1 (Ref) | |||
| GA | 31 | 44,3 | 33 | 0,09 | 1,61 (0,86-3,03) | ||
| AA | 14 | 20,0 | 26 | 0,24 | 0,71 (0,34-1,49) | ||
| GA+AA | 45 | 64,3 | 59 | 0,29 | 1,25 (0,67-2,35) | ||
| T | 52 | 74,3 | 72 | 1 (Ref) | |||
| C | 52 | 74,3 | 62 | 0,06 | 1,77 (0,90-3,46) | ||
| p.Val1140Ala | rs1801249 | TT | 17 | 24,3 | 38 | 1 (Ref) | |
| TC | 35 | 50,0 | 34 | 0,02 | 1,94 (1,04-3,63) | ||
| CC | 17 | 24,3 | 28 | 0,35 | 0,82 (0,41-1,66) | ||
| TC+CC | 52 | 74,3 | 62 | 0,28 | 1,30 (0,65-2,62) | ||
Leyenda: *Valor de la probabilidad determinada por la prueba de Fisher's; Ref: referencia; CI: intervalos de confianza; NS: no significativa.
El cambio de guanina por adenina provocó el polimorfismo p.Arg952Lys, esto trajo consigo el intercambio del aminoácido arginina por lisina en la posición 2856 del gen atp7b. Este polimorfismo se localizó en el segmento de transmembrana TM5. Asimismo, la permuta de la citocina con la timina conllevó al polimorfismo p.Val1140Ala, y el aminoácido valina sustituyó a la alanina en la posición 3420 del gen atp7b. Este polimorfismo se ubicó en el lazo que une la ATP en la proteína para el transporte del cobre.
Las frecuencias de los polimorfismos p.Arg952Lys y el p.Val1140Ala resultaron de 42,1 % y 49,3 %, respectivamente. Se observaron diferencias significativas con las frecuencias informadas en la población de China, lo cual se relaciona con las diferencias en la ascendencia genética de estas poblaciones (tabla 2).
Tabla 2 - Frecuencias por países de los polimorfismo p.Arg952Lys y p.Val1140Ala
| p.Arg952Lys | Cuba | 42,1 % | 32,5 % | 4,87 | |||
| China3 | 59,7 % |
|
4,99 | 49,6 % | NS | ||
| Rusia4 | - | 47,1 % | NS | ||||
| Taiwán5 | - | 26,0 % |
|
||||
| p.Val1140Ala | Cuba | 49,3 % | 45,0 % | 4,91 | |||
| China | 64,1 % |
|
4,95 | 49,6 % | NS | ||
| Rusia | - | 43,1 % | NS | ||||
| Taiwán | - | 25,0 % |
|
Leyenda: NS: no significativa; EE: error estándar.
La tabla 3 presenta los datos del análisis de los polimorfismos p.Arg952Lys y p.Val1140Ala con herramientas bioinformáticas.
Tabla 3 - Análisis con herramientas bioinformáticas de los polimorfismos p.Arg952Lys y p.Val1140Ala
| p.Arg952Lys | 0,000 | 1,000 | Probablemente benigna | 0,25 | |
| p.Val1140Ala | 0,000 | 0,914 | Probablemente benigna | 0,022 | Complementación completa de levadura |
De los 70 pacientes con diagnóstico clínico presuntivo de la enfermedad de Wilson, se identificaron 31 heterocigóticos y 14 homocigóticos para el polimorfismo p.Arg952Lys por la técnica SSCP, cuya frecuencia alélica en los pacientes estudiados alcanzó el 42,1 %. Los cambios provocados por estas variantes polimórficas no afectaron la función de la proteína transportadora de cobre, atp7b, en humanos y se identificó en diversas poblaciones con una frecuencia mayor al 1 %.3,4,5
Las principales manifestaciones clínicas de los pacientes con el polimorfismo p.Arg952Lys o p.Val1140Ala fueron las hepáticas (78,8 % y 80,8 %, respectivamente); seguidas por la combinación de las hepáticas y las neurológicas (15,6 % y 15,4 %), las neurológicas (4,4 % y 1,9 %), y las mixtas: neurológicas y psiquiátricas (2,2 % y 1,9 %). Se identificaron los anillos de Kayser-Fleischer en dos y cuatro de los pacientes con los polimorfismos p.Arg952Lys y p.Val1140Ala, respectivamente. Se observaron tres individuos con manifestaciones hepáticas y neurológicas, dos con manifestaciones neurológicas, y uno con manifestaciones neurológicas y psiquiátricas.
Discusión
El polimorfismo p.Val1140Ala se ha identificado en América,6 Asia3,11 y Europa.12 La presencia de este gen en la población cubana podría explicarse por la ascendencia genética, pues se observó un porcentaje considerable de genes de origen caucásico.14 En diferentes países se han determinado los polimorfismos p.Arg952Lys y p.Val1140Ala, pero, como no se informan las frecuencias de los pacientes con la enfermedad de Wilson,6,12) no se pueden comparar los resultados ni construir los haplotipos con los diferentes marcadores moleculares; por tanto, se desaprovecha la oportunidad de ampliar el diagnóstico molecular.
El análisis de los polimorfismos p.Arg952Lys y p.Val1140Ala con programas bioinformáticos, como el SIFT, Polyphen-2 y Panther-PSEP, predice su benignidad. Sin embargo, cuando se compara el cPdel, el polimorfismo p.Arg952Lys resulta mayor que el polimorfismo p.Val1140Ala. Esto evidencia que el polimorfismo p.Arg952Lys modifica el fenotipo en pacientes con la enfermedad de Wilson.
Aunque se han determinado nuevas mutaciones en el gen atp7b,13,14,15,16 se realizan técnicas de microarrays16) y se utiliza la secuenciación de última generación.10) En Cuba se trabaja en el establecimiento de una estrategia para el diagnóstico molecular de la enfermedad de Wilson. Se tiene experiencia en la identificación de los polimorfismos en el exón 317 y la detección puntual de mutaciones en pacientes cubanos con diagnóstico presuntivo de la enfermedad de Wilson.18 En un futuro cercano se construirán los haplotipos en las familias cubanas y se podrá efectuar el diagnóstico molecular por métodos indirectos.
Varias investigaciones evidencian que algunos SNP varían las propiedades de la proteína ATP7B.19 De ahí, la importancia de estudiar estos polimorfismos, no solo como marcadores moleculares, sino también como modificares del fenotipo del paciente con la enfermedad de Wilson.
En humanos la presencia de K952 se asocia con una mayor fracción de cobre intercambiable en el suero;19 por tanto, en estudios posteriores se analizará la asociación de la variante K952 y el cobre intercambiable en suero en pacientes cubanos con la enfermedad de Wilson. Además de otras combinaciones de K952 con polimorfismos como K832, P991, L456, entre otros.
Los estudios clínicos y moleculares en los pacientes con la enfermedad de Wilson aportan un gran impacto en el diagnóstico y prevención de esta enfermedad.20 Los marcadores moleculares contribuyen a la detección para el pronóstico, y el tratamiento de los pacientes y sus familiares.
La técnica de SSCP y la secuenciación permiten identificar los polimorfismos p.Arg952Lys y p.Val1140Ala. Cuba dispone de herramientas moleculares para el diagnóstico de la enfermedad de Wilson. El estudio permitió registrar las familias cubanas con este diagnóstico a través de datos clínicos y genéticos. La información obtenida resulta valiosa para el seguimiento de los pacientes confirmados y el tratamiento personalizado con asesoramiento genético.
