Artículo de Revisión

Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos

Fundamentos metodológicos de los bioensayos de oxicidad/carcinogenicidad

Dr. Evelio E. Moreira Díaz<1>

RESUMEN

Las nuevas sustancias químicas que van a ser empleadas como medicamentos, alimentos o agroquímicos deben evaluarse previamente, para determinar los riesgos de dañar la salud antes que su uso se generalice. Para ello se han desarrollado caros y complejos sistemas de pruebas de corto plazo; estas pruebas se han dividido en in vitro o in vivo atendiendo a que se empleen células aisladas o modelos animales. En los últimos tiempos se ha puesto mucho énfasis en los sistemas in vitro dado el ahorro de tiempo, recursos materiales y factores relacionados con las campañas de protección de animales. Sin embargo, estas baterías de pruebas por sí solas son insuficientes para evaluaciones globales de toxicidad, y los estudios corporales de dosis repetidas son imprescindibles y mantienen toda su vigencia. Se presentan las principales consideraciones metodológicas que determinan que este tipo de bioensayos no pueda ser excluido en las evaluaciones de toxicidad, debido a la importancia de las interacciones entre células, entre células y tejidos, y entre los aparatos y sistemas morfofuncionales corporales, que sólo pueden conseguirse en el modelo animal. Se describen los criterios que se deben tener en cuenta en el diseño de las principales pruebas de tipo precrónicas y de toxicidad/carcinogenicidad en cuanto a niveles de dosis, especies, sexos y número de animales experimentales.

Palabras claves: EVALUACION DE MEDICAMENTOS; ANALISIS DE LOS ALIMENTOS: BIOENSAYOS.

INTRODUCCION

La exposición humana a nuevas sustancias debe ser siempre acompañada por una valoración del riesgo de dañar la salud, dicho sea de paso, este riesgo no puede ser evitado o predecido absolutamente, aun por el más cuidadoso y exhaustivo estudio científico experimental. La decisión para introducir una nueva molécula depende, en última instancia, del balance entre los riesgos y los beneficios.

Por otra parte, está bien establecido que los bioensayos pueden manifestar propiedades adversas de una droga, o sus metabolitos en varios sistemas biológicos, y que la extrapolación puede ser realizada al ser humano; esto se fundamenta en que la mayoría de los efectos farmacodinámicos pueden llevarse del animal al hombre. Por lo que las investigaciones en animales son el eslabón más importante en la cadena de evaluaciones toxicológicas de cualquier nuevo compuesto químico antes de ser administrado. Sin embargo, los modelos animales tienen algunas desventajas para registrar importantes efectos tóxicos, tales como: las sensaciones somáticas, los cambios de la audición, las pérdidas de la memoria, la concentración mental o la líbido, entre otros. Por ello, en la evaluación de riesgos los estudios con animales de laboratorio son insuficientes y resulta imprescindible realizar estudios en grupos de población humana, y aun más, mantener el monitoreo sistemático durante años de drogas, alimentos y otros que fueron introducidos después de rigurosas evaluaciones experimentales.

En los últimos años la eficacia de las investigaciones toxicológicas ha aumentado notablemente con el desarrollo de los sistemas de pruebas de corto plazo. Estas han sido metodológicamente perfeccionadas sobre la base de la experiencia histórica y las nuevas tecnologías. Un papel importante en el propio desarrollo de la toxicología como ciencia y su eficacia predictiva, lo ha proporcionado la calidad de los animales que actualmente se producen; verdaderos reactivos biológicos de los cuales se conocen con exactitud desde sus rasgos genéticos hasta sus promedios de patología tumoral espontánea, lo que permite una mayor confiabilidad de los resultados experimentales en la evaluación de las nuevas sustancias.

Para valorar adecuadamente las posibilidades de la experimentación toxicológica con animales de laboratorio, se debe recordar que en la época actual se han incrementado las presiones para revisar y reducir el uso de animales de laboratorio. Estos criterios no han sido motivados sólo por las consideraciones éticas y humanas que significa reducir el sufrimiento animal, sino también porque los experimentos con animales son generalmente difíciles de ejecutar, consumen tiempo y están sujetos a todos los problemas asociados con los límites de comparación entre especies y, por supuesto, requieren de una costosa infraestructura y personal altamente especializado.

En este artículo nos proponemos exponer las pautas metodológicas y de diseño que en general se siguen en los laboratorios de Toxicología experimental de las principales firmas internacionales de producción de drogas y alimentos, y que en términos generales son aceptadas por las agencias reguladoras y organismos gubernamentales encargados de la vigilancia de nocividad por agentes químicos.

FUNDAMENTOS DE LAS PRUEBAS TOXICOLOGICAS CON ANIMALES

Las investigaciones de laboratorio más completas para determinar riesgo humano son los estudios en animales de laboratorio; estas investigaciones son de obligada necesidad en la evaluación de productos químicos, como los componentes de alimentos, fármacos y agroquímicos. Hasta el presente, no hay dudas sobre la importancia práctica de las pruebas in vitro y de otros sistemas alternativos, pero éstas no pueden considerarse sustitutivas de los estudios con animales.1

La mayoría de las pruebas alternativas con sistemas celulares y componentes subcelulares pueden ayudar a entender los efectos y mecanismos a estos niveles. Pero estas pruebas tienen la limitación de no predecir la respuesta morfofuncional general del organismo.2

Las investigaciones que emplean animales son de distinta índole y, por supuesto, van dirigidas a evaluar diferentes situaciones relacionadas con la toxicidad de los compuestos, incluyen, además de las clásicas pruebas agudas, precrónicas y de larga duración, otros sistemas como los estudios de toxicidad reproductiva, reacciones alérgicas y de inmunotoxicidad.

Según investigadores como Rao,3 existen varias razones para el empleo de animales. Estos autores argumentan que en los estudios con células aisladas sólo se logran interacciones de los componentes subcelulares, y que en el caso de los animales se producen las mismas de célula a célula y entre células del mismo o de diferentes tipos de órganos, como, por ejemplo, hígado y riñón, timo y tejido linfoide, hipófisis y otras glándulas.

Estas respuestas sistémicas no pueden ser conseguidas con los sistemas alternativos. En resumen, en el animal hay un amplio y complejo mecanismo de retroalimentación entre órganos y tejidos ajustado a la variación química y a las modificaciones del medio ambiente, frente a las cuales el animal se compensa y sobrevive o sobrerreacciona y muere. Esto es imposible de conseguir en las pruebas in vitro o sistemas celulares aislados.

A pesar de las grandes diferencias anatómicas, fisiológicas, metabólicas y de muchos otros tipos que separan las especies e incluso rasgos individuales dentro de ellas, todos los seres vivos comparten una larga serie de caracteres comunes que permiten la comparación de datos obtenidos experimentalmente entre ellos y, por supuesto, con el hombre. Debe quedar claro que existen importantes excepciones a estas reglas generales de la estructura de los seres vivos; pero es un hecho innegable que en particular los mamíferos funcionan con más semejanzas bioquímicas y metabólicas que diferencias, y en ello se fundamenta el empleo de modelos animales para probar los compuestos químicos que por diferentes razones se van a poner en contacto con los seres humanos.

Debe recordarse que en el campo particular de los animales el problema de la evaluación toxicológica es extraordinariamente complejo, pues los productos alimenticios por regla general contienen cientos de compuestos, los cuales no ejercen sus acciones individualmente, sino que son capaces de interactuar entre ellos y afectar una amplia variedad de parámetros fisiológicos, por ejemplo, absorción/distribución, activación/desactivación de enzimas, metabolismo de ácidos grasos/hormonas, microflora/enzimas intestinales, pH y tránsito a través del tracto digestivo, órgano, especificidad, estado de radicales libre y sistema inmune, entre otros.

INVESTIGACIONES PRECRONICAS. ESTUDIOS DE 90 DIAS

Los estudios generalmente denominados subcrónicos, el autor prefiere llamarle precrónicos, son de gran importancia, sobre todo en las investigaciones de ingredientes de alimentos. Tienen una duración entre 28 y 90 días, en casos especiales pueden extenderse a 6 meses y se realizan para averiguar los efectos de la exposición repetida a una sustancia, e indicar las posibles acciones retardadas por la acumulación de un ingrediente.4 Por regla general el compuesto probado debe administrarse junto con el alimento o con el agua de beber. Las especies animales más empleadas son la rata y el ratón, las cuales por su tamaño y características facilitan la realización de los experimentos. En aquellos casos donde sea necesario estudiar situaciones muy particulares deben emplearse animales de mayor tamaño y biología más compleja. En tales casos se usan monos, cerdos, o perros de un linaje genético definido.

Los animales que se les realizan estos estudios deben evaluarse cuidadosamente. Los parámetros que se van a considerar deben incluir comportamiento clínico, absorción de agua y alimentos, excreción, eficiencia del alimento, curvas de crecimiento de peso corporal, peso de órgano, etcétera. Como parte de las evaluaciones hay que realizar estudios que incluyan hematócrito, hemoglobina y constantes corpusculares; estos parámetros ayudan a valorar los efectos potenciales sobre los sistemas hemopoyético e inmunológico. A pesar de las dificultades operacionales que incorporan a los estudios, deben realizarse evaluaciones del balance electrolítico y la función hepática y renal.

En la evaluación de las investigaciones es necesario tener muy en cuenta que en ocasiones existe una amplia variación biológica, y que estos datos son sólo de valor cuando se apartan francamente de los valores medios, y que su significado fundamental es como indicadores de efectos tóxicos.

Todos los animales de los experimentos deben ser necropsiados por especialistas calificados en evaluación anatomopatológica de animales de laboratorio. Los procedimientos de autopsia y procesamiento de los tejidos en el laboratorio deben realizarse siguiendo los lineamientos metodológicos establecidos por las guías de buenas prácticas de laboratorio reconocidas por la experiencia internacional o establecidas por los organismos reguladores de los respectivos países donde se va a introducir el agente químico.

En estas pruebas hay que realizar una minuciosa evaluación hística de los sistemas cardiovascular, inmunológico y nervioso

Los patólogos deben prestar especial cuidado a la detección de los efectos sobre las paredes de los vasos sanguíneos, el tejido linfoide y el riñón; de importancia extrema para las consideraciones de toxicidad son los estudios hepáticos. En caso de registrarse alteraciones, éstas deben investigarse cuidadosamente antes de decidir el uso del compuesto. Incluso, si se considera necesario deben realizarse nuevos estudios, con diseños específicos para precisar en detalles la característica del efecto adverso y sus implicaciones de riesgo toxicológico humano.

INVESTIGACIONES DE LARGA DURACION. TOXICIDAD/CARCINOGENICIDAD

Los bioensayos de toxicidad/carcinogenicidad se consideran dentro de las pruebas más importantes a las cuales tiene que ser sometido un compuesto destinado al consumo por seres humanos. En este sentido, la Agencia Internacional de Cáncer (IARC)5 ha definido que en ausencia de datos adecuados en el ser humano, es biológicamente plausible y razonable considerar como agentes cancerígenos aquellas sustancias que en las pruebas con animales de laboratorio se detecten evidencias de carcinogenicidad. Estas pruebas no sólo permiten reconocer la capacidad potencial de producir tumores, sino también posibilitan conocer sus efectos a largo plazo sobre los aparatos y sistemas corporales, lo que es de suma importancia a fin de valorar otras posibles influencias perjudiciales sobre la salud.

La ejecución de un bioensayo de toxicidad/carcinogenicidad es costosa y operacionalmente compleja. Esto se refleja en el 95 % de los estudios que se realizan en sólo 10 países,6 donde se reporta que el precio está alrededor del millón de dólares.7,8 Es evidente que dichos estudios tienen que realizarse por quipos de investigadores experimentados y en instalaciones de gran calidad tecnológica para que sus resultados sean admitidos por la comunidad científica y las agencias reguladoras de los diferentes países.

Estas investigaciones típicamente son conducidas en 2 especies de animales, de cepas altamente seleccionadas en grupos de 50 ó 60 machos/hembras por dosis. Generalmente se emplean 3 dosis partiendo de la llamada dosis máxima tolerada durante aproximadamente 24 meses. Actualmen te hay una fuerte tendencia de reducir el tiempo de las pruebas en 6 meses, siempre que las circunstancias de éstas lo permitan, lo que reduce significativamente los costos y el sufrimiento animal.9 En los últimos 5 años ha tomado cada vez más fuerza el criterio de realizar los estudios sólo en una especie,10 pues se ha comprobado que las ratas y ratones responden de forma similar a los cancerígenos, como se ha puesto de manifiesto en los resultados de las pruebas realizadas en 273 agentes químicos.11

Los investigadores que defienden estos criterios sostienen que la justificación para las 2 especies está mal definida, y que ello constituye una paradoja, pues si una sustancia posee la capacidad inherente para producir cáncer, una especie debe ser suficiente para detectarlo; pero si la especificidad carcinogénica depende de la especie, entonces la validez de los modelos para extrapolarlos al hombre es discutible. Por lo que existen compañías farmacéuticas de reconocido prestigio, como algunas firmas alemanas que realizan a partir del 1992 sus pruebas en una sola especie, la rata, a menos que existan razones científicas importantes que impliquen la necesidad de otra especie.10 Sin embargo, a pesar de la solidez de estos conceptos, los principales centros de evaluación toxicológica del mundo continúan en sus ensayos con el empleo de las 2 especies,12 y los organismos reguladores, por su parte, continúan exigiéndolas.

En el campo específico de la toxicología de los alimentos, contrario a lo que muchos especialistas piensan, los estudios de carcinogénesis no son siempre necesarios, pues en determinadas circunstancias pueden existir informaciones del compuesto que justifican prescindir de ellos. Una reconocida autoridad como Poulsen4 recomienda que si el ingrediente del alimento es un éster simple, que por hidrólisis produce metabolitos idénticos a los metabolitos normales, no es necesario realizar estos estudios.

Del mismo modo pueden ser innecesarios para evaluar péptidos, proteínas, carbohidratos y grasa que por investigaciones químicas y bioquímicas (incluyendo metabolitos) se ha demostrado que su estructura consiste en una secuencia de aminoácidos, cuyos efectos biológicos son bien conocidos. Los compuestos necesitan evaluaciones de larga duración, sólo si ellos van a emplearse en grandes cantidades o van a tener un uso generalizado en población abierta.

Especial cuidado hay que prestar a la composición de la dieta cuando el material probado es por sus características un nutriente, por ejemplo, proteínas industrialmente tratadas o féculas, pues tales productos son habitualmente incorporados en las dietas a niveles tan altos como del 20 al 60 % del peso del nutriente correspondiente.13

Los estudios metabólicos completos y los de cinética dependen de la naturaleza química del producto evaluado. La Comunidad Económica Europea14 centra la atención en los de cinética, pero considera también muy importante los estudios metabólicos, pues mediante ellos podría identificarse el metabolito responsable de un efecto toxicológico, lo que permite orientar las investigaciones complementarias con vistas a precisar sus capacidades para producir lesiones en órganos sensibles.

Siempre al concluir los ensayos de larga duración surgen preocupaciones cuando altas dosis del producto probado fueron administradas a los animales, y se detectaron efectos, pues éstos pueden deberse no sólo a una acción tóxica del agente, sino a una sobrecarga de las vías metabólicas normales. En tales casos los estudios metabólicos adicionales son útiles para indicar que un efecto adverso final está siendo equivocadamente considerado como una manifestación de toxicidad.

<1>Doctor en Ciencias Biomédicas. Profesor Titular de Anatomía Patológica del Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana. Jefe del Laboratorio de Patología Experimental del Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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4. Poulsen E. Relevance of endpoint in toxicity testing of food ingredients. Fd Chem Toxicol 1990;28:779-82.
5. International Agency for Research on Cancer. Approaches to classifying chemical carcinogens according to mechanism of action. Int Tech Rep 1987;(83):101.
6. Huff J. Scientific concepts, value and significance of chemical carcinogenesis studies. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1990;31:137-45.
7. Della Porta G. Long-term assays for carcinogenicity. Teratogenesis Carcinog Mutagen 1990;10:137--45.
8. Cameron TP. Methodological problems in chronic rodent bioassays in nordic workshop on toxicology. NLN 1987;(19):103.
9. FRAME: Animals and alternatives in Toxicology: present status and future prospects. ATLA 1991;19:116-38.
10. Speid LH. Harmonization of guidelines for toxicity testing of pharmaceuticals by 1992. Reg Toxicol Pharm 1991;12:179-211.
11. Wittenaw S von. The redundancy of mouse carcinogenicity bioassay. Fundam Appl Toxicol 1983;3:631--9.
12. Chaabra RS, Huff E. An overview of prechronic and chronic toxicity/carcinogenicity experimental designe and criteria used by the national toxicology program. Environ Health Perspect 1990;86:313--21.
13. Van Gelderen CEM, Savelkoul TJ, Sangster B. Safety studies in human I: Studies in food ingredients Fd Chem Toxicol 1990;28:771-3.
14. OECD. Guidelines for Testing of Chemical Organization for Economic Cooperation and Development. Paris, 1987.

Recibido: 19 de julio de 1993. Aprobado: 28 de septiembre de 1993.

Dr. Evelio E. Moreira Díaz. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos. Infanta No. 1158, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana 10300, Cuba.