Artículos Originales

Planta de Insulina y Hormonas

Cristalización de insulina: importancia del semillamiento en la calidad del producto final

Dr. Arturo Toledo Rivero,<1> Lic. Nelson Sierra Bravo,<2> Lic. Hilda Rodríguez Vázquez,<3> Lic. Roberto Orta Piñeiro,<4> Lic. María del C. Muñoz Báez,3 Dr. Miguel Bonera Alemán,<5> Ing. Miguel Marrero Castro<6> y Lic. Antonio Padilla Rubiera<7>

RESUMEN

Se compararon 2 procedimientos tradicionales de obtención de pequeños cristales de insulina para utilizarse como medio de semillamiento en procesos de cristalización, partiendo ambos de la liofilización de soluciones de insulina bovina altamente purificada. Experimentalmente se demostró que, para evitar el fenómeno de nucleación secundaria y, por ende, asegurar una buena uniformidad en el tamaño de cristales del producto final de insulina, se impone un semillamiento con cristales de alrededor de 2 m, obtenidos a partir de la liofilización de soluciones con la misma composición química del medio donde deben desarrollarse los cristales de semilla.

Palabras clave: CRISTALIZACION; INSULINA.

INTRODUCCION

La presente investigación se desarrolla con el objetivo de definir los métodos de recristalización de insulina altamente purificada de origen bovino, con vistas a establecer un procedimiento adecuado para la preparación de pequeños cristales suspendidos en medio acuoso a inocular, como medio de semillamiento, en el proceso de obtención del componente cristalino de parenterales de insulina de acción prolongada (tipo LENTE).

La obtención de cristales de insulina en el producto final con un tamaño entre 10 y 40 m según prescribe la Farmacopea USP-XXII, conlleva en gran medida a la inoculación de estos preparados a un medio de cristalización previamente acondicionado.

En el presente trabajo se analiza la influencia en cuanto a las características de los cristales utilizados como medio de semillamiento sobre el componente cristalino final, de acuerdo con el criterio de calidad anteriormente referido.

MATERIAL Y METODO

Se implementó un procedimiento básico que partió de la liofilización de soluciones de insulina cristalina de origen bovino altamente purificada, según lo encontrado en la literatura.1-3

Para este trabajo se utilizó una liofilizadora marca EDWARDS EF-6 con funcionamiento semiautomático. El liofilizado obtenido se inoculó a un medio de cristalización con un contenido de insulina bovina altamente purificada de alrededor de 1 % p/v, una proporción de 4 mg de iones Zn2+ por cada gramo de insulina (comprobado por espectrofotometría UV4) para garantizar una relación de 2 átomos de Zn2+ por cada hexámero, 0,2 % p/v de metil-p-oxibenzoato como preservativo, 0,1 % p/v de ácido cítrico y suficiente NaOH 2N para alcanzar un pH entre 6,6 y 6,8 en el medio.

Se ensayó una variante donde la liofilización se aplicó a soluciones con una composición química similar a la antes mencionada, con un contenido de 0,5 % p/v de insulina y aciduladas con HC1 0,04 N para alcanzar un pH de 3 (método A), y en otra, se aplicó a soluciones con la misma composición química que el medio de cristalización anteriormente descrito (método B). La medición del tamaño de la semilla en solución obtenida por ambas vías, se realizó en un microscopio óptico OLYMPUS BH-2, con el empleo de las técnicas de distribución de tamaño de partículas.

RESULTADOS Y DISCUSION

En total se realizaron 6 ensayos de obtención de semilla para inóculo en suspensión, 2 de ellos mediante el método A, donde se alcanzaron rangos de tamaño entre 2,5 y 15 m, y tamaños medios de 10 y 6,8 m, según sus distribuciones respectivas, por encima de las 5 m establecidas en la literatura.2

En el resto de los ensayos se empleó el método B; finalmente se obtuvieron cuerpos cristalinos aislados con rangos de tamaño entre 1 y 5 m y tamaños medios de 2,2 y 2,5 m.

Dichos preparados de semilla se inocularon en cantidades predeterminadas a soluciones de insulina porcina altamente purificada, debidamente acondicionadas para obtener el componente cristalino final con un tamaño de cristales entre 10 y 40 m según lo establecido en la literatura.3,5,6

En el caso de la inoculación de semilla de mayor tamaño, se observó durante los primeros instantes de tiempo del proceso de cristalización el predominio de 2 tamaños de cristales, a partir de los análisis de distribución de tamaño efectuados en el microscopio a intervalos de 1 h.

Esta situación se ilustra en la figura 1, donde se muestra la distribución de tamaño de cristales al cabo de 3 h en uno de los experimentos en que se inoculó al medio de cristalización, determinada cantidad del preparado de semilla con tamaño medio de cristales de 6,8 m. Sin embargo, en aquellos ensayos donde se efectuó la inoculación de semilla de alrededor de 2 m, se observó cómo se mantuvo una distribución de tamaño de cristales de tipo normal-logarítmica de amplitud muy pequeña durante todo el proceso de cristalización. Dicha situación se ilustra en la figura 2, para un experimento donde se inoculó determinada cantidad de preparado de semilla con tamaño medio de cristales de 2,2 m.

Evidentemente, la presencia de cristales de semilla de mayor tamaño induce el fenómeno de nucleación secundaria, el cual es indeseable durante la cristalización, pues promueve la aparición de pequeños cristales en el propio medio de cristalización que, a la larga, influyen negativamente sobre la necesaria uniformidad en la distribución de tamaño de los cristales del producto final, lo cual está estrechamente ligado a la uniformidad de las dosis de aplicación de insulina y, por ende, sobre su efecto de acción retardada en el paciente.

Ante este resultado, se decidió implementar un ensayo adicional, inoculando semilla de alrededor de 1,9 m de tamaño medio obtenida a partir del método B. En este caso se obtuvo un producto final con excelente distribución de tamaño de cristales.

En este sentido se decidió verificar la calidad, en lo que a distribución de tamaño de cristales se refiere, del producto final desarrollado a partir de este procedimiento mediante su comparación con otros lotes de productos comercialmente reconocidos (I y II). Para ello, se realizó un muestreo de 3 bulbos de cada lote, y se efectuaron 3 mediciones por cada bulbo mediante la técnica de microscopia establecida por la Farmacopea.6

Los resultados del análisis estadístico realizado a las diferentes muestras se resumen en la tabla.

De acuerdo con los resultados de la tabla, las pruebas de hipótesis estadísticas realizadas,7 arrojaron la existencia de una diferencia significativa entre los tamaños medios de cristales de los diferentes lotes.

Asimismo, e independientemente que todos los productos analizados cumplen con el criterio de calidad exigido por la USP-XXII6 en cuanto al rango de tamaño de cristales permisible, es de destacar cómo la muestra del lote II refleja una mayor dispersión y variedad de tamaños que en los demás casos, luego dentro del propio cumplimiento de este importante requerimiento del inyectable para su biodisponibilidad, existe una relativa mayor probabilidad de administración de dosis menos uniformes que en los casos de las muestras del lote I y del propio ensayo objeto de comparación. Este resultado se ha corroborado de manera parcial, mediante pruebas biológicas efectuadas a animales según la Farmacopea.6

CONCLUSIONES

1. Para asegurar una buena uniformidad en el tamaño de cristales del producto final y , por ende, en cada dosis de insulina que se administre, se impone el empleo de cristales de semilla para inóculo de alrededor de 2 m, por lo que se recomienda el método B para la obtención de dichos preparados de semilla.
2. En la comparación del producto final obtenido a partir del procedimiento implementado a escala de laboratorio por muestreo y tratamiento estadístico, se demostró, en lo que a distribución de tamaño de partículas se refiere, que dicho producto está a la altura de los productos de insulina de acción prolongada de firmas reconocidas.

<1>Doctor en Ciencias Técnicas. Ingeniero Químico.

<2>Licenciado en Microbiología.

<3>Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.

<4>Licenciado en Química.

<5>Doctor en Ciencias Farmacéuticas.

<6>Ingeniero Químico.

<7>Licenciado en Química.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Schlichtkrull J. Insulin crystals IV: the preparation of nuclei, seeds and monodisperse insulin crystal suspensions. Acta Chem Scand 1957;11:299-302.
2. : Process for crystallization of insulin using freeze-dried insulin as seeding material. US patent 2, 819,999. 1958.
3. : Process of producing Insulin crystals of substantially uniform size and compositions thereof. US patent 2, 799,622. 1957.
4. Snell F. Photometric and fluorometric methods of analysis (metals). New York: J. Wiley and Sons, 1978:395-415.
5. Brange J. Galenics of insulin; insulin preparations. Berlin: Springer-Verlag, 1987;17-70.
6. United States Pharmacopoeial Convention. USP XXII. United States Pharmacopoeia. 22 ed. Easton: Mack Printing: 1990:692-94.
7. Philippe J. Methodes statistiques en pharmacie et en chimie. Paris; Masson, 1967:60-9.

Recibido: 8 de abril de 1994. Aprobado: 21 de mayo de 1994.

Ing. Arturo Toledo Rivero. Dirección de Desarrollo de la Industria Médico-Farmacéutica. Línea entre 4 y 6, Vedado, municipio Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba.