Planta de Insulina y Hormonas

Cristalización de insulina: factores que influyen en la cinética de crecimiento

Dr. Arturo Toledo Rivero,<1> Lic. Nelson Sierra Bravo,<2> Lic. María del C. Muñoz Báez,<3> Lic. Roberto Orta Piñeiro,<4> Lic. Hilda Rodríguez Vázquez,<5> Dr. Miguel Bonera Alemán,<6> Ing. Miguel Marrero Castro<7> y Lic. Antonio Padilla Rubiera<8>

RESUMEN

Se implementó un procedimiento de cristalización en soluciones de insulina porcina altamente purificada, basado en la inoculación de cristales de semilla con una distribución de tamaños conocida. Se comprobó que cualquier desbalance en la composición química del medio influye negativamente en la obtención de la esperada forma rombohédrica para el producto cristalino de insulina. Además, se demostró que la velocidad de crecimiento de los cristales en las primeras horas aumenta relativamente con la adición de surfactantes, aunque la mayor influencia está dada aún por la concentración de insulina en solución y el área superficial específica de los cristales.

Palabras clave: INSULINA; CRISTALIZACION.

INTRODUCCION

La presente investigación se desarrolla con el objetivo de definir los métodos de recristalización de insulina altamente purificada de origen porcino, con vistas a establecer, a mediano plazo, una tecnología adecuada para la obtención de parenterales de acción prolongada (tipo LENTE).

Para garantizar dicha acción prolongada en los pacientes, los cristales de insulina en el componente cristalino del producto final deben alcanzar un tamaño final entre 10 y 40 m según prescribe la Farmacopea.1

En el presente trabajo se analiza la influencia de factores de especial interés, tales como el contenido de iones Zn2+, el pH, el tamaño de semilla inoculada y la adición de un surfactante en el medio de cristalización sobre el proceso de crecimiento de los cristales.

MATERIAL Y METODO

Se implementó un procedimiento basado en la inoculación de volúmenes predeterminados de preparados de pequeños cristales de insulina en suspensión (semilla), con una distribución de tamaños conocida, a un medio de cristalización debidamente acondicionado acorde con lo encontrado en la literatura.2-5

Dicho medio de cristalización se prepara con un contenido de insulina porcina altamente purificada de alrededor de 1 % p/v, 7 % p/v de NaCl, una proporción entre 8 y 9 mg de iones Zn2+ por cada gramo de insulina para garantizar una relación de 4 átomos de Zn2+ por cada hexámero, así como un contenido equivalente a 0,1 M de acetato de sodio trihidratado y suficiente NaOH 2N para alcanzar un pH correspondiente al punto isoeléctrico de la insulina (entre 5,45 y 5,55). La composición química del medio en cuanto a concentración de Zn2+ fue verificada mediante técnicas de espectrometría de absorción atómica y espectrofotometría UV;1,6 en cuanto al contenido de Cl-, mediante el método establecido con nitrato de plata. Asimismo, se estudió la adición de polisorbato 80 como agente tensoactivo al medio de cristalización en determinados ensayos. El desarrollo de los cristales se observó mediante muestreos cada 1 h a través de un microscopio óptico OLYMPUS BH-2 y con el empleo de las técnicas de distribución de tamaño de partículas. De igual forma, se analizó el producto final obtenido a partir de su componente cristalino correspondiente.

RESULTADOS Y DISCUSION

A partir de Scott,7 en 1934, se ha demostrado como en un rango de pH entre 5 y 7 en presencia de suficiente contenido de iones Zn2+, la insulina forma complejos donde el Zn2+ es parte integrante de la estructura cristalina, de ahí su necesaria presencia en el medio de cristalización.8

En estas condiciones se plantea, como unidad mínima, la formación de complejos cristalinos de 2 átomos de Zn2+ por cada hexámero de insulina. No obstante, se ha demostrado que, la presencia de iones haluro como el Cl-, de ser éste adicionado al medio cristalino, promueve la formación de complejos cristalinos mejor estructurados de 4 átomos de Zn2+ por cada hexámero de insulina.3,9 La estructura de estos cuerpos cristalinos tiende fundamentalmente a la de formas rombohédricas que ya han sido estudiadas por diferentes investigadores (Schlichtkrull J. Insulin Crystals: Chemical and Biological Studies on Insulin Crystals and Biological Studies on Insulin Crystals and Insulin Zinc Suspensions, Thesis).

Asimismo, el pH no sólo asegura las necesarias condiciones de sobresaturación (mínima solubilidad de la insulina) en el medio de cristalización, sino que también interactúa con las demás variables, específicamente aquéllas relacionadas con la composición química del medio.10

En aquellos ensayos donde se comprobó que la composición química del medio era la adecuada, predominó la existencia de cristales rombohédricos, y se observó su presencia en las muestras analizadas a través del microscopio en una proporción entre 90 y 95 % del total de cuerpos cristalinos observados.

En los demás casos, donde aparece mayor cantidad de cristales rotos en una proporción entre 15 y 20 % del total de cuerpos cristalinos observados, se pudo comprobar la existencia de un déficit en el contenido de iones Cl-, lo cual produce un desplazamiento del estado de equilibrio hacia la formación de la estructura 2 Zn2+ por cada hexámero de insulina.

Esto unido a los resultados negativos obtenidos en cuanto al poco desarrollo del tamaño de los cristales en aquellos ensayos donde existía un déficit del contenido de iones Zn2+ en el medio de cristalización, llevó a corroborar la importancia de mantener un adecuado balance en el medio en lo que a composición química y pH se refiere para obtener, al final del proceso de cristalización, los resultados esperados.

En cuanto al tamaño de semilla, el área superficial específica (ASE), relacionada directamente con el tamaño y la geometría de los cristales, influye decisivamente en su velocidad de crecimiento, así como en su distribución de tamaño.

En la figura se observa que, a medida que el tamaño de la semilla es menor, y por ende mucho mayor el ASE, la cinética de crecimiento se incrementa de tal forma que, para cristales de partida de alrededor de 2 m al cabo de las 10 h se ha alcanzado prácticamente el máximo tamaño posible de cristales. Por otra parte, mediante la inoculación de semilla de mayor tamaño, como los casos de 6,8 y 10 m donde el ASE es menor, el desarrollo de los cristales se verifica de forma más lenta.

Teniendo en cuenta la posibilidad de incrementar la cinética de crecimiento de los cristales reduciendo la actividad superficial de la solución y su viscosidad, se decidió la realización de 2 ensayos adicionales en los que se mantuvieron las mismas condiciones en el medio de cristalización en cuanto a composición química, pH, etcétera, y se adicionó en uno de ellos, un surfactante (polisorbato 80) en suficiente proporción al medio.11

Como resultado de esta prueba se obtuvo, al final de ambos ensayos, un componente cristalino con una distribución de tamaños relativamente estrecha (entre 10 y 30 m, sólo que en el caso del ensayo con surfactante se obtuvo un tamaño medio de 23,1 ±0,3 m), mientras en el otro ensayo, se obtuvo un resultado de 23,0 ± 0,4 m (para un intervalo de confianza del 95 %).

Ante la posible duda de que la adición de surfactante hubiera influido positivamente en el tamaño final de los cristales, se llevó a cabo una prueba de hipótesis por diferencia donde se planteó, como hipótesis nula, la no existencia de diferencia significativa entre ambos tamaños de cristales alcanzados.12

Para un nivel de significación establecido del 95 %, se corroboró por vía estadística (pruebas F de Fisher y t de Student, ver tablas 1 y 2) la aceptación de la hipótesis nula, luego no existe diferencia significativa entre ambos ensayos desde el punto de vista del tamaño medio de los cristales, y por lo tanto, la adición de surfactante al medio de cristalización no contribuye decisivamente a la obtención de cristales de mayor tamaño al final del proceso de cristalización. Evidentemente, esta condición depende de la cantidad de insulina a cristalizar presente en el medio al inicio, la cual se mantuvo invariable entre un ensayo y otro.

No obstante, se detectó un relativo aumento en cuanto a la rapidez con que se llevó a cabo el proceso de cristalización. Baste decir que, sin la adición del surfactante en el medio de cristalización, se alcanzó un tamaño medio de 22 m en la primera hora, mientras que con la adición de surfactante se alcanzó en el mismo intervalo de tiempo, un tamaño medio de 23,4 m, lo cual significa un incremento de la velocidad de cristalización en los primeros instantes de tiempo de alrededor de 6,6 %. Dicho incremento puede ser no significativo a escala de laboratorio, pero sí puede adquirir relativa importancia en preparaciones de mayor volumen.

CONCLUSIONES

1. Cualquier desbalance en cuanto a la composición química del medio de cristalización, incluyendo el pH de la mezcla, influye negativamente en cuanto a la calidad del producto final de insulina obtenido. Dicho sistema de cristalización, que parte de soluciones de insulina altamente purificada e inoculadas en principio con pequeños cristales de semilla, se rige por las leyes clásicas de los fenómenos de transferencia de masa, cuya cinética está en relación directa con el ASE de transferencia y la concentración de insulina en solución.
2. Mediante el empleo de un surfactante a determinada concentración en el medio de cristalización, se logró incrementar la velocidad de crecimiento en los primeros instantes en el 6,6 %, no así la obtención de un componente cristalino final de mayor tamaño, lo cual es dominio por entero de la concentración de insulina en solución.

<1>Doctor en Ciencias Técnicas. Ingeniero Químico.

<2>Licenciado en Microbiología.

<3>Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.

<4>Licenciado en Química.

<5>Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.

<6>Doctor en Ciencias Farmacéuticas.

<7>Ingeniero Químico.

<8>Licenciado en Química.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. United States Pharmacopoeial. Convention. USP XXII. United States Pharmacopoeia. 22 ed. Easton: Mack Printing, 1990:692-4.
2. Schlichtkrull J. Insulin crystals II: shape of Rhombohedral linc-insulin crystals in relation to species and crystallization media. Acta Chem Scand 1956;10:1459-64.
3. : Insulin crystals III: determination of the rhombohedral zinc-insulin unit cell by combined microscopical and chemical examinations Acta Chem Scand 1957;11:291-8.
4. Brange J. Galenics of insulin; insulin preparations. Berlin: Springer-Verlag, 1987:17-70.
5. Schlichtkrull J. Process of producing insulin crystals of substantially uniform size and compositions thereof. US patent 2, 799, 622. 1957.
6. Snell F. Photometric and fluorometric methods of analysis (metals). New York: J. Wiley and Sons Ed., 1978:395-415.
7. Scott DA. Crystalline insulin. Biochem J 1934;28:1592-1602.
8. Brill AS. The binding of transition metal ions in insulin crystals. J Mol Biol 1958;36:343-53.
9. Ramesh R, Bradbury JH. HNMR studies of insulin: reversible transformation of 2-zinc to 4-zinc insulin hexamer. Int J Pept Protein Res 1986;28:146-53.
10. Hallas-Moller K. Crystalline and amorphous insulin-zinc compounds with prolonged action. Science 1952;116:394-9.
11. Schlichtkrull J. Insulin crystals V: the nucleation and growth of insulin crystals Acta Chem Scand 1957;11:439-60.
12. Philippe J. Methodes statistiques en pharmacie et en chimie. Paris: Masson, 1967:60-9.

Recibido: 8 de abril de 1994. Aprobado: 21 de mayo de 1994.

Ing. Arturo Toledo Rivero. Dirección de Desarrollo de la Industria Médico-Farmacéutica. Línea entre 4 y 6, Vedado, municipio Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba.