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Revista Cubana de Enfermería

versión impresa ISSN 0864-0319versión On-line ISSN 1561-2961

Rev Cubana Enfermer v.11 n.3 Ciudad de la Habana oct.-dic. 1995

 

Instituto de Nefrología

Estandarización de un micrométodo para el estudio del complemento

Lic. Yalile Alfonso Valdés,<1> Dra. María Isabel Bermúdez Domínguez,<2> Dr. Omar Suárez Rodríguez<3> y Téc. Magalys García Díaz<4>

RESUMEN

Se efectuó la estandarización de un micrométodo para la detección de la actividad funcional de la vía clásica del complemento. Para ello se tomó como referencia el macrométodo tradicional y se realizó por las 2 vías el estudio de 69 niños (42 pacientes y 27 controles). Ambos métodos se correlacionaron con un nivel de significación de 0,0005 %. Se encontraron los rangos de normalidad tanto para el macrométodo como para el micrométodo. Se concluyó que el micrométodo estandarizado mide por igual la actividad del complemento en suero humano y es más económico.

Palabras clave: COMPLEMENTO/normas.

INTRODUCCION

El sistema de complemento, presente en suero normal, es el mediador humoral primario de las reacciones antígeno-anticuerpo.1 Está constituido por 20 proteínas plasmáticas que actúan de forma recíproca formando 2 cascadas enzimáticas interrelacionadas.2,3 Sus niveles varían en diversas enfermedades reumáticas e inflamatorias,4,5 por lo que su detección resulta importante para diagnosticar y pronosticar estas enfermedades.

La determinación de la actividad hemolítica del complemento (CH50) se efectúa mediante un macrométodo que tiene como principio el método propuesto por Mayer (1961), donde una unidad de CH50 se define como la cantidad de suero necesario para realizar el 50 % de hemólisis de una suspensión de eritrocitos de carnero, sensibilizados con anticuerpos anticarnero de conejo (hemolisina).

Esta técnica se usa en la actualidad en casi todos los laboratorios de inmunología, pero el empleo de muchos reactivos y cristalería, el consumo elevado de tiempo y lo limitado que resulta el número de muestras que se procesan nos han permitido la estandarización de un macrométodo, que con el mismo principio de el método tradicional nos posibilite suplir estas desventajas y obtener las unidades de CH50;1,6,7 se demostró que este micrométodo mide por igual que el macrométodo, la actividad del complemento en suero humano. Además, se establecieron los rangos de valores normales en niños.

MATERIAL Y METODO

La muestra estuvo constituida por 69 niños de 6 a 10 años de edad; de ellos 27 como grupo control y el resto pacientes asmáticos divididos en 2 grupos, 26 en fase de crisis asmática y 16 en intercrisis asmática.

La sangre se obtuvo por punción venosa, se dejó coagular a temperatura ambiente y luego se separó el suero por decantación, el que fue conservado a -70 oC durante 24 h. En éste se evaluó en cada caso y al mismo tiempo el CH50 mediante el macrométodo y el micrométodo que aplica el mismo principio pero con volúmenes inferiores.

Se estandarizó la concentración de hematíes de carnero lavándolos con veronal salino (BVS), hasta obtener una densidad óptica de 0,7 a 541 nm, esto corresponde a 5 x 108 eritrocitos en 1 mL; luego se sensibilizaron con hemolisina y se incubó a 37 oC durante 30 min.

Los sueros se diluyeron 1/100 con BVS y se usaron al mismo tiempo para ambos métodos; se prepararon 4 diluciones de los sueros previamente diluidos también con BVS, los que se depositaron en tubos de ensayo en el caso de la macrotécnica y para la microtécnica se colocaron con pipeta múltiple en una placa plástica de poliestileno de 96 pocillos (tabla). Luego se mezclaron con la suspensión de hematíes de carnero previamente sensibilizados y se colocaron tanto lo tubos de ensayos como la placa, por espacio de 40 min en una estufa húmeda a 37 oC. Después se centriguaron a 1 500 rev/min (45 000 ó 450 gravedades) en una centrífuga refrigerada durante 10 min, se decantó el sobrenadante de los tubos y se leyó la densidad óptica a 541 nm.

En el micrométodo se extrajo el sobrenadante con pipeta múltiple y se depositó en orificios vacíos de la placa; posteriormente se leyó la densidad óptica también a 451 nm en un lector de Elisa a toda la placa de una vez en fracciones de segundos. El pellet se separó del sobrenadante para eliminar interferencias en la lectura. Además, en cada día de trabajo se montaron 2 lisis totales y un blanco.

El CH50 se calculó mediante un programa computadorizado. Para determinar el grado de asociación entre las técnicas se utilizó el método de la correlación de Pearson, se docimó la prueba de hipótesis para p, con un nivel de significación de 0,0005 %. El rango de normalidad se halló mediante el método de los percentiles, se tomó como valores normales los comprendidos desde el pencentil 5 al 95 en los controles.

RESULTADOS Y DISCUSION

Después de obtener las unidades de CH50 correspondientes a ambos métodos, se pudo observar una tendencia a la obtención de valores algo más bajos en general, cuando se utilizó el micrométodo, manteniéndose la equivalencia entre ambos, lo que puede deberse a la utilización de volúmenes más pequeños, aunque el uso de pipetas múltiples y micropipetas bien manipuladas y calibradas pueden eliminar prácticamente posibles errores.

Se considera que el elemento que tiene mayor peso en esta diferencia es el equipo lector utilizado en el micrométodo que es más sensible, más sofisticado y no requiere manipulación de los tubos uno a uno.

Los resultados fueron estadísticamente significativos al 0,0005 %, lo cual confirma que dentro de los posibles límites de error el micrométodo estandarizado mide de igual forma que el método tradicional las unidades de CH50 en suero humano.

Los rangos de valores normales no son iguales por ambos procedimientos; para el macrométodo es de 18,85 a 33,00 y para el micrométodo de 12,40 a 25,15, los que se establecieron con la utilización del grupo control.

En la mayoría de los casos, ambos métodos coinciden con el 80 % de coincidencia.

El empleo de micrométodo estandarizado resulta más sencillo y económico al usar pocos reactivos, cristalería y los volúmenes con que se trabaja son menores; por ejemplo, para 200 determinaciones en el macrométodo se utilizan 1 400 mL de hematíes, mientras que en el micrométodo se emplean 70 mL con los que sólo podrían montar 10 determinaciones en el primer caso.

Los pasos de centrifugación y lectura espectrofotométrica quedan también simplificados con el uso de la microtécnica porque ambos se realizan a toda la placa de una sola vez.

CONCLUSIONES

  1. Los métodos estudiados están asociados y miden por igual la actividad del complemento.
  2. El micrométodo resulta útil para medir el CH50, es más económico en cuanto al tiempo, los reactivos, los recursos materiales y humanos.
  3. Se establecieron los rangos de valores normales de unidades de CH50 para los 2 métodos.
<1>Licenciada en Ciencias Biológicas. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos.

<2>Especialista de I Grado en Inmunología.

<3>Especialista II Grado en Inmunología.

<4>Técnica en Laboratorio Clínico.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

  1. Cooper MR. El sistema del complemento. En: Inmunología Básica y Clínica. La Habana. Editorial Científico-Técnica, 1985:119-31.
  2. Roitt IM, Brostoff J, Male DK. El complemento. En: Inmunología. Barcelona: Salvat, 1986:7,1-9.
  3. : Immunology, London: Mosby, 1985:71-9.
  4. Kenneth HF, Kenneth ES. Enfermedades reumáticas. En: Inmunología Básica y Clínica. La Habana: Editorial Científico-Técnica. 1985:431-58.
  5. Maini RN. Inmunología y complemento. En: Copemman. Tratado de Reumatología. La Habana: Editorial Científico-Técnica, 1983;t 1:179-205.
  6. Roitt IM. Complemento. En: Inmunología esencial 2 ed. La Habana Editorial Científico-Técnica, 1982:149-53,157-8.
  7. Mayer MM. Complement and complement fixation. In: Kabat EA, Mayer MM, eds. Experimental immunochemistry. 2 ed. Illinois, USA: Charles C. Thomas, 1967:133.
Recibido: 10 de septiembre de 1993. Aprobado: 29 de octubre de 1994.

Lic. Yalile Alfonso Valdés. Instituto de Nefrología. Avenida 26 y Boyeros, municipio Cerro, Ciudad de La Habana, Cuba.

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