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Pastos y Forrajes

Print version ISSN 0864-0394

Pastos y Forrajes vol.30 no.2 Matanzas Apr.-June 2007

 

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Selección de cepas de rizobios aisladas de ecosistemas ganaderos de Canadá, inoculadas en trigo (Triticum aestivum, L.). II. Fase de campo

 

Selection of rhizobium strains isolated from livestock ecosystems of Canada, inoculated to wheat (Triticum aestivum L.)

C.J. Bécquer, Beatriz Salas, U. Ávila, L. Palmero, J.A. Nápoles y Lisbet Ulloa

Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spíritus

Apdo. 2228, Zona postal 1, Sancti Spiritus, Cuba

E-mail: becquer@pastos.yayabo.inf.cu


RESUMEN

Se efectuó un experimento de campo con el objetivo de seleccionar cepas de rizobios inoculadas en trigo (Triticum aestivum, L., var. Cuba-204). Se evaluaron varios indicadoress agroproductivos de la planta, tales como: peso seco aéreo, longitud del tallo, rendimiento de granos, peso de 1000 granos y rendimiento de nitrógeno. Como criterio de selección de los mejores tratamientos se consideraron los valores estadísticamente superiores al control fertilizado. Se utilizaron cuatro cepas de referencia, pertenecientes a diferentes géneros y especies de rizobios, y 10 cepas nativas, pertenecientes al género Sinorhizobium, que fueron aisladas de raíces de leguminosas (Melilotus y Medicago), adaptadas a ecosistemas ganaderos de Alberta, Canadá. Una de las cepas fue aislada de leguminosas adaptadas a suelos contaminados con hidrocarburos de esa misma zona geográfica. Las cepas crecieron en LMA y resuspendidas en CLM hasta lograr una UFC de 106 _ 108 cél/mL. Se utilizaron métodos estándar para la inoculación de cereales. Se aplicó un diseño experimental de bloques completamente aleatorizado, con 16 tratamientos y cuatro réplicas. Uno de los tratamientos se fertilizó con 150 kg/ha (NH4NO3). Se utilizó análisis de varianza. Las diferencias entre medias fueron halladas por la prueba LSD de Fisher (p<0,05). Se construyó un dendrograma mediante el método centroide (distancia euclidiana). Se concluye que existió un incremento significativo de los valores en todas las variables en comparación con el testigo absoluto. Algunos tratamientos inoculados indistintamente con cepas nativas o comerciales, fueron estadísticamente superiores al control fertilizado. Se seleccionaron seis cepas como altamente promisorias para ser aplicadas en la práctica agrícola del territorio. Se recomienda la biofertilización con rizobios en trigo como una alternativa de alto valor ecológico y económico para la agricultura cubana.

Palabras clave: Inoculación, Sinorhizobium, trigo, cepas nativas, Canadá


ABSTRACT

A field experiment was carried out in order to select rhizobial strains inoculated to wheat (Triticum aestivum, L., var. Cuba-204). Several parameters of agricultural significance were assessed, such as: aerial dry weight, length of stems, grain yield, weight of 1 000 grains and nitrogen yield. As selection criterion of the best treatments, the statistically higher values compared to the fertilized control were considered. Four reference strains, belonging to several rhizobial genus and species were used, as well as ten native strains, belonging to Sinorhizobium that were isolated from roots of legumes (Melilotus and Medicago), adapted to Canadian livestock ecosystems in Alberta. One of the strains was isolated from legumes adapted to soils contaminated with hydrocarbons located in the same geographic zone. The strains grew YMA and re-suspended in YMB until they reached a 6 8 CFU of 10 – 10 cells/mL. Standard methods for the inoculation of cereals were used. A complete randomized block experimental design with 16 treatments and four replications within plots was used. A treatment was fertilized with 150 kg/ha (NH NO ). Variance analysis was applied while differences between treatments were 4 3 found through LSD (Fisher’s test) (p<0, 05). A dendrogram was built through the centroid method (Euclidian distance). It was concluded that a significant increase of values in all the variables was shown as compared to the absolute control. Several treatments, inoculated with reference or native strains showed values statistically higher than those of the fertilized control. Six rhizobial strains of highly promising use for the local agriculture were selected. Biofertilization of wheat with rhizobia is strongly recommended as an alternative of high ecological
and economic value for the agriculture of Cuba.

Key words: Inoculation, Sinorhizobium, Triticum aestivum


 

 

INTODUCCION

El efecto beneficioso de los rizobios como fijadores del nitrógeno atmosférico en las leguminosas a través de la simbiosis es bien conocido, por lo que son utilizados ampliamente en el mundo para el incremento de la producción de granos y forraje, con un ahorro sustancial de divisas y una contribución significativa al cuidado del medio ambiente. Estas bacterias pueden colonizar también las raíces de las plantas no leguminosas e influir significativamente en su crecimiento mediante la secreción de sustancias promotoras del crecimiento vegetal (Chabot, Antoun, Klocpper y Beauchamp, 1996).

La inoculación de especies no leguminosas con bacterias dinitrofijadoras simbióticas o de vida libre, ha sido por espacio de muchos años una tarea investigativa de grandes perspectivas, pero de discretos avances. Al principio se esperaba que dichas bacterias fijaran cantidades aceptables de nitrógeno atmosférico a la planta, pero Van Berkum y Bohlool (1980) determinaron que las bacterias diazotróficas en la rizosfera de las plantas utilizan los productos de la fijación del N para su propio crecimiento. Otra de las mayores limitaciones de la fijación asociativa de N es que, en la mayoría de los casos, las bacterias colonizan solamente la superficie de las raíces, por lo que permanecen vulnerables en la competencia con otros microorganismos rizosféricos (Webster, Gough, Vasse, Batchelor, Callaghan, Kothari, Davey, Dénarie y Cocking, 1997). No obstante, existen trabajos que han demostrado la entrada y establecimiento de Azorhizobium en las raíces de trigo (Sabry, Saleh, Batchelor, Jones, Jotham, Webster, Kothari, Davey y Cocking, 1997), donde se encontraron evidencias de actividad de la enzima nitrogenasa.

Otros autores han afirmado que la fijación del N atmosférico no es el aspecto más importante en la inoculación de bacterias diazotróficas en las especies no leguminosas, sino la producción por éstas de sustancias promotoras del crecimiento vegetal, tales como: auxinas, citoquininas, riboflavina, vitaminas y otras fitohormonas (Phillips y Torrey, 1970; Dakora, 2003), lo cual favorece a su vez una mayor extracción de nutrientes en el suelo (Okon y Kapulnik, 1986; Zavalin, Kandaurova y Vinogradova, 1998; Saubidet, Fatta y Barneix, 2000).

A pesar de que los rizobios están siendo investigados desde hace algunos años en diversas instituciones en el extranjero para la inoculación de especies no leguminosas, en Cuba aún no se cuenta con antecedentes de resultados previos al presente trabajo, por lo que se considera que constituye una novedad científica en el país.

En Cuba es necesario mejorar la producción de granos básicos y nutritivos para la alimentación, tanto humana como animal, por lo que teniendo en cuenta la bibliografía consultada y la posibilidad de extender el cultivo del trigo en el país, se realizó esta investigación con el objetivo de evaluar el comportamiento de los principales indicadores agroproductivos del trigo inoculado con bacterias promotoras del crecimiento vegetal (rizobios) adaptadas a ecosistemas ganaderos de Canadá.

MATERIALES Y METODOS

Procedencia de las cepas de rizobios. Se utilizaron cuatro cepas de referencia, pertenecientes a diferentes géneros y especies de rizobios, y 10 cepas canadienses del género Sinorhizobium (tabla 1), que fueron aisladas de raíces de leguminosas (Melilotus y Medicago), adaptadas a ecosistemas ganaderos de las praderas de Alberta, Canadá, caracterizados por un suelo loam arenoso y erosionado, así como escasas precipitaciones en esa zona geográfica (Slaski, J., comunicación personal). Una de las cepas (CAS2) fue aislada de leguminosas adaptadas a suelos contaminados con hidrocarburos.

Procedimiento experimental. Las cepas crecieron en medio levadura-manitol-agar (LMA) y fueron resuspendidas en caldo-levadura-manitol (CLM) hasta lograr una unidad formadora de colonias (UFC) de 106-108 cél/mL. La inoculación se realizó mediante la inmersión de las semillas durante 24 horas en el inóculo a temperatura ambiente y posteriormente se extrajeron del caldo para su secado a la sombra y siembra inmediata. Para el control absoluto y el control fertilizado no inoculado se utilizó solamente el CLM. La reinoculación de los tratamientos se hizo a los 18 días de la siembra, con el fin de asegurar una presencia efectiva de las bacterias en la rizosfera para la colonización radicular; para ello se usó un inóculo bacteriano en cantidad aproximada de 5-10 mL/planta, que contenía 106-108 cél./mL, y con una mochila asperjadora se dirigió el chorro del inóculo líquido a la base del tallo de la planta. Esta actividad se llevó a cabo en horas frescas de la mañana para evitar la desecación excesiva del producto y, por ende, la muerte del microorganismo. La dosis de siembra fue de 69 kg/ha para ambos experimentos. El marco de siembra usado fue de 50 cm entre surcos, sembrados a chorrillo espaciado. Cada parcela medía 3 m x 15 m. Se aplicaron cuatro riegos. A los 90 días de la siembra se realizó la cosecha de forma manual. El tratamiento fertilizado consistió en una aplicación de 150 kg de N/ha (NH4NO3). Por otra parte, debido al pobre contenido de minerales del suelo experimental (Aluvial: 2,63 mg de P2O5/100 g; 10,00 mg de K2O /100 g; 1,61% de MO y un pH de 5,4) se aplicó fertilizante completo (NPK: 9-13-17) a todos los tratamientos, a los 21 días de la siembra, a razón de 80 kg de N/ha.

Diseño experimental. Se empleó un diseño experimental de bloques completamente aleatorizados (Somasegaran y Hoben, 1994), con 16 tratamientos y cuatro réplicas (fig. 1). Los datos se analizaron estadísticamente mediante un análisis de varianza (StatGraphics Plus, versión 2.0, 1994-1996, Statistical Graphics Corporation). Las diferencias entre medias fueron halladas por la prueba LSD (Least Significant Difference) de Fisher (P<0,05). Se construyó un dendrograma mediante el método centroide (distancia euclidiana). Se evaluaron las siguientes variables en ambos experimentos: peso seco aéreo (PSA, g/parcela), longitud del tallo (LT, cm), rendimiento de granos (RG, kg/ha), peso de 1 000 granos (P1000G, g) y rendimiento de nitrógeno (RN, g/m2). Como criterio de selección de los mejores tratamientos se consideraron los valores estadísticamente superiores al control fertilizado.

RESULADOS

En la figura 2 se muestra el peso aéreo, el cual presentó algunos tratamientos con valores superiores al resto, entre los que se destacaron los inoculados con USDA 191 (492,7 g/parcela), CAC5 (466,0 g/parcela), ATCC 1004 (456,0 g/parcela) y CAC2 (449,0 g/parcela). Otros tratamientos, como CAC17 (442,1 g/parcela) y CAS2 (433,5 g/parcela), presentaron letras comunes con los anteriormente señalados, aunque con valores inferiores. Todos los tratamientos inoculados, excepto CAC8 (322,4 g/parcela), CAC9 (303,6 g/parcela), 25B6 (278,3 g/parcela) y CAC14 (311,6 g/parcela), fueron superiores significativamente (p<0,05) al control absoluto. Los tratamientos inoculados con las cepas USDA 191, CAC5, ATCC 10004, CAC2, CAC17 y CAS2 se destacaron por sus valores estadísticamente superiores al control fertilizado.

En cuanto a la longitud del tallo (fig. 3) todos los tratamientos inoculados, excepto el CAC9 (64,9 cm) y CAC14 (65,8 cm), fueron superiores estadísticamente con respecto al control absoluto. Los tratamientos inoculados con las cepas USDA 191 (79,5 cm), CAC5 (79,1 cm), CAC2 (74,0 cm), ATCC 10004 (73,2 cm), CAC16 (73,5 cm), CAC17 (73,5 cm) y CAC7 (75,1 cm), fueron superiores significativamente (p<0,05) con respecto al control fertilizado.

En el rendimiento de granos se comprobó que, con excepción de los tratamientos inoculados con las cepas CAC8 (134,6 g/m2), CAC9 (132,8 g/m2), CAC14 (143,4 g/m2) y 25B6 (118,9 g/m2), los demás fueron estadísticamente superiores al control absoluto. Los inoculados con las cepas USDA 191 (191,0 g/m2) y CAC5 (189,9 g/m2) fueron superiores significativamente (P<0,05) con respecto al tratamiento fertilizado (fig. 4).

Al analizar el peso de 100 granos se observó que los tratamientos inoculados, excepto CAS2 (27,6 g), presentaron letras comunes con el control absoluto (29,7 g). Algunos de estos, inoculados con CAC2 (31,3 g), ATCC 10004 (30,8 g), CAC7 (31,2 g) y CAC4 (30,4 g), fueron superiores al control fertilizado (28,4 g), el cual a su vez presentó letras comunes con el control absoluto (fig. 5).

El rendimiento de nitrógeno fue estadísticamente superior en los tratamientos inoculados comparado con el control absoluto, excepto en CAC8 (461,2 mg/m2), CAC9 (442,3 mg/m2), CAC14 (492,8 mg/m2) y 25B6 (417,3 mg/m2) (fig. 6). Por otra parte, los inoculados con las cepas CAC5 (682,3 mg/m2), USDA 191 (655,1 mg/m2), CAC2 (629,6 mg/m2) y ATCC 10004 (637,6 mg/m2), resultaron significativamente superiores al control fertilizado (570,3 mg/m2).

En la figura 7 se muestra la agrupación sobre la base de las variables estudiadas. Se numeraron los grupos formados por tratamientos inoculados que se destacaron por sus valores estadísticamente superiores con respecto al tratamiento fertilizado (USDA 191, ATCC 10004, CAC5, CAC2, CAC16 y CAC17).

DISCUSION

En el presente experimento se constataron resultados superiores debido al efecto de la inoculación de trigo con cepas pertenecientes a diferentes géneros.

Las cepas nativas de rizobios utilizadas proceden de zonas ganaderas de Alberta, Canadá, donde son escasas las precipitaciones y el suelo es arenoso y erosionado. Al aplicarlas en el presente ensayo, se tomó en cuenta que las condiciones edafoclimáticas correspondieran aproximadamente con las de la zona de origen. Se ha comprobado por otros autores (Prévost, 1987; Prévost, Bordeleau, Caudry-Reznich, Schulman y Antoun, 1987; Prévost, Drouin y Antoun, 1999) que los rizobios procedentes de zonas geográficas que se encuentran en condiciones edafoclimáticas estresantes, pueden ser útiles en la práctica agrícola, por desarrollarse características fisiológicas debido a cambios en el genoma, que influyen positivamente en dichos resultados.

Se demostró, a pesar del escaso número de variables estudiadas, que estas cepas pueden constituir un recurso biológico valioso para la fertilización del trigo en condiciones desfavorables de suelo y clima de Cuba. Tanto en el peso seco aéreo como en la longitud del tallo y el rendimiento de grano, sobresalieron los tratamientos inoculados con las cepas USDA 191 (Sinorhizobium fredii), ATCC 10004 (Rhizobium leguminosarum), CAC5, CAC2 y CAC7 (Rhizobium leguminosarum), lo cual coincide con lo obtenido por Slaski, Anyia, Archambault, Bécquer y Salas (2005), al inocular plantas de una variedad canadiense de trigo (CDC Teal) en condiciones de invernadero.

Los tratamientos inoculados con las cepas CAC8, CAC9, CAC14, 25B6 y ATCC 10317 fueron los únicos que mostraron valores estadísticamente inferiores o iguales al control absoluto en el peso seco aéreo, lo cual fue observado también en un experimento similar, pero en condiciones de invernadero, por Bécquer, Salas, Archambasult, Slaski y Anyia (2005). Este resultado pudiera indicar una persistencia de las características fisiológicas de las cepas en diferentes tipos de ambiente.

Otros autores, como Biswas, Ladha y Dazzo (2000), obtuvieron valores estadísticos superiores en el rendimiento de grano al inocular arroz con cepas pertenecientes a Rhizobium sp., R. leguminosarum y Bradyrhizobium sp. En el caso de los tratamientos inoculados con las cepas USDA 191 y CAC5 en el rendimiento de grano, al hacer la extrapolación requerida, ambos alcanzaron valores de 1,91 t/ha y 1,89 t/ha, respectivamente, y aunque inferiores a lo alcanzado en Alquízar (provincia La Habana), en la misma variedad (2,5 t/ha), con fertilización nitrogenada y mejores condiciones de suelo y clima (Villasana, Uranga y Pérez, 2005), estos resultados demuestran el potencial productivo que tiene el cereal al ser inoculado con el preparado biológico adecuado.

En el peso de 1 000 granos los resultados parecen desviarse de los obtenidos en las demás variables. Sólo dos tratamientos (CAC2 y CAC7), aunque sin diferir de otros (incluyendo el control absoluto), mostraron cierta superioridad en sus valores. El hecho de que el tratamiento no inoculado presentara valores similares al resto, pudiera indicar la influencia de las cepas nativas en la rizosfera de la planta. Por otra parte, al no evaluarse otras variables, como el número de hijos por macolla, quizás se haya perdido una parte de la explicación de ese resultado, ya que el efecto de la cepa podría haber influido en este indicador, por lo que se recomienda tenerlo en cuenta para futuros ensayos.

En el rendimiento de nitrógeno se observó que aunque, en sentido general, los resultados fueron similares a los obtenidos en la variable rendimiento de granos (lo cual pudo haber estado influido por la relación directa de estas variables), se destacaron los tratamientos inoculados con las cepas CAC5, USDA 191, CAC2 y ATCC 10004, los cuales fueron superiores al control fertilizado y ello indica un contenido superior de este macroelemento en dichos tratamientos. Como se observó en esta variable, hubo cuatro tratamientos (los cuatro últimos) que no se destacaron en el rendimiento de grano; indudablemente, la acción estimuladora de las cepas correspondientes debe haber favorecido la extracción de nitrógeno en la rizosfera, que se reflejó directamente en el contenido mineral del grano, aunque no se descarta algún efecto de la fijación de nitrógeno por los rizobios, ya que se han encontrado evidencias de actividad de la enzima nitrogenasa en raíces de trigo inoculadas con rizobios (Sabry et al., 1997). Es conveniente notar que la cepa CAS2 (Sinorhizobium meliloti) proviene de nódulos radiculares de plantas adaptadas a suelos contaminados por hidrocarburos (Slaski, Bécquer, Salas, Anyia, Prévost, Cloutier y Archambault, 2005), por lo que el hecho de haber sobrevivido a dichas condiciones extremas pudo haber afectado su capacidad de producción de sustancias promotoras del crecimiento vegetal; de ahí sus resultados relativamente inferiores en el ensayo. No obstante, por su origen constituye potencialmente una opción a tener en cuenta para los cultivos en condiciones ambientales adversas.

Se observaron, en el dendrograma construido sobre la base de los valores de todas las variables estudiadas, diferentes grupos de tratamientos similares estadísticamente. Aquellos tratamientos que fueron seleccionados en más de una variable, resultaron agrupados en determinados conglomerados, enumerados para su identificación. De estas cepas, las nativas constituyeron el 40% del total de las que fueron evaluadas; mientras que las comerciales, el 50%.

Se concluye que las cepas inoculadas a la variedad de trigo cubano Cuba C-204, pueden constituir un valioso recurso para la práctica agrícola en condiciones edafoclimáticas estresantes. Se recomienda un grupo de cepas seleccionadas sobre la base de sus valores estadísticamente superiores al control fertilizado.

Conclusiones

1. Los tratamientos inoculados con las cepas comerciales USDA 191 y ATCC 10004, así como con las nativas canadienses CAC5, CAC2, CAC16, CAC17, resultaron estadísticamente superiores al control fertilizado.

2. El tratamiento inoculado con la cepa CAS2 mostró resultados relativamente inferiores a los tratamientos seleccionados; no obstante, fue superior estadísticamente al control absoluto en la mayoría de las variables.

3. La aplicación de los rizobios influyó notablemente en el desarrollo integral de la planta.

4. Se demostró que las cepas de rizobios inoculadas pueden constituir un recurso biológico valioso para la fertilización del trigo en Cuba.

Recomendaciones

1. Se recomiendan para su aplicación en la agricultura las cepas que mostraron un efecto estadísticamente superior al tratamiento fertilizado. Además se debe considerar la cepa CAS2 como una alternativa para su aplicación en las zonas agrícolas de ambientes estresantes.

2. Se recomienda la biofertilización con rizobios en trigo como una alternativa de alto valor ecológico y económico para la agricultura cubana.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Recibido el 5 de diciembre del 2006
Aceptado el 12 de marzo del 2007