ARTICULO DE INVESTIGACION

Efecto de los factores edafoclimáticos y la especie de pasto en la diversidad de bacterias diazotróficas

Effect of the edaphoclimatic factors and pasture species on the diversity of diazotrophic bacteria

María F. Garrido 1, Diana M. Cárdenas2, Ruth R. Bonilla3 y Vera L. Baldani4

1Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria- CORPOICA. Bogotá, Colombia

E-mail: [e-mail]

2Departamento de Biología, Universidad Francisco de Paula Santander. Cúcuta, Colombia

3Laboratorio de Microbiología de Suelos-CORPOICA, Bogotá, Colombia

4EMBRAPA Agrobiología. Seropedica-Brasil

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RESUMEN

Con el objetivo de estudiar la diversidad de las bacterias diazotróficas asociadas a los suelos y los pastos cultivados en las microrregiones Valle y Sabana del Cesar, se realizaron los recuentos de los géneros de bacterias (Azospirillum, Herbaspirillum, Burkholderia, Gluconacetobacter, Derxia, Beijerinckia y Azotobacter) asociadas a tres gramíneas (Panicum maximum, Dichanthium aristatum y Brachiaria sp.) en dos épocas climáticas (lluvia y sequía). El recuento fue realizado a partir de muestras de suelo rizosférico, raíces y hojas en medios de cultivo semiespecíficos sólidos (LG, LGD y BEIJERINCKIA) y semisólidos (NFb, LGI, JNFb, JMV, LGI-P), utilizando un diseño de parcelas divididas con un arreglo factorial de 3 (especies de pasto) x 3 (estratos) x 2 (épocas climáticas). Los resultados mostraron que la condición de sequía influyó en el número de bacterias diazotróficas presentes en las tres gramíneas utilizadas en la alimentación bovina del Valle y Sabana del Cesar, Colombia. En la época de sequía se observó una disminución del número de bacterias en las raíces y en el suelo.

Palabras clave: Bacterias diazotróficas, Brachiaria sp., Dichanthium aristatum, fijación del nitrógeno, Panicum maximum

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ABSTRACT

In order to study the diversity of diazotrophic bacteria associated to soils and cultivated pastures in the Cesar Valley and Savanna microregions, the recounts of the bacteria genera (Azospirillum, Herbaspirillum, Burkholderia, Gluconacetobacter, Derxia, Beijerinckia and Azotobacter) associated to three grasses (Panicum maximum, Dichanthium aristatum and Brachiaria sp.) were made in two seasons (rainy and dry season). The recount was made from samples of rhizospheric soil, roots and leaves in solid (LG, LGD and BEIJERINCKIA) and semisolid specific culture media (NFb, LGI, JNFb, JMV, LGI-P), using a divided plot design with a 3 (pasture species) x 3 (strata) x 2 (seasons) factorial arrangement. The results showed that the drought condition influenced the number of diazotrophic bacteria present in the three grasses used in cattle feeding in the Cesar Valley and Savanna, Colombia. In the dry season a decrease was observed in the number of bacteria in the root and soil.

Key words: Brachiaria sp., diazotrophic bacteria, Dichanthium aristatum, nitrogen fixation, Panicum maximu

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INTRODUCCIÓN

En el departamento del Cesar aproximadamente 1 500 000 ha son dedicadas a la ganadería, con una población bovina de 1 450 000 cabezas que contribuyen con una producción diaria de 900 000 L de leche. Sin embargo, esta actividad económica está limitada por un proceso de degradación de las praderas que se manifiesta en la baja producción y calidad del forraje, situación derivada de la pérdida de la fertilidad del suelo, la cual según Oliveira et al. (2004) está asociada a la disponibilidad de N. Para suplir la deficiencia de este nutriente se ha recomendado la fertilización nitrogenada de síntesis, la cual no es viable por los altos costos ambientales, económicos y sociales. La fijación biológica de nitrógeno constituye la principal vía de incorporación de N al ecosistema, que de forma constante es reciclado hacia la atmósfera principalmente por la acción de los organismos denitrificadores en el suelo (Baca et al., 2000). En este sentido, como opción tecnológica se avizora la utilización de microorganismos nativos fijadores de nitrógeno con el propósito de reducir la aplicación de fertilización nitrogenada de síntesis, disminuir la contaminación de los suelos y aguas freáticas, bajar los costos de producción y mejorar la competitividad de los sistemas ganaderos. Para este fin se han utilizado los procesos de aislamiento y multiplicación de microorganismos diazotróficos en medios de cultivo libre de nitrógeno; en este sentido, los medios semisólidos han sido la clave para el aislamiento de un gran número de diazótrofos asociativos (Döbereiner et al., 1995).
En el departamento del Cesar no existen estudios de evaluación de poblaciones de microorganismos fijadores de nitrógeno asociados a las pasturas, ni de su dinámica. Esto reviste especial importancia, teniendo en cuenta que la población microbiana está condicionada por la vegetación nativa y es posible que las diferentes especies de pastos puedan presentar un efecto selectivo sobre ella. Este hecho podría resultar en diferentes respuestas en cuanto a la contribución de la fijación biológica de nitrógeno por cada uno de estos microorganismos (Reis et al., 2004). El objetivo de este trabajo fue evaluar la diversidad de las bacterias diazotróficas y su interacción con diferentes gramíneas durante los cambios climáticos que se presentan en el departamento del Cesar.

MATERIALES Y MÉTODOS

Área de estudio. La microrregión Valle del Cesar situada entre los 9°34' y 11°11' de latitud norte y los 74°4' y 72°31' de longitud oeste del meridiano de Greenwich, en el departamento del Cesar, tiene una extensión de 1 038 052 ha, donde se encuentran establecidos los cultivos de Panicum maximum y Dichanthium aristatum, en suelos con pH de 6,6 y un contenido menor que 2% de materia orgánica, el cual es considerado bajo. Entre tanto la sabana del Cesar (507 457 ha), establecida con cultivo de Brachiaria sp., posee suelos con un pH de 4,5 y contenido medio de materia orgánica (2-2,5%). El presente estudio se realizó en fincas de los municipios de Chiriguaná y Agustín Codazzi, representativos de las condiciones edafoclimáticas de las microrregiones Sabana y Valle del Cesar, zonas ganaderas del departamento del Cesar.
Determinación del efecto de dos épocas climáticas sobre las poblaciones de bacterias diazotróficas en pastos del Valle y Sabana del Cesar. Se tomaron muestras de suelo rizosférico y de la planta completa del pasto guinea en la época de lluvia en septiembre de 2006 (158,6 mm de precipitación y 28,1ºC de temperatura) y en la de sequía en febrero de 2007 (0 mm de precipitación y 31º C de temperatura). Se muestrearon dos especies de pasto en la zona del valle (P. maximum y D. aristatum) y una en la sabana (Brachiaria sp.), a 20 cm de profundidad; se obtuvieron cinco submuestras de 200 g cada una, las cuales fueron homogenizadas para formar una muestra que fue procesada en el laboratorio de Microbiología de Suelos del Centro de Biotecnología y Bioindustria (Corpoica, C.I. Tibaitatá).
El suelo rizosférico se obtuvo al removerlo de las raíces, a partir del cual se realizaron diluciones hasta 10-6 en solución salina al 0,85% de NaCl. Se inocularon 0,1 mL de cada dilución en tres viales de medio semisólido Nfb, LGI, JNFb, LGI-P y JMV semiselectivo para el aislamiento de Azospirillum, Herbaspirillum, Gluconacetobacter y Burkholderia, respectivamente (Döbereiner et al. 1995) como representantes de las bacterias diazotróficas microaerofílicas asociativas. Así mismo, se inocularon 100 µL en cajas de agar LG para el recuento de Azotobacter, LGD para Derxia, y Beijerinckia (BEIJ) para Beijerinckia, bacterias diazotróficas de vida libre (Döbereiner et al., 1995).
Las raíces se lavaron, se cortaron en fragmentos y se desinfectaron con alcohol de 70º durante 1 min, después se sumergieron en hipoclorito de sodio al 2% (2 min.) y se enjuagaron dos veces en agua estéril. Se pesó 1 g de estas raíces y se maceraron en 9 mL de solución salina estéril (0,85% de NaCl). Las hojas y los tallos se lavaron con agua destilada y se secaron. Se pesó 1 g de este material vegetal cortado en fragmentos, se desinfectaron con alcohol de 70º y se maceraron en 9 mL de solución salina estéril (0,85% de NaCl). Se realizaron diluciones seriadas hasta 10-6 a partir de estos macerados y se inocularon en medios semisólidos (NFb, LGI, JNFb, LGI-P y JMV), de igual forma que la muestra de suelo rizosférico. Los viales inoculados se incubaron durante cinco días a 32ºC, hasta la formación de una película subsuperficial como indicativo del crecimiento positivo. Se cuantificó la población de diazotróficas microaerofílicas mediante el método del Número Más Probable para tres tubos, aplicando la tabla de McCrady (Döbereiner et al., 1995). El diseño experimental fue en parcelas divididas con arreglo factorial de 2 (épocas climáticas) x 3 (especies de pastos) x 3 (estratos) y tres repeticiones; se hizo un análisis de varianza y se empleó la prueba de comparación de Duncan al 5% de probabilidad, utilizando el programa estadístico SAS versión 9.1.3. El análisis de varianza para las diazotróficas de vida libre se realizó bajo el mismo diseño experimental de 2 (épocas climáticas) x 3 (especies de pastos).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Según el análisis de varianza se encontraron diferencias significativas (P<0,05) para las diferentes condiciones edafoclimáticas y los tres géneros de pastos del Valle y Sabana del Cesar, en las poblaciones de algunos géneros bacterianos diazotróficos microaerofílicos y de vida libre (tabla 1).

Poblaciones de bacterias diazotróficas en tres pastos del Valle y Sabana del Cesar. El factor especie de pasto cultivado influyó significativamente en la población de las bacterias microaerofílicas del género Azospirillum en medio semisólido NFb y Herbaspirillum en medio semisólido JNFb; se observó un mayor valor en el pasto D. aristatum, con respecto a Brachiaria sp. y P. maximum (tabla 2). Por su parte, los tres géneros bacterianos de diazotróficas de vida libre presentaron diferencias significativas según la especie de pasto cultivada y los mayores valores se registraron en el pasto P. maximum, seguido de Brachiaria sp. y D. aristatum (tabla 3).

Estos resultados coinciden con lo reportado por Rodrigues et al. (2006), quienes observaron que las poblaciones de bacterias diazotróficas difirieron de acuerdo con las variedades de arroz cultivadas y los tipos de suelo donde se realizaron sus estudios. Así mismo, Reis et al. (2000) aislaron bacterias de los géneros Azospirillum, Gluconacetobacter y Herbaspirillum en cuatro genotipos de caña de azúcar, y encontraron variaciones en las poblaciones de estos microorganismos de acuerdo con el genotipo en estudio. Esto permite señalar que tanto la especie como sus variedades influyen directamente en las poblaciones de microorganismos diazotróficos, lo que favorece el crecimiento de diferentes géneros, de acuerdo con las características del microhábitat desarrollado en una planta, según su eficiencia fotosintética, la disponibilidad de los nutrientes, la resistencia a las condiciones desfavorables, la producción de exudados, el pH del suelo y la materia orgánica, entre otras características (Bürgmann et al., 2005).
Cuando se analizaron las poblaciones de diazotróficas en los tres estratos (suelo rizosférico, raíces y hojas) en los cuales sólo se estudiaron los géneros microaerofílicos (que también son considerados microorganismos endófitos capaces de colonizar el interior de los tejidos radicales y foliares), se encontraron diferencias (P<0,05) para la población de las bacterias en las hojas de D. aristatum y P. maximum, las cuales presentaron el mayor valor con respecto a las raíces y el suelo rizosférico. Sin embargo, en Brachiaria sp. las raíces registraron la más alta población bacteriana (tabla 4).

Lo anterior puede ser atribuido a que estos microorganismos endófitos encuentran en los tejidos foliares un ambiente más favorecido por los fotosintatos que están disponibles para ellos (Rodrigues et al., 2006). Según Brasil et al. (2005) la población de Azospirillum en las hojas está altamente correlacionada con la producción de materia seca foliar, lo cual sugiere que los nutrientes están presentes en mayor concentración en los períodos intermitentes de sequía, por lo que las bacterias que llegan a colonizar el tallo y las hojas pueden tener acceso a los fotoasimilados allí producidos y sobrevivir en condiciones de estrés ambiental (Reis et al., 2000).
Efecto de la época climática en la población de bacterias diazotróficas. La época de lluvia favoreció significativamente (P<0,05) las poblaciones de diazotróficas microaerofílicas (excepto la de Gluconacetobacter en medio semisólido LGI-P) y también las diazotróficas de vida libre con respecto a la época de sequía que se presenta en el Valle y la Sabana del Cesar (tablas 5 y 6).

También se observó que las poblaciones de bacterias microaerofílicas disminuyeron significativamente (P<0,05) en la época de sequía, en los tres pastos evaluados, cuando se utilizó el medio semisólido NFb que permite el recuento de Azospirillum (tabla 7). Los demás géneros bacterianos no mostraron influencia significativa en la interacción entre los factores época climática y especie de pasto en el Valle y Sabana del Cesar; sin embargo, la población, en la época de sequía, en general, registró valores inferiores.

La disminución de la población celular en la época de sequía pudo deberse a que las condiciones ambientales generan estrés en los tejidos vegetales, lo cual no favorece la producción de exudados que pudieran ser aprovechados por las poblaciones de bacterias diazotróficas presentes en la rizosfera, las raíces y las hojas de los tres pastos cultivados (Bürgmann et al., 2005; Texeira et al., 2005). Oliveira et al. (2004) determinaron que el aumento en la humedad del suelo favoreció el crecimiento, el mantenimiento de la población y la migración de los microorganismos diazotróficos en diferentes cultivos evaluados en Brasil, lo que puede estar relacionado con diferentes mecanismos. Entre los mecanismos utilizados por diferentes géneros de bacterias diazotróficas para sobrevivir en condiciones desfavorables se encuentran la formación de quistes, la floculación, la producción de melanina, la síntesis de poli-ß-hidroxibutirato (PHB) y la síntesis de polisacáridos (Joe et al., 2009).
Cuando se analizó el efecto de las épocas de lluvia y sequía en las poblaciones presentes en los diferentes estratos de los pastos, se observó que las hojas no presentaron una disminución significativa (P<0,05) en la población de las bacterias microaerofílicas; ello evidencia su comportamiento endófito y demuestra, además, la acumulación de nutrientes disponibles en el tejido foliar para su supervivencia en esta condición de estrés ambiental (tabla 8).

Melloni et al. (2004), en un estudio sobre la densidad y la diversidad fenotípica de las bacterias diazotróficas endofíticas en suelos de minas en rehabilitación, demostraron que las condiciones del suelo, los tipos de vegetación y la época climática durante el muestreo afectaron las poblaciones de Azospirillum y Herbaspirillum. Esto pudo ser determinado en el presente estudio, en el que se encontraron diferencias en las poblaciones de acuerdo con el tipo de pasto, la época climática y el estrato de la planta donde se realizó el muestreo.
En general, las épocas de lluvia y sequía a las que se encuentra sometido el departamento del Cesar, influyeron en el número de bacterias diazotróficas asociadas a las tres especies de pastos. En la época de sequía se observó una disminución del número de bacterias en las raíces y en el suelo rizosférico, y su población se mantuvo en las hojas; ello quizás se debió a una migración de la bacteria dentro de la planta para buscar lugares con mayor humedad. Sin embargo, su presencia demuestra que pueden soportar estas condiciones de estrés ambiental, lo cual indica la necesidad de aumentar su población a través de la inoculación y de prácticas agronómicas conservacionistas.

AGRADECIMIENTOS

Al Laboratorio de Microbiología de Suelos y a la Estación Experimental Motilonia de CORPOICA por su colaboración y apoyo económico a través del proyecto financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de la República de Colombia, la Federación Colombiana de Ganaderos FEDEGAN- y la Gobernación del Departamento del Cesar.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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3. Bürgmann, H. et al. Effects of model root exudates on structure and activity of a soil diazotroph community. Environ. Microbiol. 7 (11):1711. 2005

4. Döbereiner, J. et al. Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas não-leguminosas. Embrapa-CNPAB, Brasil. 60 p. 1995.

5. Joe, M.M. et al. Co-aggregation in Azospirillum brasilense MTCC-125 with other PGPR strains: Effect of physical and chemical factors and stress endurance ability. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 40:491. 2009

6. Melloni, R. et al. Densidade e diversidade fenotípica de bactérias diazotróficas endofíticas em solos de mineração de bauxite, em reabilitação. Rev. Bras. Cienc. Solo. 28:85. 2004

7. Oliveira, A. et al. Survival of endophytic diazotrophic bacteria in soil under different moisture levels. Brazilian Journal of Microbiology. 35:295. 2004

8. Reis-Junior, F. et al. Ocorrência de bactérias diazotróficas em diferentes genótipos de cana-de-açúcar. Pesq Agropec Bras. 35 (5):985. 2000

9. Reis-Junior, F. et al. Identificaçao de isolados de Azospirillum amazonense asociados a Brachiaria spp., em diferentes épocas e condiçoes de cultivo e produção de fitormônio pela bacteria. Rev. Bras. Cienc. Solo. 28:103. 2004

10. Rodrigues, L. et al. Diversidade de bacterias diazotróficas endofíticas dos generos Herbaspirillum e Burkholderia na cultura do arroz inundado. Pesq. Agropec. Bras. 41 (2):275. 2006

11. Texeira, M. et al. Diversidade de bactérias edofíticas na cultura da mandioca. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento-Embrapa. No. 33, 22 p. 2005.

Recibido el 22 de abril del 2009

Aceptado el 11 de mayo del 2010