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Pastos y Forrajes

versión impresa ISSN 0864-0394versión On-line ISSN 2078-8452

Pastos y Forrajes vol.38 no.3 Matanzas jul.-set. 2015

 

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

 

 

 

Efecto de la temperatura y el pH en la producción de biomasa de Azospirillum brasilense C16 aislada de pasto guinea

 

Effect of temperature and pH on the biomass production of Azospirillum brasilense C16 isolated from Guinea grass

 

 

 

F. Romero-Perdomo1, M. Camelo-Rusinque1, Paola Criollo-Campos1 y Ruth Bonilla-Buitrago1*

1Laboratorio de Microbiología de Suelos, Centro de Investigación Tibaitatá, Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria-Corpoica, kilómetro 14 vía Mosquera, Cundinamarca, Colombia
* Autor para correspondencia: rbonilla@corpoica.org.co

 

 

 


RESUMEN

El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de la temperatura y el pH en la viabilidad celular de la cepa Azospirillum brasilense C16. Se estudiaron cinco temperaturas (entre 28 y 36°C) y cinco pH (de 4,5 a 8,5). El efecto de la temperatura se evaluó mediante la medición del crecimiento radial (mm) de la cepa, sobre un papel de filtro en medio batata. En el caso del pH se utilizó un fermentador de tanque agitado -con una configuración tipo Rushton- para cuantificar la velocidad de crecimiento, la producción de biomasa y el tiempo de duplicación de la cepa; las condiciones de fermentación fueron: 400 rpm, 1 Lpm y 30°C, durante 24 horas. El pH y la temperatura influyeron significativamente (p < 0,05) en la producción de A. brasilense C16. La temperatura de 30°C fue la más favorable para que se multiplicara la cepa, con 23,21 mm de crecimiento radial; mientras que la mayor o igual a 34°C inhibió su crecimiento. Los mejores resultados se obtuvieron con un pH de 6,8, con diferencias significativas (p < 0,05) respecto al resto. Con esta condición se obtuvieron los valores más altos de velocidad de crecimiento (1,79 h-1) y producción de biomasa (8,65 log10 UFC mL-1), y el valor más bajo del tiempo de duplicación (1,09 h-1). Estos resultados poseen aplicabilidad biotecnológica, y son de gran importancia en el momento de definir y controlar las condiciones de producción masiva de biomasa de A. brasilense C16 para futuras formulaciones como biofertilizante en diversos cultivos de interés en Colombia.

Palabras clave: Bacteria, gramínea, inoculación.


ABSTRACT

The objective of the study was to evaluate the effect of temperature and pH on the cell viability of the strain Azospirillum brasilense C16. Five temperatures (between 28 and 36 ºC) and five pH values (from 4,5 to 8,5) were studied. The effect of temperature was evaluated by measuring the radial growth (mm) of the strain, on a filter paper in sweet potato agar. In the case of pH to quantify the growth rate, biomass production and time of duplication of the strain a Rushton-type turbine-agitated fermenter was used; the fermentation conditions were: 400 rpm, 1 Lpm and 30 ºC, during 24 hours. The pH and temperature significantly influenced (p< 0,05) the production of A. brasilense C16. The temperature of 30 ºC was the most favorable for the strain to be multiplied, with 23,21 mm of radial growth; while the temperature higher than or equal to 34 ºC inhibited its growth. The best results were obtained with a pH value of 6,8, with significant differences (p< 0,05) compared with the others. Under this condition the highest growth rate values (1,79 h-1) and biomass production (8,65 log10 CFU mL-1), and the lowest value of the duplication time (1,09 h-1), were obtained. These results have biotechnological applicability, and are very important at the moment of defining and controlling the conditions of massive biomass production of A. brasilense C16 for future formulations in diverse crops of interest in Colombia.

Keywords: Bacterium, grass, inoculation.


 

 

INTRODUCCIÓN

El uso de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (BPCV) para la formulación de biofertilizantes se ha convertido en una de las tecnologías limpias más promisorias para el desarrollo de la agricultura sostenible (Bashan et al., 2013). Entre las BPCV que más se destacan se encuentran las del género Azospirillum, que tiene la capacidad de fijar nitrógeno; solubilizar fósforo; producir citoquininas, giberelinas e indoles; reducir nitratos; así como formar diferentes clases de asociaciones con las plantas para mejorar el desarrollo de las raíces e incrementar la tasa de absorción de agua y minerales (Fibach-Paldi et al., 2012). Debido a estas capacidades Azospirillum sp. se ha aplicado en cultivos de maíz, arroz y trigo, a nivel mundial (Díaz-Zorita y Fernández-Canigia, 2009; Bashan y De Bashan, 2010).
Cárdenas et al. (2014) demostraron la eficiencia de la cepa Azospirillum brasilense C16 para promover el crecimiento del pasto guinea (Megathyrsus maximus (Jacq.) B. K. Simon & S. W. L. Jacobs var. Tanzania), en el municipio Agustín Codazzi (Cesar, Colombia).

Con el fin de potenciar la actividad microbiana de los biofertilizantes es necesario definir los parámetros de crecimiento celular de las cepas que los conforman, máxime para un propósito específico como la producción de enzimas o de biomasa (Bhattacharyya y Jha, 2012). Aunque se han realizado investigaciones relacionadas con la optimización de las condiciones para la síntesis de ácido glucónico y polihidroxialcanoatos por especies del género Azospirillum, existen pocos estudios sobre el efecto de las condiciones fisicoquímicas en su multiplicación masiva (Rodríguez et al., 2004; Moreno-Galván et al., 2012). Por tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de factores fisicoquímicos, como la temperatura y el pH, en el crecimiento de la cepa A. brasilense C16.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Microorganismo y condiciones de cultivo. Se empleó la cepa C16, identificada molecularmente como A. brasilense (Cárdenas et al., 2010). Esta se aisló, a partir de suelos cultivados con gramíneas forrajeras en Codazzi (Cesar, Colombia), y se seleccionó por su potencial como biofertilizante del pasto guinea (M. maximus var. Tanzania), de acuerdo con lo informado por Cárdenas et al. (2014). A. brasilense C16 se reactivó en medio batata (Döbereiner et al., 1995), a 30 ± 2°C, durante 48 horas.

Efecto de la temperatura. Se evaluó el efecto de cinco temperaturas (28, 30, 32, 34 y 36°C) en el crecimiento de A. brasilense C16, con un diseño completamente al azar por triplicado. Se preparó una suspensión bacteriana en una solución de NaCl al 0,85 %, de la cual se tomaron 20 µl para inocular un disco de papel de filtro, que se colocó sobre el medio de cultivo batata contenido en una placa Petri, para cuantificar el crecimiento de la bacteria (mm) durante cinco días.

Influencia del pH. Se empleó un fermentador (MINIFORS, modelo INF-30174), con 3,5 L de volumen efectivo de trabajo. La estandarización del inóculo de la cepa se realizó en medio Azosp-1 (Rivera et al., 2012), con el empleo del 10 % (v/v) de una suspensión bacteriana. Se evaluaron cinco pH (4,5; 5,5; 6,8; 7,5 y 8,5) y el diseño fue completamente al azar, con tres repeticiones. Los pH fueron controlados con NaOH (1N) y HCl (1N). Las condiciones de fermentación fueron: 400 rpm, 1 Lpm, a 30°C ?temperatura que más favoreció el crecimiento de la cepa?, durante 24 horas. La variable de respuesta fue la viabilidad celular, que se expresó como log10 UFC mL-1, en medio batata, mediante la técnica de microgota y diluciones seriadas (Doyle et al., 2001). Se cuantificó la viabilidad cada dos horas, y se definió la curva de crecimiento para cada pH; a cada curva se le determinó la velocidad máxima de crecimiento (µx) y el tiempo de duplicación.

Análisis estadístico. La normalidad y la homogeneidad de la varianza de los resultados se determinaron mediante las pruebas de Shapiro Wilk y Bartlett, respectivamente. Una vez demostrados estos principios, se aplicó un ANOVA y la prueba de comparación de medias de Tukey. El procesamiento de los datos se realizó con el paquete estadístico SPSS 17 (Analytical Software, Florida, EE. UU.), con un 95 % de nivel de confianza.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El pH y la temperatura influyeron significativamente (p < 0,05) en la producción de A. brasilense C16. La temperatura de 30°C favoreció más el crecimiento de la cepa (fig. 1), y se hallaron halos de 23,21 mm a los cinco días de incubación. Después, se encontraron halos de tamaño inferior a los 32 y 28°C (10 y 25 % por debajo de ese valor, respectivamente). Mientras tanto, a los 34 y 36°C se inhibió totalmente el crecimiento de C16 desde las 24 horas. Por tanto, la producción óptima de C16 ocurrió entre 30 y 32°C. En este sentido, Kaushik et al. (2002) afirmaron que temperaturas subóptimas, como 22°C, generaron disminución en la biomasa y en la producción de sustancias promotoras del crecimiento vegetal en A. brasilense CDJA y A40. Resultados similares fueron encontrados por García et al. (2007) y Molina-Favero et al. (2008), quienes sugirieron el uso de temperaturas entre 29 y 32°C para la producción de biomasa, auxinas y óxido nítrico en bacterias pertenecientes al género Azospirillum.

Por otra parte, se observaron drásticas disminuciones de la biomasa en los cinco pH evaluados. El valor 6,8 favoreció más la producción de biomasa de la cepa, y difirió significativamente (p < 0,05) del resto; con este pH se cuantificaron 8,65 log10 UFC mL-1 a las 24 horas de crecimiento (fig. 2). Además, se encontró el valor más alto de velocidad de crecimiento y el más bajo de tiempo de duplicación: 1,79 h-1 y 1,09 h-1, respectivamente (fig. 3). Steenhoudt y Vanderleyden (2000) señalaron que el rango ideal de pH para la producción de biofertilizantes a base de Azospirillum varía entre 6,5 y 7,0; lo que se corrobora con lo obtenido en este estudio.

En comparación con el pH 6,8, en 5,5 y 7,5 se cuantificaron valores de producción de biomasa por debajo de una y tres unidades logarítmicas, a las 24 horas de crecimiento. Por tanto, los valores de los dos parámetros de la cinética de crecimiento presentaron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05). Es de señalar que 5,5 favoreció más la producción que 7,5. Estos resultados indican que los pH levemente ácidos, cercanos a la neutralidad, favorecen más la producción de biomasa de A. brasilense C16 que los alcalinos.

Sivasakthivelan y Saranraj (2013) informaron que los pH superiores a la neutralidad tienen más aplicabilidad para la producción de compuestos y metabolitos de interés industrial que para la producción de biomasa celular, en el género Azospirillum sp. En este sentido, Dahm et al. (1993) sugirieron el uso de pH superiores a 7,5 para potenciar la síntesis de vitaminas del grupo B como la riboflavina.

Respecto a los dos pH más extremos a la neutralidad (4,5 y 8,5), se infirió que estos afectan el metabolismo de A. brasilense C16. En la figura 2 se muestra que desde la hora 6 hubo un descenso progresivo de la viabilidad a través del tiempo, al punto de no existir inicio de fase exponencial. Tan solo una pequeña fase de adaptación, con un incremento de la hora 4 a la hora 6, se observó en el pH 4,5. Por ende, la velocidad de crecimiento en estos dos pH fue menor, y el tiempo de duplicación fue dos veces superior respecto a los demás pH (fig. 3).

 

CONCLUSIONES

La temperatura y el pH influyeron significativamente (p < 0,05) en la viabilidad de A. brasilense C16. La producción máxima se obtuvo a los 30°C y a un pH de 6,8. Los resultados del presente estudio poseen aplicabilidad biotecnológica, y son de gran importancia en el momento de definir y controlar las condiciones de producción masiva de biomasa de A. brasilense C16 para futuras formulaciones como biofertilizante en diversos cultivos de interés en Colombia.

 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Bashan, Y.; Bashan, L.E.; Prabhu, S.R. & Hernandez, J.P. Advances in plant growth-promoting bacterial inoculant technology: formulations and practical perspectives (1998-2013). Plant and Soil. 378 (1-2): 1-33, 2013

2. Bashan, Y. & de-Bashan, L.E. How the plant growth-promoting bacterium Azospirillum promotes plant growth-a critical assessment. Adv Agron. 108:77-136, 2010.

3. Bhattacharyya, P.N. & Jha D.K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (4): 1327-1350, 2012.

4. Cárdenas, D.M.; Garrido, Ma.F.; Roncallo, B. & Bonilla, R. Inoculación con Azospirillum spp y Enterobacter aglomerans en Pasto Guinea (Megathyrsus maximus Jacq.) en el Departamento de Cesar (Colombia). Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín. 67 (2): 7271-7280, 2014.

5. Cárdenas, D.M.; Garrido, Ma.F.; Bonilla, R. & Baldani, V.L. Aislamiento e identificación de cepas de Azospirillum sp. en pasto guinea (Megathyrsus maximus Jacq.) del Valle del Cesar. Pastos y Forrajes. 33:285-300, 2010.

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7. Díaz-Zorita, M. & Fernández-Canigia, M.V. Field performance of a liquid formulation of Azospirillum brasilense on dryland wheat productivity. Eur J Soil Biol. 45:3-11, 2009.

8. Döbereiner, J.; Baldani, V.L.D. & Baldani, J.I. Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas ñao leguminosas. Brasília: EMBRAPA-SPI. Itaguaí, Brasil. p. 11-60, 1995.

9. Doyle, M.; Beuchat, L. & Montville, T. Microorganismos indicadores y criterios microbiológicos. En: Microbiología de los alimentos fundamentos y fronteras. 1 ed. España: Acribia. p. 816, 2001.

10. Fibach-Paldi, S.; Burdman, S. & Okon Y. Key physiological properties contributing to rhizosphere adaptation and plant growth promotion abilities of Azospirillum brasilense. FEMS Microbiol Lett. 326: 99_108, 2012.

11. García, J.G.; Moreno, V.R.; Rodríguez, I.C.; Mendoza, A. & Mayek, N. Efecto de cepas de Azospirillum brasilense en el crecimiento y rendimiento de grano del maíz. Revista Fitotecnia Mexicana. 30(3): 305-310, 2007.

12. Kaushik, R.; Saxena, A. & Tilak, K. Can Azospirillum strains capable of growing at a sub-optimal temperature perform better in field-grown-wheat rhizosphere. Biology and Fertility of Soils. 35 (2): 92-95, 2002.

13. Molina-Favero, C.; Creus, C.M.; Simontacchi, M.; Puntarulo, S. & Lamattina, L. Aerobic nitric oxide production by Azospirillum brasilense Sp245 and its influence on root architecture in tomato. Mol. Plant Microbe Interact. 21: 1001_1009, 2008.

14. Moreno-Galván, A; Rojas-Tapias, D. & Bonilla, R. Development and evaluation of an alternative culture medium for mass cultivation of Azospirillum brasilense C16 using sequential statistical designs. Revista Corpoica - Ciencia y Tecnología Agropecuaria. 13 (2): 201-206, 2012.

15. Rivera, D.; Obando, M. & Bonilla, R. Estandarización de un medio de cultivo a partir de fuentes agroindustriales para la multiplicación de Azospirillum brasilense. Revista de la UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER. 2 (2): 31-38, 2012.

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17. Sivasakthivelan, P. & Saranraj, P. Azospirillum and its formulations: A Review. International Journal of Microbiological Research. 4 (3): 275-287, 2013.

18. Steenhoudt, O. & Vanderleyden, J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects. FEMS Microbiology Reviews. 24 (4): 487-506, 2000.

 

 

 

Recibido el 8 de mayo de 2015
Aceptado el 17 de junio de 2015

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