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INTRODUCCIÓN
Entre los microorganismos antagonistas del suelo, empleados en la agricultura como biocontroladores eficientes de diferentes patógenos, se destacan diversas especies del género Trichoderma, como Trichoderma harzianum Rifai y Trichoderma viride Persoon, capaces de colonizar sustratos rápidamente, desarrollar actividad antagónica contra un amplio rango de agentes fitopatógenos, activar resistencia sistémica inducida en plantas y promover el crecimiento vegetal (1).
Las especies de Trichoderma son versátiles, adaptables y de fácil manipulación, lo que permite utilizarlas en el manejo de enfermedades causadas por patógenos fúngicos del suelo en varios cultivos (2). Su presencia en suelos agrícolas y naturales las reafirma como competidores por espacio y nutrientes, capaces de colonizar los sustratos disponibles o sobrevivir, en forma de clamidosporas o conidios, cuando estos son escasos (1).
El empleo de fórmulas comerciales de Trichoderma contra hongos fitopatógenos en determinadas regiones agrícolas, sin tener en cuenta las condiciones edafoclimáticas específicas, condujo a un efecto biorregulador no uniforme, inadaptabilidad y baja eficacia de las cepas en las aplicaciones, por lo que es recomendable la búsqueda de aislamientos autóctonos de este hongo, con el fin de encontrar cepas mejor adaptadas a las condiciones donde serán utilizadas para el biocontrol (3).
Rhizoctonia solani Kühn. provoca pudrición de la raíz y el cuello de las plantas de tomate (Solanum lycopersicon L.) y ocasiona pérdidas severas que afectan la calidad y la cantidad de la producción en este cultivo (4). En el cultivo de la papa (Solanum tuberosum L.), la enfermedad causada por este hongo constituye uno de los problemas fitosanitarios más importantes (5). Por otra parte, Sclerotium rolfsii Sacc. es un hongo patógeno del suelo, de amplia distribución y capaz de ocasionar pérdidas considerables en diversos cultivos, entre los que se destacan la soya (Glycine max L.) y el garbanzo (Cicer arietinum L.) y su supervivencia en suelos se relaciona con la formación de esclerocios que permanecen viables por varios años en condiciones de baja humedad, con amplio rango de pH y temperatura (6).
Las especies de Fusarium son agentes causales de enfermedades fúngicas que ocasionan en diferentes cultivos síntomas en raíces, tallos y hojas, tales como pudriciones radicales, pudriciones secas, necrosis del tallo y de las hojas, marchiteces y defoliaciones (7,8). Diversas cepas de Trichoderma evidenciaron tener efecto sobre estos tres hongos fitopatógenos (9).
Al evaluar la actividad micoparasítica in vitro de 73 aislamientos de Trichoderma spp. sobre dos aislamientos de Rhizoctonia provenientes de arroz y de frijol, se encontró que los aislamientos de T. harzianum T53 (que constituían el 31,5 % de todos los aislamientos probados de esta especie) resultaron tener antagonismo in vitro sobre cinco de los seis aislamientos de fitopatógenos evaluados (10).
Los aislamientos nativos de Trichoderma spp. presentaron efecto antagónico sobre S. rolfsii aislado de cacahuate, en experimentos de laboratorio, donde el porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) varió entre 10 y 94,40 %, en dependencia de la cepa de Trichoderma empleada; el aislado Tcn-11 (T. harzianum) inhibió el crecimiento del fitopatógeno y evitó su desarrollo en el 80,0 % de la superficie del medio en la placa Petri (11).
La evaluación del efecto antagonista in vitro de varios aislados de Trichoderma spp. contra F. oxysporum (Schlechtend. Fr) f. sp. lycopersici (Sacc.) Snyder & Hans procedente de tomate, mostró mayores valores de PICR (56,92 %) y de porcentaje de inhibición de la esporulación (PIE) (92,11 %) de este fitopatógeno, en comparación con otros aislados biocontroladores en este cultivo, como Bacillus sp., por lo que se informa un antagonismo destacado de Trichoderma sobre F. oxysporum, no solo por la inhibición sino también por la invasión de su crecimiento (12,13).
No existen indicios de que Trichoderma sea patógeno sobre alguna planta, lo que lo convierte en un microorganismo de incalculable valor agrícola (14). Un incremento en la disponibilidad de cepas autóctonas de Trichoderma spp. permitiría emprender más eficientemente las estrategias de lucha integrada contra diferentes patógenos del suelo en varios cultivos en la provincia Matanzas. La presente investigación tuvo como objetivo ampliar la disponibilidad y la diversidad de cepas autóctonas de Trichoderma spp. mediante su aislamiento, identificación y evaluación in vitro a partir de dos agroecosistemas de la provincia.
MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación se desarrolló en dos etapas: I) toma de muestras del suelo, aislamiento e identificación de los aislados; II) evaluación del efecto in vitro de los aislados de Trichoderma autóctonos de la zona muestreada sobre aislamientos de hongos fitopatógenos R. solani, S. rolfsii y Fusarium spp.
Las muestras de suelo se extrajeron de dos agroecosistemas de los municipios Matanzas y San Miguel de los Baños, de la provincia Matanzas; ambos con suelo ferralítico rojo (15) que no recibieron, históricamente, aplicaciones de medios químicos ni biológicos. Estos fueron:
Agroecosistema Matanzas, consistente en un área boscosa de vegetación muy variada ubicado al norte de la provincia, a 1 km de distancia del río Buey Vaca, 400 m del Ferrocarril Central y 300 m de la Carretera Central (Figura 1) (16). La zona presenta un promedio anual de precipitaciones de 1181 mm. La dirección del viento es de Norte a Oeste.
FIGURA 1 Mapa satelital de la localidad de Guanábana, municipio de Matanzas. La imagen muestra el área boscosa donde se realizó la colecta de las muestras y sus coordenadas geográficas. / Satellite map of the locality of Guanábana, Matanzas municipality. The image shows the forest area where the samples were collected and its geographic coordenates. Fuente: http://mapasamerica.dices.net/cuba/mapa.php?nombre=Guanabana&id=23634.
Agroecosistema San Miguel de los Baños, con dos áreas, una sembrada de pinos (Pinus cubensis Griseb) y otra cubierta de marabú (Dichrostachis cinerea L.). Esta zona se caracteriza por presentar precipitaciones variables, con incrementos desde marzo hasta junio. Para la prospección de nuevos aislamientos de Trichoderma spp., a partir de muestras de suelo, se utilizó la metodología de Bateman (17).
Del bosque del agroecosistema Matanzas, se tomaron tres muestras de suelo. Del agroecosistema San Miguel de los Baños se tomaron dos muestras de pino (P. cubensis) y una de marabú (D. cinerea).
Todas las muestras se tomaron a tres profundidades: (a) en la superficie, (b) entre 0 y 10 cm y (c) entre 10 y 15 cm; sumaron en total 18.
En el momento del muestreo, las áreas del agroecosistema Matanzas presentaban 37 % de la capacidad de campo; 4,5 % de materia orgánica y suficiente iluminación; mientras que, en el agroecosistema San Miguel de los Baños, la capacidad de campo fue de 40 %, el por ciento de materia orgánica de 4,2 y la iluminación fue suficiente; todos estos valores fueron cercanos a los informados por otros investigadores (18,19). Los muestreos se realizaron mediante el método de “Bandera Inglesa”. Las muestras tomadas se vertieron, individualmente, en bolsas de nylon, se sellaron y se llevaron al Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal y al Laboratorio de Sanidad Vegetal de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Matanzas para su conservación en frío, a una temperatura aproximada de 18°C, hasta el momento de su procesamiento, después de registrar todos los datos pertinentes.
Las muestras de suelo se procesaron mediante la metodología de Sandoval y Stefanova (20), con el empleo de las diluciones decimales seriadas. Se pesó 1 g de suelo y se diluyó en 9 ml de agua destilada estéril para preparar una solución madre, agitando durante varios minutos. A partir de esta se realizaron cuatro diluciones decimales seriadas sucesivas hasta el valor 10-4. De cada dilución (entre 10-1 y 10-4) se tomó 0,1 ml para realizar la siembra en placas Petri de 10 cm de diámetro con medio Papa Dextrosa Agar (PDA) (pH = 5,6 ± 0,2) y se sembraron tres réplicas por dilución por muestra de suelo.
Las placas se incubaron a 25 ± 1oC por siete días para realizar observaciones diarias. De las placas que mostraron mayor crecimiento, al séptimo día se tomó una porción superficial de esporas de las colonias con características similares a Trichoderma spp.; se preparó una suspensión de estas y se realizó la siembra en placas con medio Agar Agua. A partir del crecimiento en este medio se tomó, de cada placa, una espora germinada bajo el Microscopio Estereoscópico para lograr los aislados monospóricos que garantizaron la pureza de las cepas. Las colonias puras se pasaron a tubos de ensayos que contenían PDA para su conservación. La identificación de las especies de Trichoderma aisladas se realizó según los criterios de Rifai (21), Samuels (22) y Barnett y Hunter (23). Para ello, se prepararon microcultivos de cada muestra y se realizaron observaciones microscópicas con lente objetivo 100X, para un aumento total de 1000 y así apreciar con calidad las características morfológicas de micelio, fiálides, conidióforos, conidios y clamidosporas. Para todos los aislamientos, las cepas obtenidas se separaron en los Grupos 1, 2 y 3, sobre la base de las características morfológicas de las estructuras observadas, la coloración de las colonias, su textura y el mayor o menor diámetro de crecimiento lineal alcanzado en igual tiempo.
Crecimiento lineal micelial de las cepas potencialmente antagonistas de Trichoderma spp.
Para determinar el crecimiento lineal micelial de las cepas antagonistas se realizaron siembras por punción de las colonias puras obtenidas de todos los aislamientos realizados y de las cepas de referencia en el centro de placas Petri con PDA (24). Posteriormente, las placas se incubaron a 25 ± 2oC bajo un régimen de luz/oscuridad y se midió diariamente (en cm) el radio de crecimiento de cada colonia durante siete días.
Evaluación del antagonismo in vitro mediante la técnica de cultivo dual. Competencia por espacio y nutrientes
Se utilizaron cepas de los hongos fitopatógenos R. solani, S. rolfsii y Fusarium spp. provenientes de papa, soya y tomate, respectivamente, identificadas morfológicamente en el Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal y depositadas en el cepario de esta institución. De igual modo, se usaron las cepas de referencia de Trichoderma 1 [T. harzianum 3(A-34)2] y 2 [T. viride 5(TS-3)1], del Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal de Matanzas, empleadas en Cuba para el control de Fusarium, Phytophthora, Pythium y Rhizoctonia (25). La capacidad antagónica de los aislamientos seleccionados e identificados de Trichoderma, procedentes del agroecosistema Matanzas y ubicados en los Grupos 1 (T. harzianum 6(A-53)2), 2 (T. viride 4(TS-3)1) y 3 (Trichoderma 2T-aislado), se verificó mediante enfrentamientos duales entre estos y los hongos fitopatógenos antes mencionados, según procedimiento de Morton y Stroube (26). También se enfrentaron contra estos fitopatógenos las cepas de referencia 1 [T. harzianum 3(A-34)2] y 2 [T. viride 5(TS-3)1].
Para ello, se realizaron con antelación siembras por dispersión sobre PDA de todos los aislamientos de los potenciales antagonistas, de las cepas de referencia y de los fitopatógenos, los que se incubaron a 25 ± 2o C bajo un régimen de luz/oscuridad durante 8-16 horas, con el fin de obtener discos de crecimiento de todas las colonias de las diferentes cepas. Posteriormente, se sembró un disco de crecimiento de cada antagonista potencial y de cada cepa de referencia en un lado de las placas, mientras que el lado opuesto se colocaba cada uno de los hongos fitopatógenos, de modo que estos quedaran próximos a los bordes de las placas y equidistantes de antagonistas y cepas de referencia. El esquema general de los enfrentamientos duales se presenta en la Figura 2.
FIGURA 2 Esquema general de los enfrentamientos duales entre las cepas antagonistas del Agroecosistema Matanzas, las cepas de referencia y los hongos fitopatógenos. / General scheme of the dual clashes between the antagonistic strains from Matanzas Agroecosystem, the reference strains and the phytopatogenic fungi.
En cada enfrentamiento se utilizaron cinco placas Petri: cuatro con el antagonista y una placa control sin el antagonista. Para analizar el antagonismo de las cepas se tuvieron en cuenta las variables radio de crecimiento del antagonista y radio de crecimiento del patógeno. El índice de antagonismo considerado fue la proporción de invasión del antagonista sobre la superficie del micelio patógeno, según la Escala de Elías et al. (27). (Tabla 1)
TABLA 1 Escala de Elías et al. (27) para la evaluación del antagonismo in vitro./ Elías et al. (27) scale for the evaluation of in vitro antagonism.
| GRADO | CAPACIDAD ANTAGÓNICA |
|---|---|
| 0 | Ninguna invasión de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno |
| 1 | Invasión de ¼ de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno |
| 2 | Invasión de ½ de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno |
| 3 | Invasión total de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno |
| 4 | Invasión total de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno; esporulación sobre esta |
Determinación del PICR. El PICR de los tres hongos fitopatógenos por las cepas aisladas y de referencia se utilizó para evaluar el antagonismo mediante competencia por nutrientes y espacio entre las cepas de Trichoderma y los tres hongos fitopatógenos; se calculó mediante la fórmula de Worasatit et al. (28), que a continuación se muestra:
donde:
D1 |
- diámetro de las colonias de los hongos fitopatógenos creciendo en placas Petri con PDA libre de antagonistas. |
D2 |
- diámetro de las colonias de los hongos fitopatógenos creciendo en placas Petri con PDA enfrentadas con las cepas antagonistas. |
El experimento se desarrolló bajo un diseño completamente aleatorizado, con 15 tratamientos y tres réplicas por tratamiento, con sus correspondientes testigos, en los que solamente se sembraron los patógenos. La unidad experimental estuvo representada por una placa Petri con medio PDA, para medir el crecimiento de cada uno de los antagonistas potenciales por placa y de las dos cepas de referencia por placa. Todas las placas con los enfrentamientos y los testigos se incubaron a temperatura de 27oC durante siete días. Las evaluaciones se realizaron diariamente mediante mediciones del radio de las colonias, con el empleo de una regla graduada, hasta que el antagonista y la cepa de referencia llegaron a cubrir el total de la superficie del medio.
Los resultados alcanzados se procesaron mediante un Análisis de Varianza Simple. Las medias del crecimiento lineal se docimaron mediante el Test de Rangos Múltiples de Duncan (p≤0,01), disponible en el paquete estadístico Statgraphic Plus, Versión 5.0.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento e identificación. A partir de los aislamientos realizados se seleccionaron las colonias que, por sus características morfológicas y culturales, se ajustaron a las descritas para el género Trichoderma (21,22,23). Estos aislamientos solo se obtuvieron del agroecosistema Matanzas. En el agroecosistema San Miguel de los Baños no se presentaron colonias con dichas características. Según sus caracteres morfológicos y culturales, todos los aislamientos de Trichoderma se identificaron en tres grupos, que se describen a continuación y se ilustran en las Figuras 3, 4 y 5.
Grupo 1. Identificado como T. harzianum, según criterios de varios autores (21,22,23) y con las siguientes características morfológicas: Hifas septadas, de 7-10 µm de ancho; conidios ovalados, unicelulares, de color verde, de 4-5 µm de diámetro, en conidióforos hialinos ramificados; fiálides sencillas o en grupos; clamidosporas unicelulares. Las características culturales de sus colonias se observan en las Figuras 3 y 4.
FIGURA 3 Colonias aisladas de Trichoderma harzianum obtenidas a partir del análisis microbiológico de muestras de suelo./ Trichoderma harzianum colonies isolated from the microbiological analysis of soil samples.
FIGURA 4 Características culturales de un cultivo puro de T. harzianum en medio PDA a las 96 horas de incubación / Cultural characteristics of T. harzianum pure culture on PDA medium after 96 hours of incubation
Grupo 2. Identificado como T. viride, según criterios de varios autores (21,22,23) y con las siguientes características morfológicas: Hifas septadas, de 6-9 µm de ancho; conidios unicelulares ovalados, de color verde, de 3-5 µm de diámetro, en conidióforos hialinos ramificados; fiálides en grupos; clamidosporas unicelulares. Las características culturales de sus colonias se observan en la Figura 5.
FIGURA 5 Características culturales de los aislamientos de T. viride./ Cultural characteristics of T. viride isolates.
Grupo 3. Identificado como Trichoderma 2T- aislado, según criterios de Rifai (21), de características morfológicas diversas y con tendencia a la incertidumbre, por lo que sus integrantes solo pudieron identificarse en la categoría de género.
Las cepas con caracteres morfológicos bien definidos y mayor crecimiento radial en medio de cultivo PDA fueron: T. harzianum 6(A-53)2 en el Grupo 1; T. viride 4(TS-3)1 en el Grupo 2 y Trichoderma 2T- aislado en el Grupo 3.
Crecimiento lineal micelial de las cepas potencialmente antagonistas de Trichoderma spp.
T. harzianum 3(A-34)2 y Trichoderma 2T-aislado presentaron las mejores respuestas, con los mayores crecimientos lineales miceliales promedio (Fig. 6) y un comportamiento similar en cuanto a su crecimiento y desarrollo en medio de cultivo PDA. Las diferencias altamente significativas (p≤0,01) de ambas cepas con las restantes y sus mayores valores de crecimiento lineal micelial en PDA (Fig. 6), reafirman la facilidad de crecimiento y desarrollo de Trichoderma en medios de cultivo apropiados (24). Estos valores también se aproximan a los obtenidos para T. harzianum (cepa A-34), del cepario de mantenimiento del Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal de Las Tunas (LPSVLT) (29) e indican sus ventajas en la competencia por espacio y nutrientes y para ejercer biocontrol por reducción o completa detención del desarrollo micelial de los patógenos estudiados (29).
T. viride 4(TS-3)1 ocupó un segundo lugar en el crecimiento lineal micelial promedio (Fig. 6) y presentó diferencias altamente significativas (p≤0,01) con el resto de las cepas. T. viride 5(TS-3)1 y T. harzianum 6(A-53)2 mostraron los menores valores de crecimiento lineal micelial promedio (Fig. 6), sin diferenciarse significativamente entre ambas, pero sí (p≤0,01) con el resto de las cepas. T. harzianum 6(A-53)2 muestra aquí un comportamiento que difiere de la cepa T. harzianum A-53 del cepario del LPSVLT (Fig. 6) (29), lo que puede atribuirse a las características propias de los suelos de diferentes procedencias.
Evaluación del antagonismo in vitro mediante la técnica de cultivo dual. Competencia por espacio y nutrientes. Determinación del PICR
A las 96 horas, Trichoderma 2T-aislado, T. harzianum 6(A-53)2, T. harzianum 3(A-34)2 y T. viride 5(TS-3)1 mostraron porcentajes de inhibición que no diferían significativamente para S. rolfsii y Fusarium spp., pero sí con respecto a R. solani. Sin embargo, para T. viride 4(TS-3)1 los PCIR provocados no presentan diferencias significativas entre los tres patógenos (Fig. 7). En general, los mayores PCIR contra los tres patógenos los mostraron Trichoderma 2T-aislado y T. harzianum 3(A-34)2.
Resultados similares se observaron al evaluar in vitro diferentes aislados de Trichoderma contra R. solani aislada de piña, los que inhibieron el crecimiento radial de este patógeno en 40-50 % (30) y en el antagonismo de T. harzianum contra S. rolfsii (26).
FIGURA 7 PICR de las cepas de Trichoderma aisladas y de referencia contra los tres patógenos / PICR of isolated and reference strains against the three pathogens.
Los enfrentamientos de aislamientos nativos de T. harzianum contra Fusarium oxysporum, en condiciones in vitro, demostraron la represión del crecimiento del patógeno por parte del antagonista (31). Al crecer, el micelio de Trichoderma spp. compitió por espacio y nutrientes del medio de cultivo y generó un efecto indirecto de reducción del crecimiento radial del patógeno, al ocupar su espacio y extraer los suministros de nutrientes (32). Investigaciones sobre el antagonismo de T. harzianum A-34 y T. harzianum A-53 frente a R. solani aislado de tallo, hojas y raíces afectadas de arroz (Oryza sativa L.) permitieron observar que ambos aislados del antagonista mostraron una actividad antagónica elevada y buenas potencialidades de biocontrol contra este patógeno (29). Al tratar in vitro con T. viride (cepas PDBCTV 23 y 32) semillas de garbanzo afectadas por R. solani se observó la más baja incidencia de la enfermedad en las semillas germinadas; resultado que permite corroborar las posibilidades de antagonismo de la cepa T. viride 4(TS-3)1 contra el patógeno en cuestión (33). Al enfrentar in vitro los aislamientos TWN1, TGN1, TJP1, TWC2 (T. harzianum) contra S. rolfsii, todos inhibieron el crecimiento micelial de este patógeno en más de 50 % y el aislamiento TWN1 (T. harzianum) lo hizo con un por ciento de inhibición altamente significativo (76,3 %) de este patógeno (34).
Finalmente, se aprecia que T. harzianum 3(A-34)2 y Trichoderma 2T-aislado presentaron las mejores potencialidades para ejercer un buen control in vitro sobre los tres patógenos. (Fig. 7)
CONCLUSIONES
Se aíslan e identifican las cepas autóctonas Trichoderma 2T-aislado, Trichoderma harzianum 6(A-53)2 y Trichoderma viride 4(TS-3)1 a partir de un suelo ferralítico rojo, procedente de un agroecosistema de la provincia Matanzas; Trichoderma 2T-aislado resultó el antagonista in vitro más eficiente contra los hongos fitopatógenos Rhizoctonia solani, Fusarium spp. y Sclerotium rolfsii.
Entre las cepas de referencia, Trichoderma harzianum 3(A-34)2 presentó el mayor antagonismo contra los tres hongos fitopatógenos.
Se demuestra que, tanto las cepas autóctonas como las de referencia, presentaron diferentes niveles de actividad antagónica in vitro contra los tres hongos fitopatógenos.
