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Revista de Protección Vegetal

Print version ISSN 1010-2752On-line version ISSN 2224-4697

Rev. Protección Veg. vol.33 no.3 La Habana Sept.-Dec. 2018

 

Artículo Original

Filtrados fúngicos de Trichoderma con actividad nematicida contra Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitwood

Fungal filtrate of Trichoderma with nematicidal activity against Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitwood

Jairo Cristóbal-Alejo1 

Jiram Ivan Cetz-Chi1 

José Ma. Tún-Suárez1 

Felicia Amalia Moo-Koh1 

Fernando Antonio Peraza-Luna2 

Juan Candelero-De la Cruz2  * 

1TecNM/Instituto Tecnológico de Conkal, Km 16.3, antigua carretera Mérida-Motul. 97345, Conkal, Yucatán, México

2TecNM/Instituto Tecnológico de Tizimín, final aeropuerto Cupul s/n. 97700, Tizimín, Yucatán, México.

RESUMEN

El objetivo de este estudio fue evaluar in vitro la capacidad de 41 filtrados de aislados nativos de Trichoderma en la inhibición de la eclosión de huevos y la mortalidad de juveniles del segundo estadio (J2) del nematodo agallador Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitwood. Los aislados fúngicos crecieron en PDA a 30°C durante ocho días; se colocaron discos de 5 mm en el medio de cultivo líquido, 200 g papa y 20 g dextrosa. L-1 de agua destilada. Se realizó una serie de filtrados con gasas estériles, inmediatamente se centrifugó el sobrenadante durante 5 min a 3000 rpm, papel Whatman número 1 y a través de un filtro miliporo de 0,45 µm. El ensayo in vitro se condujo en dos etapas, la primera fue adicionar 1 ml de cada filtrado fúngico en siracusas con 50 huevos del fitonematodo y se evaluó el efecto inhibitorio de la eclosión a las 72, 96 y 120 h de exposición; la segunda consistió en colocar en estos filtrados 25 juveniles de segundo estadio (J2) de M. incognita y se estimó su actividad contra movilidad, mortalidad y reversibilidad a las 24 y 48 h. Los tratamientos los conformaron los 41 filtrados fúngicos y un testigo con agua destilada estéril, con cuatro repeticiones, distribuidas en un diseño completamente al azar. Los filtrados lograron hasta 91,1 % de inhibición de la eclosión de huevos del fitonematodo y hasta 92,24 % de mortalidad en los J2 en los diferentes periodos de exposición a los filtrados fúngicos.

Palabras clave: biocontrol; fitonematodo; metabolitos secundarios; nematodos agalladores

ABSTRACT

The objective of this study was to evaluate the in vitro properties of 41 Trichoderma native strains in egg hatching and mortality of the second stage (J2) of root knot nematode M. incognita. Trichoderma strains were grown on PDA at 30°C for eight days, and then 5 mm discs were placed in the liquid culture medium containing 200 g potato and 20 g dextrose L-1 distilled water. A series of filtrations were performed with sterile gauze, immediately centrifuged for 5 min at 3000 rpm, Whatman paper no. 1 and through a 0.45 μm milipore filter. The in vitro assay was conducted in two stages; the first was to add 1 ml of each fungal filtrate in siraccus with 50 eggs of the phytonematode and evaluated at 72. 96 and 120 h of exposure; the second consisted in adding these same filtrates with 25 second stage juvenils (J2) of M. incognita and its antagonistic effect was evaluated at 24 and 48 h, and the reversibility effect. The treatments consisted of 41 fungal filtrates and one control with sterile distilled water, four replicates distributed in a completely random design. The results indicated that the filtrates achieved up to 91.10 % inhibition of egg hatching of the phytonematode and up to 92.24 % mortality of J2 of M. incognita at different exposure times to the fungal filtrates.

Key words: biocontrol; phytonematode; root knot nematodes; secondary metabolites

INTRODUCCIÓN

Los nematodos del género Meloidogyne son endoparásitos sedentarios formadores de agallas radiculares, tienen una amplia distribución y están presentes en varias regiones agrícolas en el mundo. En México afectan un gran número de especies cultivadas (1,2). La presencia de estos organismos puede facilitar la penetración e infección de otros fitopatógenos, como hongos y bacterias, y causar mayores pérdidas de producción (3). En México se tienen registros de pérdidas anuales en tomate (Solanum lycopersicum L.) del 20 al 52 % y, en ocasiones, han causado el abandono total de parcelas de chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) (4,5,6).

Para su control, en las últimas décadas se recurrió al uso excesivo de nematicidas químicos que resultaron inefectivos, especialmente cuando las poblaciones del nematodo son altas; además de que pueden generar poblaciones resistentes, sin mencionar los daños en la salud humana, al ambiente y la pérdida de la biodiversidad de las poblaciones antagonistas naturales contra fitoparásitos asociados a la rizosfera del suelo (7). A esta situación se suma la demanda por los consumidores de alimentos libres de agroquímicos y la exigencia de políticas internacionales para reducir las fuentes de contaminación ambiental a través de estrategias necesarias de control más amigables con el ambiente.

Ante este panorama, en los últimos años se intensificó la búsqueda de aislamientos microbianos con actividad nematicida para reducir el impacto negativo de estos contaminantes en los agroecosistemas. Entre los más estudiados, por sus efectos como agentes de biocontrol contra fitopatógenos de raíces y con origen en el suelo, se encuentran Bacillus subtilis Ehrenberg y Cohn, Arthrobotrys oligospora Fres., Rhizophagus intraradices (NC Schenck y GS Sm.) C. Walker y A. Schuessler (anteriormente Glomus intraradices) NC Schenck & GS Sms y especies de Trichoderma (8,9,10). Estas últimas se caracterizan por su habilidad competitiva de crecer y adaptarse en diversos tipos de sustratos y condiciones ambientales, cuya capacidad más señalada se asocia con la producción de metabolitos secundarios (volátiles o no), de bajo peso molecular, que se liberan durante su establecimiento en la rizosfera (11,12).

En este sentido, durante el proceso de obtención de nuevos productos biológicos es esencial la selección de aislados promisorios, por lo que los estudios in vitro son fundamentales para estos propósitos. El objetivo del presente trabajo consistió en evaluar la efectividad inhibitoria de eclosión de huevos y efecto nematicida en juveniles de segundo estadio de M. incognita de aislamientos nativos de Trichoderma.

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se realizó en el laboratorio de Fitopatología del Instituto Tecnológico de Conkal (ITC), ubicado en Yucatán, a 20º06´ latitud norte y 89º29´ longitud Oeste.

Obtención del nematodo M. incognita

La población de nematodos utilizada en el estudio provenía de cultivos hortícolas. A través de las características de los patrones perineales de hembras adultas extraídas y otros caracteres morfotaxonómicos (13), se determinó que se trataba de la especie M. incognita.

Los huevos y juveniles (J2) se obtuvieron de las raíces agalladas que se trasladaron al laboratorio; se lavaron con agua corriente para eliminar residuos de suelo, se cortaron y se depositaron en cajas Petri. Con ayuda de agujas de disección y microscopio estereoscopio (Leica Zoom 2000) se disectaron las raíces agalladas y se extrajeron las masas de huevos del fitoparásito, que se conservaron en refrigeración a 6⁰C y, posteriormente, se inocularon en plantas de 25 cm de altura para mantener la población del fitonematodo en una estructura de casa sombra.

El inóculo de M. incognita se obtuvo disectando las raíces para obtener masas de huevos. Para favorecer el desprendimiento de los huevos y eliminar microorganismos que pudieran dañar su viabilidad, se desinfestaron las masas con hipoclorito de sodio (NaClO) al 1 % durante 2 min y al finalizar se hicieron lavados sucesivos en tamices de malla números 300 y 400; se colocaronen estufa de cultivo a 29,6°C durante cuatro días para su eclosión (10,14).

Filtrados de Trichoderma spp.

Los aislados de Trichoderma spp. (Tabla 1) se obtuvieron del cepario del laboratorio de Fitopatología del ITC y se reactivaron en medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) a 30ºC durante ocho días; se inocularon discos de 5 mm con micelio fúngico en un medio de cultivo líquido a base de 300 y 20 g de papa y dextrosa, respectivamente, en un litro de agua destilada con un pH final de 6,8 y se dejaron crecer a 30ºC sin agitación, durante 27 días. Al finalizar, se realizó una serie de filtrados; el primero con gasas estériles, inmediatamente se centrifugó el sobrenadante durante 10 min a 3000 rpm, el tercero con papel Whatman número 1 y el último utilizando filtro milipore de 0,45 µm. Los filtrados fúngicos se recolectaron en tubos Falcon de 50 ml de capacidad y se conservaron a 4°C en refrigeración (14).

TABLA 1 Denominación y origen de los 41 aislados nativos de Trichoderma de suelo con1 y sin2 uso agrícola en 18 municipios del estado Yucatán, México. / Denomination and origin of the 41 native Trichoderma isolates of soil with 1 and without 2 agricultural use in 18 municipalities of the state of Yucatan, Mexico. 

Municipios Registros
Tizimín Th01-011, Th01-021, Th02-042
Panabá Th03-051, Th04-072
Dzilám G. Th05-071, Th06-B62, Th06-712
Buctzotz Th09-121, Th09-131, Th10-D862
Dzidzantún Th11-D1101, Th12-B852
Yobain Th13-201, Th14-212
Maxcanú Th16-A942, Th16-B922, Th16-C1072, Th16-D1062
Halachó Th18-302, Th18-632
Tzucacab Th19-321, Th20-352
Peto Th21-411, Th22-432
Tekax Th23-681
Tadzhiu Th25-521, Th25-681, Th26-532
Akil Th29-541, Th29-551, Th30-662
Oxkuztcab Th32-562
Ticul Th33-371, Th33-581, Th33-591
Saccalum Th35-671, Th35-701, Th36-602
Cuzamá Th38-612
Homún Th40-622
Testigo Agua destilada estéril (ADE)

Inhibición de la eclosión de huevos de M. incognita por filtrados de Trichoderma spp. en

El ensayo in vitro se condujo en dos etapas, la primera consistió en adicionar 1 ml de cada filtrado de los 41 aislados nativos del género Trichoderma en siracusas estériles; posteriormente, se colocaron 50 huevos del nematodo agallador y se evaluó la inhibición de la eclosión de huevos a las 72, 96 y 120 h de exposición a los filtrados fúngicos.

Efecto de los filtrados de Trichoderma spp. contra juveniles (J 2 ) de M. incognita

En la segunda etapa se colocaron en las siracusas 25 juveniles de segundo estadio (J2) de M. incognita y se evaluó el efecto nematostático de los filtrados a las 24 y 48 h. La inmovilización del nematodo se confirmó con la ayuda de un pincel con el que se estimuló al nematodo en su región cefálica, si no daba respuesta de movimiento al estímulo se consideró inviable (15,10). Al finalizar las evaluaciones, se realizó la prueba de reversibilidad que consistió en retirar, con ayuda de una jeringa, el filtrado y su reemplazo con agua destilada estéril. Después de 24 h se contabilizaron la movilidad y la mortalidad de los J2.

Los filtrados fúngicos conformaron 41 tratamientos y un testigo con agua destilada estéril (Tabla 1), con cuatro repeticiones, distribuidas en un diseño experimental completamente al azar. Para la selección del mejor aislado con actividad de inhibición de huevos y mortalidad de J2 de M. incognita, se realizó un análisis de varianza y comparación de medias (Scott & Knott, p≤0,05) mediante el paquete estadístico InfoStat versión 2012 (16).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Inhibición de la eclosión de huevos de M. incognita por acción de filtrados de Trichoderma spp.

Los filtrados fúngicos afectaron, significativamente (p≤0,001), la eclosión de huevos de M. incognita en los tres momentos de evaluación.

Al finalizar el estudio se confirmó la viabilidad de huevos del fitonematodo con el tratamiento testigo (agua destilada estéril), que presentó el porcentaje más alto de la eclosión de huevos del fitonematodo en los tres tiempos de evaluación (Tabla 2). Este hecho manifestó que los filtrados fúngicos de Trichoderma afectaron, negativamente, la viabilidad de los huevos del fitonematodo. Por lo que el efecto de inhibición se detectó a partir de las primeras 72 h, lo que significó igualdad de tratamientos de 40 filtrados, con más del 98,03 % de efectividad sobre este parámetro de estimación (Scott & Knott, p≤0,05). A las 96 h de exposición, solamente 33 filtrados fúngicos lograron mantener hasta 94,17 % de efectividad. Los resultados a las 120 h permitieron establecer criterios de selección de 33 aislados nativos de Trichoderma spp. en su capacidad de evitar, al menos, hasta 93,30 % de inhibición sobre la eclosión de huevos de M. incognita.

TABLA 2 Inhibición de la eclosión de huevos en M. incognita por efecto de los filtrados fúngicos de aislados mexicanos de Trichoderma spp. en diferentes tiempos de exposición / Inhibition of hatching of eggs in M. incognita by the effect of the fungal filtrates of Trichoderma spp. at different exposure times 

Tiempo de exposición (h)
Aislados 72 96 120
Inhibición de la eclosión de huevos*%
Th02-04, Th36-60, Th03-05 100a 100a 100a
Th01-01, Th35-70, Th13-20 100a 100a 100a
Th01-02, Th30-66, Th14-21 100a 100a 100a
Th09-13, Th18-63, Th11-D110 100a 100a 100a
Th12-B85, Th22-43, Th19-32 100a 100a 100a
Th23-68, Th04-07, Th06-B6 100a 100a 100a
Th06-71 100a 100a 100a
Th10-D86 100a 100a 100a
Th35-67 100a 100a 100a
Th38-61 100a 100a 100a
Th16-A94, Th33-59 100a 100a 100a
Th40-62, Th33-37 100a 96,67a 96,67a
Th21-41 100a 95,00a 95,00a
Th29-55 100a 94,74a 93,30a
Th26-52 100a 94,17a 94,17a
Th20-35 100a 92,11b 92,11b
Th29-54 100a 89,17b 89,17b
Th26-53, Th33-58 100a 88,82b 85,83b
Th16-C107 100a 88,82b 87,50b
Th32-56 100a 87,50b 84,17b
Th16-D106 100a 85,00b 78,29c
Th05-07 99,17a 99,17a 99,17a
Th16-B92 98,34a 98,34a 98,34a
Th09-12, Th25-68 98,03a 98,03a 98,03a
Th18-30 79,41b 79,41b 79,41c
Testigo (ADE) 0,00c 0,00c 0,00d

Nota: medias con igual literal, en una misma columna, no difieren estadísticamente (Scott & Knott p≤0,05), ADE: agua destilada estéril, *Porcentaje de inhibición en la eclosión de 50 huevos de M. incognita.

A las 120 h se evidenció la capacidad inhibitoria sobre la eclosión de huevo de, al menos, 33 filtrados fúngicos de Trichoderma, procedentes de suelo con y sin uso agrícola, al inhibirla eclosión de huevos de M. incognita del 94,74 al 100 %; este parámetro de estimación se considera fundamental en pruebas de control de nematodos agalladores, ya que representa la capacidad reproductora del nematodo, lo que podría traducirse en una disminución importante de este fitoparásito para condiciones de campo.

Estudios similares realizados por Algarate et al. (17) y Dávila y Clímaco (18) evidenciaron el efecto inhibitorio de especies nativas de Trichoderma spp., Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare y Gams, Arthrobotrys sp. y Paecilomyces sp. Samson (106conidias x ml-1) cuando se expusieron huevos de Meloidogyne sp. 24, 48 y 72 h. Mientras que, en un estudio de micoparasitismo con especies de Trichoderma, T. atroviride P. Karst, T. harzianum Rifai y T. viride Pers., se observó el crecimiento de hifas y la destrucción completa de huevos de M. incognita raza 2 después de las 72 h en condiciones de laboratorio (4,19). También Cardona et al. (20), con la concentración de 100 % de filtrado crudo de Purpureocillium sp. (Cepa UdeA0106), lograron mantener baja la eclosión de huevos de este fitonematodo a partir de las 24 h y, de igual manera, observaron vacuolas alteradas, las cuales asociaron con la deformación de este estadio.

El efecto inhibitorio en la eclosión de huevos debe estar relacionado con enzimas hidrolíticas, ya que estudios in vitro demostraron que las especies de Trichoderma parasitan las capas de vitelina, quitina y lípidos que protegen al embrión del huevo, cuyo efecto micoparasitario se debe al incremento en la actividad de enzimas como quitinasas y proteasas (4,11).

Efecto de los filtrados de Trichoderma spp. contra juveniles (J 2 ) de M. incognita

Se mostraron diferencias significativas (p≤0,001) en el efecto de 41 filtrados fúngicos de Trichoderma spp., aislados de suelos con y sin uso agrícola, sobre el porcentaje de mortalidad.

Los filtrados de hongos benéficos se agruparon de acuerdo a la separación de las medias. Los resultados a las 24 h de evaluación se mostraron de la siguiente manera: el primer grupo se conformó por 12 aislados de Trichoderma spp., estadísticamente iguales (Scott & Knott, p≤0,05) que lograron inducir un efecto de inmovilidad con valores que oscilaron de 91,38 a 97,41 % de la inactividad en J2 de M. incognita; le siguió un grupo de nueve aislados con 83,62 a 89,66 % de efectividad sobre este parámetro de estimación; por debajo de estos se encontraron ocho aislados de los hongos que lograron, al menos, hasta 59,48 % de inmovilidad; finalmente, el resto de los filtrados fúngicos indujo los valores menores a 16,38 %. En el tratamiento testigo (agua destilada estéril) se observó el porcentaje más alto de movilidad en los J2 del nematodo agallador, lo que confirmó la viabilidad de estos. Transcurridas 48 h de exposición de filtrados fúngicos, ocho aislados conformaron el primer grupo, que causaron la inmovilidad de J2 con rangos que oscilaron de 97,41 a 100 % de efectividad (Scott & Knott, p≤0,05). El segundo y el tercer grupo, con 11 y ocho registros de filtrados fúngicos, obtuvieron sobre este parámetro de estimación hasta 93, 10 y 90,50 % de efectividad, respectivamente. Por último, el cuarto grupo lo representó el aislado Th13-20 con 81,03 % de inactividad de J2 en M. incognita (Tabla 3).

TABLA 3 Inmovilidad y mortalidad de juveniles del segundo estadio (J2) de M. incognita por efecto de los filtrados fúngicos de Trichoderma spp. a diferentes tiempos de exposición / Mortality of juveniles of the second stage (J 2 ) of M. incognita by the effect of the filtrates of Trichoderma spp. at different exposure times. 

Aislados Tiempo de exposición (h)
24 48 24
Inmovilidad % Reversibilidad* %
Th33-58 97,41a 97,41a 0,00a
Th40-62 97,41a 100a 66,38e
Th26-52 96,55a 96,55b 0,00a
Th25-68 94,83a 95,69b 0,00a
Th01-02 94,83a 98,27a 0,00a
Th02-04 94,83a 96,55b 0,00a
Th33-57 93,11a 93,10b 0,00a
Th35-70 93,11a 93,96b 0,00a
Th10-D86 93,11a 95,69b 0,00a
Th33-59 93,11a 97,41a 0,00a
Th22-43 93,11a 98,27a 3,45a
Th20-35 91,38a 95,69b 29,31c
Th32-56 89,66b 89,66c 0,00a
Th29-54 89,66b 94,83b 51,72d
Th30-66 88,79b 88,79c 0,00a
Th21-41 88,79b 93,96b 3,45a
Th26-53 87,07b 98,27a 5,18a
Th23-68 87,07b 86,21c 0,00a
Th16-C107 85,35b 90,5c 6,90a
Th14-21 85,34b 93,1b 0,00a
Th03-05 83,62b 84,48c 0,00a
Th12-B85 78,45c 87,9c 0,00a
Th29-55 71,55c 87,93c 41,38d
Th06-B6 67,24c 86,21c 46,56d
Th09-13 66,38c 86,21c 0,00a
Th35-67 66,38c 94,83b 7,76a
Th16-A94 63,79c 75,00e 82,76f
Th38-61 63,79c 100a 14,66b
Th09-12 59,48c 71,55e 20,69b
Th36-60 56,03d 93,1b 0,00a
Th13-20 54,31d 81,03d 60,35e
Th11-D110 47,41e 99,14a 18,10b
Th06-71 44,83e 50,86f 45,69d
Th01-01 44,83e 89,66c 63,80e
Th19-32 39,65e 51,72f 0,00a
Th16-B92 38,79e 50,86f 26,73c
Th18-63 22,41f 43,1g 50,00d
Th16-D106 16,38f 42,24g 93,97g
Th05-07 3,45g 51,72f 50,86d
Th18-30 0,00g 13,79i 59,49e
Th04-07 0,00g 20,69h 75,86f
Testigo (ADE) 0,00g 0,00i 0,00g

Nota: Medias con la misma literal dentro de columnas son iguales (Scott & Knott, p≤0,05), ADE: agua destilada estéril, *Porcentaje de recuperación de la movilidad o la mortalidad de 50 J2 de M. incognita

Los resultados del ensayo de la prueba de reversibilidad, después de 24 h sin exposición a los filtrados fúngicos, agruparon a los aislamientos en cinco grupos. El primero incluyó 23 filtrados, estadísticamente iguales (Scott & Knott, p≤0,05) con efecto nematicida de al menos el 92,24 % de mortalidad en los J2 de M. incognita; le siguieron en efectividad los grupos 2 y 3, con tres filtrados cada uno, con 81,90 a 85,34 y de 70,69 a 73,27 % de mortalidad sobre este parámetro de estimación. El resto de los grupos presentaron de 26,73 a 93,97 % de reversibilidad, después de retirar el filtrado y adicionar agua destilada. Estos resultados permitieron establecer un criterio para seleccionar aislados de Trichoderma promisorios para futuras investigaciones de control del nematodo. (Tabla 3)

En este estudio se confirmó que el origen de los filtrados fúngicos no influyó en el potencial efecto biológico de los mismos para disminuir la reproducción del nematodo agallador cuando provocaron inhibición de la eclosión de huevos. También, se demostró que la consecuencia del biocontrol de fitoparásitos por el género de Trichoderma depende más del tipo de sustrato como medio de cultivo que de la propia especie (19). En ensayos similares, el efecto potencial de los filtrados fúngicos de Arthrobotrys sp. Y Paecylomices sp. mostraron actividad nematicida contra J2 de poblaciones de M. incognita (18). Xalxo et al. (21) informaron un efecto in vitro de filtrados de T. viride de 65 a 93,75 % de mortalidad en J2 de Meloidogyne spp. Estos efectos encontraron Pinzón et al. (10) y Candelero et al. (14) al obtener 100 % de mortalidad en los J2 de este nematodo en las primeras 24 h de exposición de 14 filtrados fúngicos de Trichoderma provenientes de patosistemas silvestres. Asimismo, se confirmó en estudios in vitro que, a las 24 h de exposición de los filtrados toxigénicos de T. asperellum (cepa Ta. 90) en dilución 1/50, causó la mortalidad de J2 de M. incognita hasta 90 % (4); esta cepa produjo quitinasas y β-1,3-glucanasas, enzimas relacionadas con la hidrólisis de la cutícula en los fitopatógenos incapaces de sintetizarlas durante su establecimiento (11,17). También, esta actividad inhibitoria de los filtrados se le ha atribuido a los metabolitos secundarios que actúan como nematicidas y que se han reportado en T. harzianum son: tricotecenos, trichodermina, suzukacilina, alameticina, dermadina, penicilina, trichotecenosa y tricorzinianos (12).

CONCLUSIONES

De los 41 filtrados fúngicos de Trichoderma, se confirmó que el origen de 33 aislados de suelos, con y sin uso agrícola, no influyó en su actividad contra la inhibición de la eclosión de huevos, la motilidad ni la mortalidad sobre J2 de Meloidogyne incognita.

El origen de 23 aislados fúngicos de Trichoderma no determinó el efecto nematicida sobre J2 del fitonematodo agallador, después de evaluar el efecto de reversibilidad a las 48 h.

Se demuestra que las especies nativas de Trichoderma son agentes potenciales para emplearse como agente biocontrol del fitonematodo agallador.

Se sugiere realizar pruebas más contundentes in vitro que demuestren los mecanismos que inducen la inhibición de la eclosión de huevos, la mortalidad de juveniles del segundo estadio (J2) de M. incognita y la efectividad biocontroladora en plantaciones comerciales.

REFERENCIAS

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Recibido: 24 de Mayo de 2017; Aprobado: 18 de Enero de 2018

*Autor para correspondencia: Juan Candelero-de la Cruz. Email: candelerocruz@hotmail.com

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