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Los miembros del complejo Rhizoctonia constituyen un grupo heterogéneo de hongos filamentosos que no producen esporas asexuales, pero comparten caracteres morfológicos generales, como la formación de micelio estéril y las estructuras de resistencia denominadas esclerocios (1). Tienen una amplia distribución mundial y es poco probable que exista un país donde no estén presentes. Poseen una amplia gama de hospedantes, al afectar a más de quinientos géneros de plantas superiores, muchos son patógenos importantes de plantas de interés agrícola, forestal, e incluso de especies acuáticas. En posturas, provocan la enfermedad conocida como damping off, lesiones necróticas en raíces, semillas, tallos y, en algunos casos, en frutos; por consiguiente, traen considerables pérdidas (2). Otros tienen un comportamiento saprofítico y simbionte en especies de orquídeas y musgos (3).
La identificación de las especies dentro del grupo es difícil, ya que tienen pocos caracteres morfológicos y los rasgos fisiológicos y patogénicos varían de un individuo a otro; por lo que su diferenciación se realiza, fundamentalmente, por el número de núcleos y la anastomosis hifal (AG), determinada por la fusión de las células de dos aislamientos (4). En este sentido, los primeros estudios para estos grupos se informaron en las primeras décadas del siglo pasado por Matsumoto en 1921 y Matsumoto et al. en 1931, citados por González (1), aplicable tanto a especies multinucleadas como binucleadas.
Dentro del complejo causal, hasta la fecha, se conocen 14 AG de R. solani, que se subdividen en subgrupos, nominados del AG1 al AG13, los cuales, de forma general, solo son compatibles con individuos del mismo grupo, aunque el AG-BI incluye aislados capaces de fusionarse entre ellos y con otros grupos (5). Según Chávez Barragán et al. (6), los grupos de anastomosis de R. solani tienen importancia para el control de los mismos, ya que tienen diferente sensibilidad a la aplicación de químicos. Los grupos AG-2.1, AG-5 y AG-8 de R. solani tienen importancia por ser patógenos de diferentes cultivos y entre estos algunos de importancia económica (2). En Cuba, se han informado distintas especies dentro del complejo, correspondientes al género Ceratorhiza (teleomorfo: Ceratobasidium spp., binucleadas) y a R. solani (teleomorfo: Thanatephorus cucumeris, multinucleadas). Dentro de este último, se encontraron los grupos AG-3, AG-5, AG-2-2IIIB, AG-4HGIII y AG4HGI (7).
El manejo de este hongo es difícil, aun cuando se usan diferentes tácticas para su control. Entre ellas, la aplicación de agroquímicos es fundamental, a pesar de lo costoso y perjudicial que es al medio ambiente. Debido a esto, se ha hecho necesaria la búsqueda e introducción de nuevas alternativas de manejo amigables con el medio. En concordancia con esto, en la actualidad se investigan cepas de Trichoderma spp. con diferentes mecanismos de acción directa (competencia por sustrato o espacio, antibiosis y el micoparasitismo), que pueden incorporarse al manejo de este fitopatógeno (8). Además, estas cepas podrían tener mecanismos de acción indirecta: estimulantes del crecimiento y desarrollo de las plantas, inductoras de resistencia y de incrementar la tolerancia de la planta ante diferentes estreses (9).
El laboratorio de Micología Vegetal del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) dispone de un grupo de cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg, identificadas y caracterizadas morfofisiológica, patogénica y molecularmente, que se destacan por su acción biorreguladora sobre diversos agentes causales de enfermedades en arroz (Oryza sativa L.), frijol (Phaseolus vulgaris L.) y soya (Glycine max L. Merr.) (10,11,12).
Por lo antes expuesto, el presente trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto antagónico in vitro de siete cepas de T. asperellum frente a aislamientos de los grupos anastomósicos de R. solani AG-2.1, AG-5 y AG-8.
El trabajo se realizó en el Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (Langebio) de Guanajuato, México.
Las cepas Ta.1, Ta.13, Ta.17, Ta.75, Ta.78, Ta.85 y Ta.90 de T. asperellum, pertenecientes a la colección de hongos del laboratorio de Micología Vegetal del CENSA, se conservaron en placas Petri (90 mm = Ø) contentivas de Agar Malta (AM) (Biocen) e incubadas a temperatura de 28°C±2°C y oscuridad. Mientras que, los aislados de los tres grupos anastomósicos de R. solani (AG- 2.1, AG-5 y AG-8), pertenecientes a la colección del Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (Langebio) de Guanajuato, México, se conservaron en Papa Dextrosa Agar (PDA) (Difco), a temperatura de 25°C±2°C y oscuridad.
Para la realización de los experimentos, los cultivos de las cepas del antagonista y de los aislados del patógeno tenían tres y siete días de edad, respectivamente. Se tomaron discos de cinco mm de Ø de estos de la periferia de las colonias para ambos ensayos.
Antagonismo in vitro de las cepas de T. asperellum frente a aislamientos de tres grupos anastomósicos de R. solani
El efecto antagónico de las cepas de T. asperellum se evaluó por el método del cultivo dual (CD), según lo descrito por Martínez y Solano (13), frente a los grupos de anastomosis de R. solani AG-2.1; AG-5 y AG-8. Se determinaron la competencia por espacio y el micoparasitismo.
Competencia por espacio
Se sembraron discos (5 mm de Ø) de las cepas de T. asperellum y de los aislados del patógeno, diametralmente opuestos a cinco mm del borde de la periferia de la placa Petri (90 mm = Ø), contentivas de medio PDA (Difco). Las placas se incubaron a 25°C±2°C y oscuridad, condiciones requeridas para el crecimiento de los aislados del patógeno. Se realizaron tres réplicas por cepa de T. asperellum y se incluyó un control de cada aislamiento de los grupos anastomósicos; estos se sembraron en la misma posición que en el CD (sin el antagonista) y se incubaron en igual condición a la anteriormente descrita. Las evaluaciones se hicieron a partir de las 24 h, dos veces al día (8:00 am y 4:00 pm). Se midió el crecimiento micelial lineal de ambos hongos con una regla graduada, hasta que uno de los dos completara el área de la placa. La capacidad antagónica de T. asperellum se valoró mediante la escala de grados de Bell et al. (14).
Micoparasitismo
Para evaluar el efecto parasítico se sembraron discos de cinco mm de Ø de los patógenos antes mencionados en placas Petri (70 mm = Ø) contentivas de PDA (Difco), las que se incubaron a una temperatura de 25°C±2°C y oscuridad, y se dejaron crecer hasta completar el área total de la placa. Posteriormente, se depositaron discos de igual Ø de las cepas de T. asperellum sobre la colonia desarrollada de cada aislamiento del patógeno; se incubaron a una temperatura de 28°C±2°C y oscuridad. Se realizaron dos réplicas para cada cepa de Trichoderma.
El parasitismo de las cepas de T. asperellum (sobrecrecimiento sobre el patógeno) se evaluó a los cinco días de la siembra del antagonista; para esto se evaluó el área ocupada por este sobre el patógeno, tomando como base la siguiente escala (Tabla 1) que se describe a continuación:
Tabla 1 Escala de grados para la evaluación del parasitismo de las cepas de T. asperellum sobre R. solani.Degree scale to evaluate parasitism of the strains of T. asperellum on R. solani
| Grados | Descripción |
|---|---|
| - | Trichoderma sobrecrece más de 75 % del área del patógeno. |
| - | Trichoderma se desarrolla entre 51-74 % del área del patógeno. |
| 3 | Trichoderma se desarrolla entre 25 y 50 % del área del patógeno. |
| - | Trichoderma se desarrolla 25 % o menos del área del patógeno. |
| - | Trichoderma no crece sobre el patógeno (no hubo parasitismo). |
Las cepas ubicadas en los grados 1 y 2 de la escala se consideraron de alto grado parasítico. En cada uno de los casos, se tomaron imágenes como evidencia gráfica con cámara digital (Canon).
Antagonismo in vitro de las cepas de T. asperellum frente a aislamientos de tres grupos anastomósicos de R. solani
Competencia por espacio
Las siete cepas de T. asperellum tuvieron un crecimiento más rápido que los aislamientos del patógeno; a las 96 h cubrieron el área total de la placa, por lo que se ubicaron en la clase 1 de la escala de Bell et al. (14). Además, se pudo evidenciar esporulación de las cepas de T. asperellum sobre la colonia de los aislados del patógeno, que afectó su textura y formación de esclerocios (Fig. 1). Esto contribuyó a frenar el crecimiento de los patógenos al compararse con los controles, donde los aislados de los grupos anastomósicos crecieron completamente el área de la placa y hubo presencia de esclerocios.
Figura 1 A. Cultivo dual de T. asperellum (Ta.17) - R. solani (AG-5) y B. Control de R. solani (AG-5) a las 96 h / A. Dual culture of T. asperellum (Ta.17) - R. solani (AG-5) and B. Control of R. solani (AG-5) at 96 h
En todos los casos evaluados se evidenció incremento del área colonizada por T. asperellum en el tiempo, comparado con el de los aislados del patógeno; resultados que coinciden con los obtenidos por Siameto et al. (15) y Ahmad et al. (16). Estos autores evidenciaron que las cepas de Trichoderma harzianum Rifai, en condiciones de cultivos duales, crecieron considerablemente más rápido que los patógenos en estudio. También, Caballero et al. (17) informaron que Trichoderma spp. compite por espacio y nutrientes generando un efecto indirecto de reducción del crecimiento radial del patógeno, al ocupar su espacio y extraer los suministros de nutrientes. Sin embargo, difieren de los de Hoyos-Carvajal et al. (18), quienes observaron que, en los primeros tres a cinco días, Trichoderma tuvo menor crecimiento que R. solani, aunque no especificaron a cuál grupo anastomósico pertenecía dicho aislamiento. No obstante, el antagonista logró crecer y esporular sobre la colonia del patógeno al noveno día.
Los resultados del estudio concuerdan con los obtenidos por diferentes autores, quienes encontraron crecimiento de Trichoderma encima de las colonias del patógeno, ubicándose en el grado 1 de la escala. En este sentido, Bell et al. (14) informaron grado 1 para diferentes aislados de Trichoderma spp. frente a los grupos AG-3 y AG-2 de R. solani. También, Reyes et al. (19) ubicaron a más de 47 aislados de Trichoderma spp. en la clase 1 y 2 de la Escala de grado, lo que expresa el gran potencial de competencia de estos antagonistas, dado fundamentalmente por su alta velocidad de crecimiento, superior a la del patógeno. Estos autores encontraron, además, que todos los aislados de Trichoderma spp. manifestaron inhibición de Rizoctonia a las 96 h, momento en que Trichoderma había colonizado el área ocupada por el patógeno. Más recientemente, Sánchez-García et al. (20) informaron grado 1 para el enfrentamiento entre Trichoderma y R. solani.
Lo anterior permite plantear que el antagonismo entre microorganismos dependerá de la acción del antagonista, producción de enzimas extracelulares, correspondientes a la composición y estructura de las paredes celulares de los hongos parasitados.
La competencia por el sustrato, como modo de acción antagónico en Trichoderma, es un elemento a considerar, ya que al colonizar con mayor rapidez la zona de la rizosfera y los espacios de suelo, en general, limita la proliferación del hongo patógeno (21,22).
Micoparasitismo
Las cepas de Trichoderma mostraron diferencias en su capacidad de sobrecrecer sobre cada aislado de los grupos de anastomosis de Rhizoctonia (Fig. 2); el grupo AG-5 fue el más afectado. Se destacan con más de 75 % de sobrecrecimiento (parasitismo) sobre el área de las colonias del patógeno, las cepas Ta.13 frente a AG-2.1; Ta.17, Ta.75, Ta.78, y Ta.90 frente a AG-5. También, las cepas con grado 2 se consideran con buen parasitismo (entre 51-74 % del área del patógeno). De manera general, el aislado del grupo AG-8 fue el que tuvo menor área parasitada por las cepas de T. asperellum; no obstante, se debe destacar que Ta.85 sobrecreció en más de 75 % del área del aislado, Ta.17 más de 50 % y Ta.90 50 % del área ocupada por el patógeno (Tabla 2).
En este trabajo se evidenció la variabilidad y la alta especificidad de Trichoderma por su hospedante. Por otro lado, se demostró que el antagonista es altamente selectivo, difiriendo inclusive en su efectividad biocontroladora, aun siendo de la misma especie. Estos resultados son similares a los obtenidos por Hoyos-Carvajal et al. (18), quienes observaron efectivo control de R. solani con la cepa T-109 de T. asperellum, pero no con la T-71 de esta misma especie.
Una razón de estos fenómenos de especificidad pueden ser las interacciones bioquímicas entre hongos. En sus estudios, Elad et al. (1983) y Goldman et al. (1994), citados por Hoyos-Carvajal et al. (18), aislaron una lectina de las hifas y del filtrado del cultivo en medio líquido de R. solani, y una galactosa de las paredes de la célula de Trichoderma spp., proveniente de la aglutinación de esta lectina. De ambos estudios se pudo concluir que la lectina presente en las hifas de R. solani se une a los residuos de galactosa en las paredes de la célula de Trichoderma spp. y da inicio a la acción micoparasítica sobre el fitopatógeno.
El micoparasitismo causado por Trichoderma se inicia cuando las hifas de Trichoderma entran en contacto con las del hospedante y se forman apresorios relacionados con la penetración en la célula de este último. En la mayoría de los casos las paredes celulares se degradan por enzimas y esto depende más del aislamiento que de la propia especie. El micoparasitismo culmina con la pérdida del contenido citoplasmático de la célula hospedante, donde el citoplasma restante está rodeando a las hifas invasoras y se muestran síntomas de disgregación (23). Los cambios estructurales visibles (desintegración) en las colonias de los grupos de anastomosis de R. solani, por la acción de las cepas de T. asperellum, pudieran atribuirse a la acción de metabolitos antifúngicos y enzimas hidrolíticas excretadas por el antagonista al medio, las que actúan debilitando las paredes del patógeno y provocan su desintegración, aspecto que se evidencia en el presente ensayo.
Figura 2 Parasitismo de las cepas de T. asperellum sobre los grupos de anastomosis de R. solani. A) Grupos de anastomosis sin Trichoderma. B) Sobrecrecimiento de las colonias de T. asperellum sobre las colonias de los aislados de los grupos de anastomosis de R. solani / Parasitism of the T. asperellum strains against anastomosis groups of R. solani. A) Anastomosis groups without Trichoderma. B) Growth of the T. asperellum colonies on colonies of anastomosis group isolates of R. solani
Tabla 2 Parasitismo de las cepas de T. asperellum sobre los aislados de los grupos anastomósicos de R. solani / Parasitism of T. asperellum strains against anastomosis group isolates of R. solani
| Cepas de T. asperellum | Grados según la escala | ||
|---|---|---|---|
| Grupos anastomósicos de R. solani | |||
| AG-2.1 | AG-5 | AG-8 | |
| Ta. 1 | 2 | 2 | 3 |
| Ta. 13 | 1 | 2 | 4 |
| Ta. 17 | 3 | 1 | 2 |
| Ta. 75 | 3 | 1 | 3 |
| Ta. 78 | 3 | 1 | 3 |
| Ta. 85 | 2 | 3 | 1 |
| Ta. 90 | 2 | 1 | 3 |
A pesar de que existe abundante información acerca de la acción biorreguladora de las especies de Trichoderma sobre varios hongos fitopatógenos (24), en la práctica es fundamental realizar una selección exhaustiva del agente controlador frente a cada patógeno diana, antes de ser usado en condiciones de campo (24).
El estudio in vitro de los modos de acción presentes en los aislamientos del biorregulador constituye la base de la selección de estos para lograr mayor estabilidad y eficacia en los resultados de campo.
