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INTRODUCCIÓN
El picudo negro (Cosmopolites sordidus (Germar) es la principal plaga insectil que afecta bananos y plátanos (Musa spp.) en el mundo. Las larvas forman galerías en el cormo, interrumpen el transporte de agua y nutrientes, por lo que debilitan las plantas y las hacen más susceptibles a la entrada de otros patógenos, lo que conduce a una baja productividad y al acortamiento de la vida útil de las plantaciones (1,2).
En Cuba, se informó su presencia en 1944; posteriormente se distribuyó a todo el territorio nacional resultando la plaga de insectos más dañina de estos cultivos (3). Estudios efectuados por diversos autores en el país informaron pérdidas estimadas entre 19 y 34 % (4,5,6).
Este insecto es multivoltino (que efectúa varias generaciones al año), bastante fecundo y longevo; sin embargo, las poblaciones en campo se incrementan lentamente debido a que la ovoposición es relativamente infrecuente, por ello, la introducción de factores que produzcan mortalidad en los adultos conduce a un adecuado manejo de la población (7). Es una plaga difícil de controlar, pues habita en ambientes protegidos como las galerías de los cormos (2); por ello, su manejo incluye prácticas culturales, el uso de semilla (cormo) sana, endófitos, genotipos resistentes, agentes de control biológico, productos botánicos y, como última opción, el uso de plaguicidas químicos, pues estos productos aumentan el costo de producción y provocan daños ambientales (8).
Los nematodos entomopatógenos de los géneros Heterorhabditis (Poinar) y Steinernema (Travassos) representan agentes de control biológico de diversas plagas agrícolas a nivel mundial. Poseen una relación mutualista con sus bacterias simbiontes de los géneros Photorhabdus y Xenorhabdus, respectivamente, que propician la muerte del insecto y las condiciones para la nutrición del nematodo dentro del cadáver (9). Su fase infectiva (juveniles infectivos) presenta atributos de parasitoides, pues son móviles y poseen quimiorreceptores y características de patógenos microbianos, son altamente virulentos, se pueden reproducir en medios de cultivos y matan rápidamente a los hospedantes (10).
En diversas partes del mundo, numerosos investigadores evaluaron la susceptibilidad de C. sordidus a cepas nativas e importadas de nematodos entomopatógenos, en condiciones de laboratorio y campo, y demostraron las potencialidades de estos organismos para el manejo de la plaga (11,12,13).
En Cuba, el uso de nematodos entomopatógenos está generalizado; Heterorhabditis amazonensis Andaló et al. cepa HC1 (secuencia depositada en GenBanck: BankIt1899363 Hamaz_HC1 KU870321) se reproduce en más de tres decenas de laboratorios (14), por lo que puede constituir una alternativa para el manejo del picudo negro en plantaciones de plátano y banano. Sin embargo, resulta necesario determinar la susceptibilidad de los adultos de C. sordidus a esta cepa, como parte de los estudios encaminados al uso del biorregulador en campo para disminuir las poblaciones de adultos. El objetivo de este estudio fue determinar la susceptibilidad de adultos del picudo negro (C. sordidus) a los juveniles infectivos (JI) de H. amazonenesis (cepa HC1) in vitro.
MATERIALES Y MÉTODOS
El estudio se efectuó en el Laboratorio de Nematología Agrícola del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) (230 longitud norte y 820 de longitud oeste), entre los meses de octubre a noviembre de 2017.
Los adultos de C. sordidus se colectaron en zonas de producción de bananos y plátanos, que no habían recibido tratamiento químico o biológico, ubicadas en el municipio Nueva Paz (22°46'49.5 N; 81°45'00.4 O; 25 m.s.n.m), provincia Mayabeque, Cuba. Para la captura se utilizaron dos tipos de trampas, sándwich (en plantas que se derribaron, luego de la cosecha) y de disco modificada; en esta última se hicieron hendiduras a manera de cuadrículas en el pseudotallo de plantas que se habían cosechado. (Fig. 1)
Fig. 1 Trampas utilizadas para la captura de adultos de picudo negro (C. sordidus) en zonas de producción de la región occidental de Cuba / Traps used to capture black weevil (C. sordidus) adults in production areas of the western region of Cuba
Los picudos adultos colectados, en las primeras horas de la mañana, se trasladaron al Laboratorio de Nematología Agrícola del CENSA en frascos de cristal que contenían fragmentos de pseudotallo. En el laboratorio se mantuvieron en insectarios, a temperatura ambiente y fotoperiodo natural, con alimento fresco por un periodo de un mes (cuarentena), para comprobar que no estaban infectados por patógenos.
Para el ensayo se tomaron los individuos con talla homogénea y a 10 individuos se les calculó talla (regla graduada) y masa (balanza KERN); se determinó que tenían 1,3 cm de envergadura y 0,093 mg como promedio.
Se utilizaron juveniles infectivos (JI) de H. amazonensis cepa HC1 con menos de un mes de obtenidos, que se produjeron en el laboratorio por el método in vivo, utilizando larvas del último instar de G. mellonella, mediante la metodología de Sánchez et al. (15) y con los sustratos descritos por Enrique et al (16).
Para determinar la concentración de nematodos en la solución y el cálculo de las dosis, se empleó el método de las diluciones descrito por Glazer y Lewis (17). Para este ensayo se utilizaron placas Petri de 9 cm de diámetro, a las cuales se les colocó papel de filtro. Los insectos se inocularon con cinco tratamientos, en correspondencia con cinco concentraciones (125, 250, 500, 2500, 5000 JI.ml-1) de juveniles infectivos de la cepa HC1 de H. amazonensis por cada placa.
Para cada dosis se utilizaron tres réplicas (placas con cinco insectos adultos cada una) (unidades experimentales) y un control absoluto al cual se le aplicó agua destilada estéril (igual volumen de agua que los tratados). Posteriormente, se les colocaron trocitos de pseudotallo de 1 cm2 como alimento, los que se cambiaron regularmente si era necesario. Las placas se sellaron con Parafilm® para evitar el escape de los adultos y se incubaron a 27ºC y oscuridad en incubadora (Friocell). El diseño fue completamente al azar.
Se registró el número de adultos muertos cada 12 horas hasta los 15 días; posteriormente, a los 21 días, momento en que concluyó el experimento.
Para comprobar la muerte de los insectos, estos se estimularon en el abdomen con una aguja de punta roma; cuando no mostraron movimiento se consideraron muertos. El ensayo se repitió dos veces y los valores que se exponen corresponden con el primero. Los cadáveres de los adultos se colocaron en placas individuales con papel de filtro humedecido ligeramente y a los 4-5 días, posteriores a la muerte, se les realizó una disección, utilizando pinzas y agujas en placas con agua destilada, bajo un microscopio estereoscopio (Zeiss) para ver si poseían nematodos en su interior.
Se describieron los síntomas de los cadáveres y se determinaron los valores de Dosis Letal media (DL50), Dosis Letal a 90 % (DL90), Tiempo Letal medio (TL50) y Tiempo Letal a 90 % (TL90) mediante análisis Probit. Los porcentajes de mortalidad se trasformaron en arcsen√% y se compararon mediante un análisis de varianza seguido de la prueba de rangos múltiples de Duncan (p≤0,05). Se realizó un análisis de regresión entre la dosis de aplicación y el porcentaje de mortalidad. Para los análisis estadísticos se utilizó el paquete estadístico SPSS21.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los adultos de picudo negro parasitados evidenciaron menor consumo de alimento y disminuyeron su movimiento; mientras que, una vez muertos, no presentaron cambio de coloración ni flacidez, permanecieron rígidos y con las patas plegadas. (Fig. 2)
La Dosis Letal media (DL50) fue de 1 872 JI. ml-1; mientras que, la DL90 de la población se alcanza, según los cálculos, a una concentración mayor que la empleada en el estudio. Se evidenció que el tiempo requerido para ocasionar la muerte al 50 % de la población fue de unos 17 días y se estimó que la muerte de 90 % de los individuos se produciría a los 29 días en el tratamiento con la mayor concentración. (Tabla 1)
Cuando se analizaron los adultos muertos, se pudo constatar la presencia de hembras hermafroditas dentro de los cadáveres (Fig. 2), en las zonas cercanas a las patas del insecto; mientras que, en el abdomen y la cabeza se encontraron huevos y otros estadios del nematodo (J1, J2, J3, JI J4, hembras y machos). Los nematodos se encontraban vivos y con buena movilidad. Esto evidencia varias generaciones dentro del insecto.
Fig. 2 A) Cadáver de adulto de C. sordidus muerto por el efecto de H. amazonenesis cepa HC1. B) Hembras hermafroditas de H. amazonensis cepa HC1, emergiendo de zona cercana a las patas de un cadáver de un adulto de picudo negro del plátano, tratado en ensayo de laboratorio (in vitro) / Cadaver adult of C. sordidus killed by the effect of H. amazonenesis strain HC1. B) Hermaphrodite females of H. amazonensis strain HC1, emerging from the area near the legs of a corpse of an adult of the black banana weevil , treated in a laboratory test (in vitro)
Los valores de mortalidad de los picudos difirieron estadísticamente entre el control (sin aplicación de nematodos) y los tratados, con una relación mortalidad-concentración superior a 70 % (R2= 0,780); con valores de mortalidad en los tratados superiores al 40 % y más de 87 % de mortalidad en el tratamiento con mayor concentración de JI. En el tratamiento control se produjo mortalidad por debajo del 15 %. (Fig. 3)
La cepa HC1 de H. amazonenesis provocó altos porcentajes de mortalidad en adultos de picudo en comparación con otra de la misma especie evaluada por Amador et al. (12), pues en el estudio desarrollado por esos autores, H. amazonenesis aislado RSC 05 solo causó 16, 7 % de mortalidad en los adultos de C. sordidus, lo que sugiere que la cepa cubana es más efectiva que otras de la misma especie para el manejo de C. sordidus. Rosales y Suárez (18) señalaron, sobre la base de sus resultados, que existen factores intrínsecos de cada cepa que, aun perteneciendo a la misma especie, difieren en su capacidad infectiva.
Tabla 1 Valores de Dosis letales (50 y 90 %) y Tiempos letales (50 y 90 %) de la cepa HC1 (H. amazonensis) sobre adultos de C. sordidus, calculados en estudio de laboratorio, donde se aplicaron los JI a adultos de picudo en placas Petri /Lethal dosage values (50 and 90 %) and Lethal times (50 and 90 %) of the HC1 strain (H. amazonensis) on adults of C. sordidus, calculated in a laboratory study, where IJ were applied to weevil adults in Petri dishes
| Dosis letal (número de JI) | Tiempo letal (horas) | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Probabilidad | Límites de confianza al 95 % | Límites de confianza al 95 % | ||||
| Estimación | Límite inferior | Límite superior | Estimación | Límite inferior | Límite superior | |
| ,500 | 1872,366 | 816,781 | 3265,612 | 417,653 | 362,552 | 519,350 |
| ,550 | 2283,130 | 1292,318 | 3984,803 | 444,629 | 383,693 | 558,651 |
| ,600 | 2700,511 | 1709,664 | 4781,433 | 472,040 | 405,009 | 598,751 |
| ,650 | 3131,908 | 2093,658 | 5652,179 | 500,371 | 426,912 | 640,326 |
| ,700 | 3586,535 | 2464,735 | 6603,409 | 530,228 | 449,889 | 684,244 |
| ,750 | 4077,150 | 2840,635 | 7654,486 | 562,448 | 474,594 | 731,731 |
| ,800 | 4623,472 | 3240,232 | 8843,895 | 598,327 | 502,019 | 784,694 |
| ,850 | 5260,277 | 3690,098 | 10246,211 | 640,148 | 533,902 | 846,514 |
| ,900 | 6061,523 | 4241,096 | 12025,680 | 692,768 | 573,925 | 924,391 |
La mortalidad que se produjo en el control en este estudio, aunque baja, pudiera estar relacionada con la edad de los individuos que, al provenir de poblaciones de campo, no se conocen las edades específicas de los insectos; otro factor que pudiera incidir sería el estrés al que se someten los adultos al sacarlos de su medio natural.
Fig. 3 Porcentajes de mortalidad de adultos de C. sordidus, ocasionados por diferentes dosis JI de H. amazonensis cepa HC1 por ml aplicados in vitro / Percentages of mortality in vitro caused by different IJ dosage of H. amazonensis strain HC1 in adults of C. sordidusunder laboratory conditions
El análisis de la literatura internacional expuesto por Maniania et al. (19) sugirió que la susceptibilidad de los adultos de C. sordidus a nematodos entomopatógenos está relacionada con las cepas evaluadas y que, con frecuencia, es menor que la susceptibilidad de las larvas de este insecto.
Los adultos de C. sordidus no fueron susceptibles a Heterorhabditis atacamensis Edgington et al., cepa CIA-NE07 los que se mantuvieron vivos un mes después de recibir 40 JI del nematodo por cada adulto (en placas Petri) (12). De igual forma, Mwaniki (20) informó que los aislados de nematodos entomopatógenos (Steinernema weiseri Mracek et al., Steinernema yirgalemense Nguyen et al., Steinernema spp. y Steinernema carpocapsae Weiser) que evaluó en condiciones de laboratorio (placas Petri), causaron mortalidad en los adultos de C. sordidus cuando empleó concentraciones de 500, 750, 1000, 3000 y 5000 JI por adulto, en solo 96 horas en las que transcurrió el ensayo. En Tanzania se encontraron siete aislados de Steinernema (denominados MK1ASt, MK1BSt, MK4ASt, MK4BSt, MK7ASt, MW8ASt y MW8BSt) y dos de Heterorhabditis (MK7BHt y MK7CHt). Los aislados exhibieron la habilidad de infectar las larvas de C. sordidus; sin embargo, no afectaron, significativamente, a los adultos, los que fueron parasitados solo por los aislados (MK7ASt y MW8ASt- Steinernema y MK7BHt- Heterorhabditis). En el ensayo con larvas de C. sordidus, la mortalidad se incrementó, significativamente, con el incremento de la concentración de JI, lo que indica, según los autores, la importancia de las dosis (11).
Al respecto, señalaron Treverrow y Bedding (7) que los adultos del picudo del banano evidenciaron resistencia a los nematodos entomopatógenos, y que esa resistencia está más relacionada con la dificultad de los nematodos para entrar al interior del cuerpo del insecto que al éxito de la infección. En estudios realizados por estos autores, los adultos de C. sordidus que estaban alimentándose presentaron mayor mortalidad por la acción de los nematodos que los que no se alimentaron, pues mantenían activas la boca y el ano (para defecar), aperturas que usan para entrar los nematodos. En este ensayo, los picudos se mantuvieron con alimentación durante todo el tiempo, por lo que es posible que los nematodos utilizaran la boca y el ano para penetrar, debiéndose evaluar, en posteriores estudios si se produce entrada de JI por otras partes del cuerpo del insecto.
Sin embargo, cuando Bortoluzzi et al. (2) evaluaron 16 aislados de nematodos entomopatógenos (3 de Steinernema y 13 de Heterorhabditis) (100 JI/cm2 o 1 134 JI/insecto), en placas con arena estéril, constataron que los adultos fueron susceptibles a casi todos los aislados; no obstante, el porcentaje de mortalidad varió significativamente entre 0 (aislado SC de Steinernema carpocapsae) y 36,7 % (Heterorhabditis sp. aislado IBCBn40), después de siete días de exposición.
La máxima mortalidad en este estudio fue superior a 85 % (Fig. 3); sin embargo, Treverrow y Bedding (7) obtuvieron una mortalidad máxima de adultos de picudo de ~70 %, a partir de los 14 días de estar expuestos a los nematodos entompatógenos, pues la entrada de los nematodos no se produce hasta varios días después de contacto entre ambos organismos y solo penetran de 1 a 3 nematodos.
Además de ser efectivos los nematodos entomopatógenos en parasitar adultos de picudo del plátano en condiciones de laboratorio, diversas cepas también fueron eficaces en condiciones de campo; lo que fue constatado por Waturu et al. (21) en un estudio de campo, cuando cuatro días después de haber aplicado Steinernema karii Waturu, Hunt & Reid, a dosis de 5 millones de JI y Heterorhabditis indica Poinar et al., a 0, 4 millones de JI por m2, constataron mortalidades de adultos en todos los tratamientos, lo que evidenció, según los autores, que los nematodos tuvieron la capacidad de parasitar los adultos y causar mortalidad. La aspersión de S. carpocapsae (cepas ALL y UK) a dosis de 5x106 JI por m2 en 0,4 L de agua sobre pseudotallos partidos y tocones de pseudotallos, alcanzó 70 % de mortalidad de adultos de C. sordidus recuperados a los 14 y 21 días (22)
Sin embargo, Smith (23) informó que los tratamientos en campo con Heterorhabditis zealandica Poinar (cepa 327) y Steinernemu carpocapsae (Weiser) (cepa BW) no resultaron efectivas en el control de adultos de picudo cuando se aplicaron en incisiones de 200 mm en los rizomas residuales luego de la cosecha, lo que pudo estar relacionado con la presencia de agua en los hoyos y que, quizás, se necesitaban más aplicaciones; lo que ratifica la necesidad de realizar estudios antes de aseverar que una cepa representa un eficiente agente de control biológico de C. sordidus en campo.
Los adultos del picudo negro del plátano (C. sordidus) resultaron susceptibles a la cepa HC1 de H. amazonensis, donde el porcentaje de mortalidad aumentó cuando las concentraciones se incrementaron. A partir de estos resultados, se imponen estudios en condiciones semicontroladas y campo, que permitan determinar la eficacia de la cepa en esas condiciones y poder sugerir su incorporación en el Manejo Integrado de Plagas de los cultivos de banana y plátanos en Cuba.
