ARTICULOS ORIGINALES

 

Validación de un ELISA tipo inhibición para cuantificar polisacárido Vi en la vacuna antitifoídica cubana vax-TyViââ.

 

Validation of an inhibition-type ELISA for quantifying Vi polysaccharide content in the Cuban Typhoid Vaccine vax-TyViä

Esther María Fajardo, Ileana Delgado, Luis Riverón, Luis Izquierdo, Nuris Iglesias, Eduardo Álvarez, Alicia Perojo, Nadia Costa, Yolexis Tamayo, Eylín Jorge, Belkis Hernández, Yonaydi Díaz, Argentina Cruces, Niurka Gutiérrez, Ana Cristina Puig, Aleida Mandiarote, Roselyn Martínez, Daniel Cardoso

Instituto Finlay. Centro de Investigación-Producción de Vacunas. Ave.27 No. 19805. La Lisa. A.P. 16017, C.P. 11600. Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: [e-mail]

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RESUMEN

Se describe la validación de un ELISA tipo inhibición, reportado por primera vez en la literatura científica para cuantificar un antígeno vacunal: el polisacárido Vi de Salmonella Typhi, para ser empleado en el control de la calidad de la vacuna antitifoídica cubana vax- TyViâ. El ensayo consta de seis pasos: 1) Recubrimiento de placa de reacción con poli-L-lisina y posteriormente polisacárido Vi; 2) Bloqueo con leche descremada; 3) Inhibición o neutralización en tubos de suero anti-Vi de conejo, respectivamente, con polisacárido Vi de Curva de Calibración (concentraciones desde 1–32 μg/mL), control positivo y muestras de vacuna (3 diluciones); 4) Neutralización de anticuerpos anti-Vi libres, presentes en las mezclas anteriores, por el Polisacárido de Recubrimiento; 5) Reconocimiento de anticuerpos anti-Vi unidos a la placa (conjugado anti-IgG de conejo-fosfatasa alcalina) y 6) Revelado por reacción enzima-sustrato. Los parámetros de validación estudiados y sus resultados fueron: 1) Precisión, expresada como coeficiente de variación a tres niveles de concentración de polisacárido, comprendidos en el rango de su especificación (35, 50 y 70 μg/mL) y evaluada en términos de repetibilidad; precisión intraensayos (cuatro analistas) y reproducibilidad (seis analistas): £ 20%; 2) Linealidad (100*R2): 99,68 %; 3) Límite de detección: 0,5 μg/mL; 4) Exactitud (recuperación para las tres diluciones de la muestra: entre 100 y 118%), y 5) Robustez: no influye 1,5 h de bloqueo (p = 0,52) ni ± 5 min para leer placa (p = 0,56); influye grandemente la calidad del agua (p = 0,026), a favor del agua para inyección. El ensayo es adecuado para los fines propuestos y es una medida de la inmunogenicidad in vitro del polisacárido Vi.

Palabras claves: ELISA, polisacárido Vi, Salmonella Typhi, vacuna antitifoídica.

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ABSTRACT

Validation of an inhibition-type ELISA intended for quantifying a vaccine antigen, Vi polysaccharide from Salmonella typhi, is reported here for the first time in a scientific paper. It is devoted to the quality control of the Cuban typhoid vaccine vax-TyViä. The test requires six steps: (1) Coating the plate with poly-L-lysine and then Vi polysaccharide; (2) Blocking with skimmed milk; (3) Inhibition (or neutralization) in tubes of rabbit Vi antiserum with Vi polysaccharide contained in the Standard Curve (concentrations from 1 – 32 μg/mL), Positive Control and vaccine samples (3 dilutions) respectively; (4) Neutralization of free Vi antibodies existing in the previous mixtures by the coating polysaccharide; (5) Recognition of Vi antibodies bonded to the plate (Anti-rabbit IgG-alkaline phosphatase) and (6) Revealing by means of the enzyme-substrate reaction. The studied validation parameters and their results were: (1) Precision, expressed as the coefficient of variation, at three different polysaccharide concentration levels comprising the vaccine specification range (35, 50 and 70 μg/mL) and evaluated in terms of Repeatability, Intermediate Precision (four analysts) and Reproducibility (six analysts): £ 20%; (2) Linearity (100*R2): 99.68%; (3) Detection Limit: 0.5
μg/mL; (4) Accuracy (recovery at three different sample dilutions): between 100 y 118%, and (5) Robustness: neither 1.5 h blocking nor ± 5 min for plate reading influences the test (p = 0.52 and 0.56 respectively); however, water quality greatly influences the results (p = 0.026); water for injection showed the best results. The test is appropriate for the purpose it was validated; it also allows evaluating in vitro immunogenicity of Vi polysaccharide.

Keywords: ELISA, Vi polysaccharide, Salmonella typhi, Typhoid Vaccine

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