CENTRO DE INVESTIGACIONES Y DESARROLLO DE MEDICAMENTOS. DEPARTAMENTO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS

Efecto sobre la motilidad intestinal y toxicidad aguda oral del extracto fluido de Ocimum gratissimum L. (orégano cimarrón)

Lic. Raiza Vega Montalvo¹ y Téc. Carmen Carrillo Domínguez²

RESUMEN

Se determinó la actividad antagonista sobre la motilidad intestinal y la toxicidad aguda oral del extracto fluido de Ocimum gratissimum L., con menstruo al 70 %. Se evaluó su efecto sobre íleon aislado de cobayo, que se estimuló con una concentración submáxima de acetilcolina (5,45 x 10^-6 mg/mL) e incubó durante 10 min con las sustancias de prueba, en las concentraciones de 121, 242, 364 Fg/mL de sólidos totales. La toxicidad aguda oral se realizó en ratones mediante la determinación de la dosis letal media (DL₅₀) y se realizó la evaluación macroscópica de órganos y tejidos, así como la determinación del peso de órgano relativo al finalizar el estudio. Se encontró que el Ocimum gratissimum L. en las dosis ensayadas provoca una inhibición de 37,21; 62,25 y 94,31 % de la respuesta contráctil de acetilcolina; la DE₅₀ obtenida se corresponde con 180 Fg/mL de sólidos totales. Los valores de la DL₅₀ del extracto y el vehículo fueron 21,44 y 20,78 (mL/kg) respectivamente, el primero se corresponde con 2 081 mg/kg sobre la base de los sólidos totales. Los resultados mostraron que el extracto antagonizó la respuesta contráctil inducida por acetilcolina sobre el íleon aislado de cobayo y la toxicidad encontrada se debe a la presencia de alta concentración del vehículo empleado en el extracto. Se considera como un producto no tóxico (DL₅₀ > 2 000 mg/kg ).

Descriptores DeCS: MOTILIDAD GASTROINTESTINAL/efectos de drogas; EXTRACTOS VEGETALES/toxicidad; EXTRACTOS VEGETALES/farmacología; ILEON/efectos de drogas; PLANTAS MEDICINALES; DOSIFICACION LETAL MEDIANA; RATONES; COBAYOS PESO DE LOS ORGANOS/efectos de drogas; ACETILCOLINA

Ocimum gratissimum L. comúnmente conocido como orégano cimarrón es una planta que aparece a lo largo de toda la isla en forma de arbusto con 1 a 2 m de altura. Sus hojas constituyen la parte más utilizada en la terapéutica.¹ El principio activo fundamental es un aceite esencial que contiene fenoles, en su mayoría, y particularmente timol al cual se le atribuye actividad antibacteriana.² Se utiliza como antigripal, febrífugo, antiespasmódico, vermífugo, antidiarreico, antiálgico y en el tratamiento de las afecciones oculares y auriculares.³

La actividad antiespasmódica constituye la acción farmacológica más estudiada del Ocimum gratissimum L. En dichos estudios se ha demostrado que presenta una elevada respuesta contráctil sobre el músculo liso del íleon de curiel y el cólon de la rata, así como un incremento de la presión arterial de la rata, similar al provocado por la PGE₁.⁴

Desde el punto de vista toxicológico se ha reportado que, por vía oral en dosis excesivas, puede provocar irritación gastrointestinal y del sistema urinario, excitación y convulsiones. (Wening B, Robincau L. Elementos para una farmacopea caribeña. Seminario TRAMIL 3. La Habana, 1988:188-90.)

Resulta nuestro propósito evaluar el efecto antagonista de la contracción del íleon de cobayo inducida por acetilcolina del extracto, así como la toxicidad aguda oral de este preparado.

MÉTODOS

El material con que se obtuvo el extracto fue colectado en la Estación Vavilov de Güira de Melena en el mes de marzo de 1995 (número de herbario 0132). El extracto fue elaborado por repercolación con menstruo alcohólico al 70 % (lote 1) en la Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig" (CIDEM). Según las determinaciones del control de calidad realizado al extracto mediante NR SP311,⁵ posee 9,71 % de sólidos totales y 62 % de alcohol, así como un 0,39 % de aceite esencial, del cual corresponde el 60 % al timol.

Las concentraciones empleadas para ambos estudios fueron estimadas de acuerdo con los sólidos totales presentes en el extracto.

Íleon aislado de cobayo

Se emplearon segmentos de íleon aislado de cobayo, que fueron llevados a un baño de órganos aislados que contenía solución de Krebs a temperatura de 37 ^oC y carbógeno. Dicha preparación fue estimulada con una concentración submáxima de acetilcolina (5,45 x 10^-6 mg/mL) y posteriormente incubada durante 10 min con las sustancias de prueba (extracto, vehículo y/o atropina). Se ensayaron 3 concentraciones del extracto (121, 242 y 364 Fg/mL) que se corresponden con un volumen en baño de 50, 100 y 150 FL, respectivamente; también se evaluaron la atropina en la concentración de 6,95 x 10^-6 mg/mL y el efecto del vehículo hidroalcohólico (31 %) sobre el órgano aislado, con los volúmenes referidos anteriormente.⁶

El registro de las respuestas contráctiles se realizó con un transductor isotónico, acoplado a un polígrafo Nihon Kohden. Los resultados se procesaron mediante análisis de varianza de una vía de clasificación y una prueba de Duncan a posterior. La dosis efectiva media fue estimada mediante un método gráfico (método de los mínimos cuadrados).

Toxicidad aguda oral

La evaluación se realizó mediante la determinación de la dosis letal 50, para lo que se utilizaron 60 ratones albinos Suizos hembras, procedentes de la colonia del Laboratorio de Investigaciones Biológicas (CIDEM) con una masa corporal comprendida entre 18 y 22 g. Éstos fueron mantenidos en un cuarto con temperatura controlada de 20 ± 2 ^oC y ciclo de luz/oscuridad de 12-12 h. La alimentación consistió en ratonina peletizada y agua a voluntad.

La administración del extracto y el vehículo se realizaron por vía oral con previo ayuno de 4 h, en grupos de 10 animales cada uno, en volúmenes de 18, 22 y 26 mL/kg correspondientes a 1 748, 2 136 y 2 525 mg/kg de sólidos totales del extracto, respectivamente.

Los animales fueron observados constantemente durante las primeras 24 h, y diariamente durante un período de 14 días, registrando cualquier síntoma tóxico. Al finalizar este período se procedió al sacrificio por tracción de la nuca para realizarles la autopsia; se efectuó examen macroscópico de órganos y tejidos; además se extrajeron: corazón, riñón, bazo, pulmón, hígado, cerebro y ovarios para la determinación de su peso relativo y grupos de ensayo, los que fueron analizados por una vía de clasificación. El peso corporal se controló al inicio, a los 7 días, y al final del experimento, así como el incremento de peso se analizó estadísticamente mediante un test de comparación de medias.

El valor de la dosis letal 50 se estimó mediante el método estadístico de los Probits,⁷ según los sólidos totales presentes en el extracto.

RESULTADOS

Actividad anticolinérgica

En la figura 1 cada barra representa el valor medio de la variación en la altura (mm), provocada por las contracciones (mm) inducidas por acetilcolina. Las concentraciones ensayadas del extracto (121, 242 y 364 Fg/mL) inhiben la respuesta contráctil inducida por acetilcolina, lo cual aumenta proporcionalmente con el incremento de la dosis. Por otra parte, el vehículo empleado en la preparación no provoca una modificación significativa de la respuesta contráctil; también se refleja el antagonismo de la atropina sobre la respuesta contráctil cuando se incuba la preparación con 6,95 x 10^-6 mg/mL. Fig. 1. Efecto inhibitorio del Ocimum gratissimum L. sobre la contracción del íleon de cobayo inducida por acetilcolina.

Al realizar el análisis de varianza se encontró que existen diferencias significativas entre las respuestas inhibitorias de las diferentes sustancias ensayadas. El extracto fluido (242 y 364 Fg/mL) provoca una disminución significativa ( p< 0,05) de la contracción inducida por acetilcolina, en relación con el extracto 121 Fg/mL y el vehículo (50, 100 y 150 FL); se establece a su vez diferencias significativas entre estos últimos. En cuanto a la atropina el efecto inhibitorio logrado por la concentración ensayada no establece diferencias significativas con las 2 dosis más altas del extracto (242 y 364 Fg/mL ).

La figura 2 representa la curva dosis-efecto del extracto fluido de Ocimum gratissimum L., expresada en porcientos de inhibición; nótese que existe gran proporcionalidad entre el efecto alcanzado y las dosis ensayadas. Al estimar la dosis efectiva media ( DE₅₀ ) por interpolación y al ajustar la curva a la ecuación de una recta , mediante un método gráfico, se encontró que una dosis de 180 Fg/mL provoca inhibición de la respuesta contráctil de la acetilcolina en el 50 %.

Fig. 2. Relación dosis-respuesta del extracto fluido de Ocimum gratissimum L.

Toxicidad aguda oral

Los síntomas observados en las dosis administradas fueron sedación, respiración acelerada e incoordinación motora, los que desaparecieron en las 24 h posteriores a la administración.

La mortalidad obtenida por cada dosis de ensayo en ambas administraciones se observa en la tabla 1. La dosis letal 50 obtenida para el extracto y su vehículo, así como la pendiente de la curva dosis-respuesta se presentan en la tabla 2; ambas curvas cumplen con la condición de paralelismo y linealidad.

TABLA 1. Porcentaje de mortalidad obtenido en las distintas dosis de ensayo del extracto fluido de Ocimum gratissimum L. y su vehículo
 

Tratamiento	Dosis mL/kg	Dosis mg/kg	No. animales muertos	Mortalidad (%)
Extracto	18	1 748	1	10
fluido	22	2 136	6	60
	26	2 525	9	90
Vehículo	18	-	3	30
	22	-	5	50
	26	-	9	90

TABLA 2. Estimación de la dosis letal 50 (DL₅₀) del extracto fluido de Ocimum gratissimum L. y su vehículo
 

Tratamiento	DL50	Límites mL/kg	DL50 mL/kg	Límites mg/kg	Pendiente mg/kg
Extracto	21,44	19,30	2 081,41	1 873,82	16,13
fluido		23,40		2 271,87
Vehículo	20,78	16,87			10,47
		24,11	-	-

Al estimar la dosis letal 50 se comprobó que no existen diferencias significativas entre el extracto y el vehículo (alcohol 62 %), lo que indica que la toxicidad de la muestra se debe fundamentalmente a la presencia del alcohol en la formulación.

En la autopsia no se encontraron evidencias de alteraciones patológicas en los órganos analizados. En la tabla 3 se muestran las medias y las desviaciones estándar del peso relativo de los órganos en porcientos, donde no se encontró diferencias significativas entre los grupos formados cuando se realizo el análisis de varianza de una vía de clasificación.

TABLA 3. Peso relativo de órganos expresado en porcientos  

Grupos	Corazón	Riñones	Bazo	Pulmones	Hígado	Cerebro	Ovarios
Extracto
	0,530	0,590	0,530	0,760	6,030	1,180	0,031
DE	0,140	0,038	0,008	0,160	0,480	0,370	0,010
Vehículo
	0,520	0,710	0,780	0,960	7,480	1,370	0,026
DE	0,086	0,140	0,290	0,370	0,910	0,230	0,016

No se presentó disminución del peso corporal en ninguno de los grupos experimentales durante el estudio y no se encontraron diferencias significativas del aumento de peso entre los grupos con tratamiento de acuerdo con el test estadístico empleado para a = 0,05 (tabla 4).

TABLA 4. Comportamiento del peso corporal en el experimento  

Tratamiento	Peso promedio inicial (g)	Peso promedio final (g)	D P
Control	20,8	28	12,2
Extracto fluido	21,3	31,1	10,85
Vehículo	30,5	30,3	9,84

DISCUSIÓN

El extracto fluido de Ocimum gratissimum L. en las dosis empleadas provocó disminución significativa de la respuesta contráctil de acetilcolina. De acuerdo con los resultados encontrados las concentraciones de 242 y 364 Fg/mL bloquean el espasmo provocado por el agonista colinérgico, en similar magnitud que la inhibición evidenciada por la atropina, por lo que se obtuvieron 62,25 y 94,31 % inhibición, respectivamente. Dicho efecto se ha estudiado en fracciones aisladas, a partir de las hojas de Ocimum gratissimum L. por extracción lipídica y cromatografía de capa delgada, lo cual dio como resultado la existencia de algunos componentes, que disminuyen el efecto agonista de la acetilcolina sobre el íleon de cobayo y el cólon de rata. De aquí surge la hipótesis que, al ser extraíbles con solventes lipídicos, pudieran considerarse como lípidos o sustancias muy relacionadas con éstos.⁴

Otros estudios con varios tipo de compuestos ( ácidos grasos modificados, cerebrósidos y lisofosfolípidos) han indicado que la actividad espasmogénica depende de una insaturación y de la presencia de grupos hidroxílicos esenciales organizados específicamente.⁸ Esto constituye un punto de observación para determinar qué tipo de compuestos presentes en el Ocimum gratissimum L. son los responsables del efecto estudiado y, en un futuro, correlacionar otros usos terapéuticos con la actividad espamogénica.

En relación con la toxicidad encontrada, evidentemente influye el efecto del vehículo.⁹ La toxicidad efectiva del extracto fue de 97,7 % de la esperada, al compararla con éste, no se encontraron a su vez diferencias significativas entre ambos, en cuanto a la mortalidad obtenida. No obstante, el valor de DL₅₀ obtenido para el extracto permite clasificarlo como no tóxico (DL₅₀ > 2 000 mg/kg).

CONCLUSIONES

1. El extracto de Ocimum gratissimum L. antagonizó la respuesta contráctil inducida por acetilcolina sobre el íleon aislado de cobayo.
2. Según las normas de la Comunidad Europea,¹⁰ para la clasificación de la toxicidad aguda oral, el extracto de Ocimum gratissimum L. se considera no clasificado; el vehículo empleado en la formulación es el responsable del efecto tóxico.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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7. Finney DJ. Probits analysis. 3 ed. Cambridge: Cambridge University, 1971.
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9. Litter M. Farmacología experimental y clínica. 7 ed. Buenos Aires: El Ateneo, 1986:179-200.
10. Commission of the European Communities (1992 a) Annex to Commission Directive 92/69/EEC of 31 July 1992 adapting to technical progress for the seventeenth time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances. B- 1 Acute toxicity (oral). Off J Eur Comm 1992; (L 383 A) 35:110-2.

Recibido: 7 de julio de 1997. Aprobado: 9 de julio de 1997.

Lic. Raiza Vega Montalvo. Centro de Investigaciones y Desarrollo de Medicamentos. Avenida 26 No. 1605, Plaza, Ciudad de La Habana, Cuba.

¹ Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.
² Técnica Medio en Farmacia.

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