CENTRO DE INVESTIGACION Y DESARROLLO DE MEDICAMENTOS

Actividad antidermatofítica in vitro de aceites esenciales

Lic. Lizet Hernández Díaz,1 Dra Mayra Rodríguez Jorge,2 Lic. Dinah García3 y Lic. Jorge Pino Alea4

RESUMEN

Se evaluó la actividad antidermatofítica in vitro de las especies Ocimum gratissimum L., Ocimum tenuiflorum L., Pimenta dioica L y Piper auritum H.B.K. El estudio de esta actividad biológica se realizó mediante la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias con el empleo del método de diluciones en medio caldo sabouraud dextrosa. Se trabajaron muestras de aceites esenciales obtenidos en la Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig" y se empleó una batería microbiana integrada por los dermatofitos Microsporum canis, Trichophyton mentagrophytes y Trichophyton rubrum, todos provenientes de aislamientos clínicos. La cinética de la actividad fungicida, así como la caracterización química cualitativa y cuantitativa de los componentes volátiles también se valoraron. Los resultados demostraron la presencia de actividad en los aceites sobre las especies fúngicas estudiadas. Se destacó en tal sentido la susceptibilidad de M.canis frente al Ocimum tenuiflorum L, el cual presentó una concentración mínima inhibitoria de 0,15 mg/mL. Los estudios cinéticos corroboraron los resultados de la actividad antimicrobiana y se encontraron como componentes mayoritarios responsables de dicha actividad en los aceites, al eugenol presente en la Pimenta dioica L. y en Ocimum tenuiflorum L.; el timol, presente en Ocimum gratissimum L. y el safrol, presente en Piper auritum H.B.K.

DeCS: ARTHRODERMATACEAE; ACEITES VOLÁTILES; EUGENOL; TIMOL; TEST DE SENSIBILIDAD MICROBIANA.

Summary

The in vitro antidermatophytic activity of the Ocimum gratissimum L, Ocimum tenuiflorum L, Pimenta dioica L and Piper auritum H.B.K. species was evaluated. The study of this biological activity was conducted by the determination of the minimum inhibitory concentrations using the method of dilutions in Sabouraud dextrose broth medium. Samples of essential oil obtained at "Dr. Juan Tomás Roig" Experimental Station of Medicinal Plants were used and a microbial battery composed of Microsporum canis, Trichophyton mentagrophytes and Trichophyton rubrum dermatophytes, all of them from clinical isolations, was utilized. The kinetics of the fungicidal activity, as well as the qualitative and quantitative chemical characterization of the volatile components were also assessed. The results showed the presence of activity in the oils on the studied fungal species. It was stressed the susceptibility of M. Canis against Ocimum tenuiflorum L., which had a minimum inhibitory concentration of 0.15 mg/mL. The kinetic studies corroborated the results of the antimicrobial activity. The largest components responsible for this activity in the oils were: eugenol, present in Pimenta dioica L. and in Ocimum tenuiflorum L.; timol, present in Ocimum gratissimum L.; and safrol, present in Piper auritum H.B.K.

Subject headings: ARTHRODERMATACEAE; OILS, VOLATILE; EUGENOL; TIMOL; MICROBIAL SENSITIVITY TESTS.

Las enfermedades infecciosas ocupan un lugar importante en los países del tercer mundo. Son causa de enfermedades debilitantes, agudas, crónicas y en ocasiones mortales. Pueden predisponer a otras enfermedades, contribuir a la disminución de la capacidad física y mental del individuo y comprometer su productividad. Tienen por tanto importancia no sólo desde el punto de vista médico, sino también social y económico.

Teniendo en cuenta la existencia en Cuba de una flora muy rica y el arraigo popular de la Medicina Natural y Tradicional se ha venido trabajando en investigaciones científicas que garanticen el conocimiento y disposición de fitofármacos rigurosamente estudiados, que posibiliten la obtención de principios activos de bajo costo con efectos tóxicos inferiores a los existentes.

Por estas razones, el objetivo de esta investigación fue, evaluar la actividad antidermatofítica in vitro de 4 aceites esenciales de plantas pertenecientes a la flora cubana mediante la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI). Además se abordaron otros aspectos como la cinética de la actividad fungicida y la determinación química cualitativa y cuantitativa de los componentes volátiles de los aceites.

Métodos

Muestras

Se trabajaron muestras de aceites esenciales de las especies Ocimum gratissimum L. Ocimum tenuiflorum L. Pimenta dioica L y Piper auritum H.B.K. provenientes de la Estación Experimental de Plantas Medicinales " Dr. Juan Tomás Roig", ubicada en la provincia de La Habana, además eugenol y timol como componentes puros. Los aceites esenciales fueron obtenidos por hidrodestilación en un equipo Clevenger a partir de 40 g de material vegetal seco. Los datos generales de las especies vegetales utilizadas se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Datos generales de las especies vegetales utilizadas.

Especie vegetal	No. de herbario	Fecha de recolección	Parte destilada
Pimenta dioica	4609	5/94	Hojas
Ocimun gratissimum	0132	7/94	Hojas y sumidades floridas
Ocimum tenuiflorum	0019	9/93	Follaje
Piper auritum	4662	7/95	Hojas

 

Microorganismos

Los microorganismos utilizados fueron Microsporum canis, Trichophyton mentagrophytes y Trichophyton rubrum, todos provenientes de aislamientos clínicos y agentes comunes de dermatofitosis en el hombre. Las suspensiones fueron preparadas en solución salina y mantenidas a 4 °C hasta ajustárseles la concentración a 104 unidades formadoras de colonias/mL(ufc/mL.)

Determinación de la actividad antidermatofítica

La evaluación de la actividad antidermatofítica se realizó mediante la determinación de las CMI empleando el método de diluciones en medio líquido,1 para lo cual se usó caldo sabouraud dextrosa como medio de cultivo. La CMI se definió como la menor concentración a la cual el agente antimicrobiano es capaz de inhibir el crecimiento. Todos los tubos fueron incubados a 28 °C durante 15 días y se evaluó visualmente la inhibición del crecimiento microbiano.

Debido a la insolubilidad de los aceites en agua se utilizó etanol absoluto como solvente, por lo que fue necesario realizar paralelamente una serie blanco o control y se empleó el mismo procedimiento que con los aceites esenciales.

Análisis de la composición química de los aceites esenciales

El análisis de la composición química de los aceites esenciales se realizó por cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM) en un equipo Jeol JMS-DX 300 con una columna de cuarzo del tipo BP-1 y con helio como gas portador. La identificación de los componentes individuales se efectuó mediante sus espectros de masas a 70 eV comparándolos con los espectros informados en la literatura por Adams en 1995 y publicados por la Corp. Carol Stream, EE.UU. y en la base de datos IDENT desarrollada para compuestos volátiles por el IIIA. El análisis cuantitativo se realizó mediante la relación de las áreas medidas de los picos individuales con el área total de la cromatografía iónica reconstruida que se obtuvo en el sistema CG-EM.

Estudio cinético

Para realizar el estudio cinético se obtuvieron las curvas de crecimiento para cada microorganismo ploteando los valores promedios de peso seco en el tiempo. Se determinó en cada caso el momento en el cual se alcanzó la fase de crecimiento logarítmico. T. mentagrophytes y M. canis fueron las especies empleadas para este estudio.

A cultivos en zaranda se le añadieron cantidades prefijadas de los aceites correspondientes a los valores de CMI, 1/2 CMI y 2 CMI con el objetivo de conocer como ocurriría la acción fungicida en el tiempo. Adicionadas estas, se siguió el crecimiento tomando alícuotas de los cultivos a diferentes tiempos.

Los valores obtenidos de peso seco se plotearon contra el tiempo y las curvas obtenidas se compararon con la curva de crecimiento del microorganismo sin adición del aceite esencial.

Resultados

Los resultados obtenidos al evaluar la actividad antidermatofítica se muestran en la tabla 2.

Tabla 2. Valores de CMI expresada en mg/mL obtenidos para los diferentes antifúngicos sobre cada uno de los dermatofitos estudiados.

Muestras	M. canis	T. mentagrophytes	T. rubrum
Pimenta dioica	0,31	0,31	0,31
Ocimum tenuiflorum	0,15	0,62	0,62
Ocimum gratissimum	0,62	0,62	0,62
Piper auritum	1,25	0,31	1,25
Eugenol	0,33	0,33	0,16
Timol	0,10	0,10	0,05

De las especies vegetales estudiadas el Ocimum tenuiflorum L. frente a M. canis presentó el menor valor de CMI (0,15 mg/mL) mientras que Piper auritum H.B.K. para este mismo germen fue la especie que mostró el mayor valor de CMI. Esta última especie vegetal fue también la de mayor valor de CMI frente al T. rubrum (1,25 mg/mL). Pimenta dioica L. y Ocimum gratissimum L. presentaron los mismos valores de CMI frente a cada uno de los tres dermatofitos (0,31 mg/mL y 0,62 mg/mL), respectivamente.

Al realizarse la evaluación de la actividad antidermatofítica al eugenol y al timol se observó que frente a T. rubrum ambos presentaron los menores valores de CMI y para el resto de los microorganismos los valores coincidieron (0,33 mg/mL el eugenol y 0,10 mg/mL el timol).

En las curvas de crecimiento en cultivos agitados obtenidas para las especies de M. canis y T. mentagrophytes en medio caldo Sabouraud dextrosa (figuras 1-3) se comprobó que el inicio de la fase de crecimiento logarítmico se alcanzó alrededor del 5to día post inoculación, momento que constituyó el tiempo 0 de los estudios y tiempo a partir del cual una vez añadido el antifúngico comenzaron a observarse desviaciones del crecimiento normal de estas especies fúngicas.

 

Fig 1. Cinética de crecimiento de M.canis con Ocimum tenuiflorum L.

Fig 2. Cinética de crecimiento de T. mentagrophytes con Pimenta dioica L.

Fig 3. Cinètica de crecimiento de T. mentagrophytes con Piper auritum H.B.K.

 

Los resultados obtenidos en el análisis de la composición química cualitativa y cuantitativa de los aceites se muestran en las tablas.3-6 Como componentes mayoritarios se obtuvieron el eugenol, presente en los aceites de Pimenta dioica L. y Ocimum tenuiflorum L, el timol en Ocimum gratissimum L. y el safrol en Piper auritum H.B.K.

Tabla 3. Composición química del aceite esencial de O. gratissimum L.

Componentes	Porcentaje	Componentes	Porcentaje	Componentes	Porcentaje
Tricicleno	0,13	terpinen-4-ol + cis-hidrato de sabineno	4,4	p-cimeno	9,30
a-tujeno	2,58	a-terpineol	0,13	cis-b-ocimeno	0,30
a-pineno	1,32	p-cimen-8-ol-metileter	1,16	limoneno	2,12
Tolueno	0,05	carvona	0,09	trans-b-ocimeno	0,23
Camfeno	0,21	timol	32,60	g-terpineno	5,84
Sabineno	0,86	carvacrol	2,09	trans-hidrato de sabineno	1,05
b-pineno	0,72	eugenol	0,82	a-p-dimetilestireno	1,65
Mirceno	3,30	a-cubebeno	0,3	terpinoleno	0,31
a-felandreno	0,46	metil-eugenol	0,09	linalol	0,81
Car-3-eno	0,4	a-copaeno	0,43	borneol	0,21
a-terpineno	0,15	b-bourboneno	0,22	b-bourboneno	0,22
b-elemeno	0,41	b-gurjuneno	0,03	b-cariofileno	4,49
g-muroleno	0,06	trans-b-bergamoteno	1,1	cis-b-farneseno	0,06
a-humuleno	1,02	3,4-dimetoxiacetofenona	1,62	a-amorfeno	0,12

Tabla 4. Composición química del aceite esencial de O. tenuiflorum L.

Componentes	Porcentaje	Componentes	Porcentaje	Componentes	Porcentaje
a- tujeno	0,02	b- elemeno	18,01	a-pineno	0,03
b-cariofileno	23,07	canfeno	0,03	g-elemeno	0,07
sabineno	0,01	a-humuleno	2,04	b-pineno	0,02
a-amorfeno	0,11	mirceno	0,06	a-muruleno	0,
p-cimeno	0,30	a-selineno	0,47	1,8-cineol	0,06
trans,trans- a -ferneseno	0,12	limoneno	0,20	a-bulneseno	2,25
trans- b -ocimeno	0,07	b-chamigreno	2,51	g-terpineno	0,14
b-bisaboleno	1,14	a,p-dimetilestireno	0,02	calameneno	0,15
linalol	0,21	d-cadineno	0,29	isomentona	0,2
g-cadineno	0,08	borneol	0,3	elemol	0,89
mentol	0,15	óxido de cariofileno	3,79	terpinen-4-ol	0,12
cubenol	0,11	a-terpineol	0,04	trans-cadinol	0,21
timol	2,37	b-eudesmol	0,10	eugenol	34,26

Tabla 5. Composición química del aceite esencial de P. dioica L.

Componentes	Porcentaje	Componentes	Porcentaje
a- pineno	0,56	a- humuleno	10,12
mirceno	0,19	a- amorfeno	2,77
a-felandreno	1,12	a-muuruleno	1,76
p-cimeno	1,87	calameneno +- g-cadineno	1,12
1,8 cineol	14,69	g-cadineno	5,49
g-terpineno	0,56	terpinoleno	1,38
cadina-1,4-dieno	0,49	mentol	0,56
a-calacoreno	1,23	eugenol	31,14
óxido de cariofileno	2,69	alloaromadendreno	2,13
a-eudesmol	0,52	b-eudesmol	0,82

Tabla 6. Composición química del aceite esencial de P. auritum H.B.K.

Componentes	Porcentaje	Componentes	Porcentaje
a-tujeno	0,08	longifoleno	0,64
a-pineno	0,97	cipereno	0,07
canfeno	0,05	b-cariofileno	4,65
sabineno	0,08	cis-murola-4(14)-5-dieno	0,12
b-pineno	1,45	a-humuleno	0,47
mirceno	0,30	germacreno D	3,11
a-felandreno	0,05	biciclogermacreno	1,26
a-terpineno +p-cimeno	1,79	a-muroleno	0,60
limoneno	0,20	b-bisaboleno	0,98
cis-b - ocimeno	0,16	d-cadineno	0,79
trans-b -ocimeno	0,27	cadina-1,4-dieno	0,05
elemicina	0,10	g-terpineno	2,19
cis-nerolidol	2,80	terpinoleno	1,87
óxido de cariofileno	1,06	linalol	2,29
4-alilsiringol	0,33	canfor	0,02
1-epi-cubenol	0,13	terpinen-4-ol	0,08
b-copaen-4 -ol	0,07	safrol	64,50
cubenol	0,16	timol	0,11
a-munrolol	0,16	eugenol	0,29
a-cadinol	0,17	a cubebeno	0,14
14-hidroxi-a -muroleno	0,05	b-patchuleno	2,00
Ácido hexadecanoico	0,30	metil eugenol	0,04
1-octadecanol	0,03	b-bourboneno	0,17
a-terpineol	0,17

Discusión

Los resultados de la actividad antidermatofítica de los aceites esenciales de Ocimum gratissimum L. Ocimum tenuiflorum L. Pimenta dioica L. y Piper auritum H.B.K pusieron de manifiesto la actividad presentada por los mismos frente a las especies M. canis, T. mentagrophytes y T. rubrum, actividad que en todos los casos fue debida a un daño letal que ocasionó el aceite sobre la célula fúngica. Los valores obtenidos de CMI fluctuaron entre 0,15 mg/mL y 1,25 mg/mL.

El aceite esencial de Ocimum tenuiflorum L. frente a M. canis fue el que presentó la mayor actividad antidermatofítica mientras que P. auritum para este mismo germen mostró la menor actividad. En general de los 4 aceites evaluados, el de Pimenta dioica L. resultó ser el más activo contra M. canis, T. mentagrophytes y T. rubrum empleados.

No se observó en ningún caso efecto del solvente sobre las células microbianas, por lo que los resultados son sólo imputables a los aceites.

Varios investigadores estudiaron la actividad frente al dermatofito T. mentagrophytes de diferentes aceites esenciales, entre ellos una especie del género Piper (Piper aduncum) y observaron una actividad antidermatofítica bien definida de dicha especie vegetal,2 también se ha encontrado al safrol como principal componente de este aceite esencial.3 lo cual coincidió con los resultados de esta investigación. En la especie vegetal Piper betle también se ha detectado actividad antifúngica sobre los dermatofitos Microsporum gypseum y T. Mentagrophyte.4,5

Los estudios sobre la composición química cualitativa y cuantitativa de los aceites evaluados indicaron la presencia de compuestos a los que se les atribuyen propiedades antimicrobianas, 6-10 entre ellos se incluyen terpenos como el eugenol, safrol, timol, 1,8 cineol, a- humuleno, d- cadineno, amorfeno, b- cariofileno, b- elemeno, germaeieno, p-cimeno, g- terpineno, cis- sabineno hidrato, g- muroleno, mirceno, entre otros, algunos de los cuales se encuentran en proporción considerable.

En 1988, Janssen y colaboradores evaluaron la actividad de 4 especies de Ocimum (Ocimum canum, Ocimum trichodon, Ocimum gratissimum y Ocimum urticifolium) frente al dermatofito T. mentagrophytes y encontraron que la mayor actividad correspondía al aceite de Ocimum gratissimum L. el cual tenía como constituyente mayoritario al timol presente en un 46,7 %6, similar a los resultados de esta investigación.

Se encontró, en este trabajo, que la especie de Pimenta dioica L contiene como componente mayoritario al eugenol al igual que Ocimum tenuiflorum L. Estos resultados coincidieron con los publicados por Nabney y colaboradores11 para la Pimenta dioica L. y Lawrence y colaboradores12 para Ocimum tenuiflorum L. En dos de los aceites se identificaron más del 90 % de los componentes (Piper auritum H.B.K., 97,24% y Ocimum tenuiflorum L., 93,92 %) mientras que en los dos restantes sólo alrededor del 80 % (Ocimum gratissimum L., 83,06 % y Pimenta dioica L., 81,21 %).

Los resultados de la actividad del timol pusieron de manifiesto que solo, presenta una actividad antifúngica mucho mayor que cuando aparece como componente del aceite de Ocimum gratissimum L., lo que puede ser debido a la presencia de otros constituyentes que antagonizan su actividad. En el caso del eugenol la CMI obtenida para la Pimenta dioica L. hace suponer que el mismo es el responsable de dicha actividad. En 1998, Lis- Balchin y colaboradores informaron una fuerte bioactividad de aceites esenciales contra hongos filamentosos cuando el componente mayoritario en los mismos fue el eugenol y mucho menos pronunciado cuando el geraniol, el citronelol y el linalol fueron los componentes principales de los aceites.13 Al parecer en el aceite de Ocimum tenuiflorum L. existen otros constituyentes que potencian la acción del mismo.

El daño causado por los aceites en la célula microbiana varió en dependencia de la concentración añadida del agente. Se apreció como la correspondiente a ½ CMI ocasionó en estos hongos una acción fungistática, pues aunque inicialmente ocurrió una disminución del crecimiento microbiano, expresada a través de la disminución del peso seco de los cultivos, posteriormente se produjo un aumento, detectado entre el 10 y 11 día en el T. mentagrophytes y a partir del 7mo.día en el M. canis.

Este comportamiento fue diferente para un mismo microorganismo en dependencia del aceite, pues se observó que en Piper auritum H.B.K. la disminución y luego el aumento del crecimiento fue mucho más marcado que en la Pimenta dioica L., lo que debe estar relacionado con la composición química de los aceites, la cual difiere cualitativa y cuantitativamente.

Cuando se adicionaron las concentraciones de los aceites correspondientes a los valores de CMI y al doble de esta se observó la misma tendencia en el comportamiento, una disminución inicial del peso seco, seguida por un aumento y ya a partir del día 12 en el M. canis y del 13 en el T. mentagrophytes fue que ocurrió la disminución final del crecimiento debido a la acción fungicida del aceite.

A concentraciones superiores a la CMI no se observó ningún incremento en el efecto antimicrobiano, sino que se encontró un comportamiento similar al que se obtuvo cuando se añadieron concentraciones del agente correspondientes con las mínimas inhibitorias. Los resultados de estos estudios cinéticos se correspondieron con los publicados en diferentes artículos.2,6,8,14.
Finalmente se puede concluir que los 4 aceites evaluados tuvieron actividad antidermatofítica frente a los microorganismos utilizados pero fue el de P. dioica el más activo de todos.

Referencias bibliográficas

1. Vanden Berghe DA, Vlietinck AJ. Screening methods for antibacterial and antiviral agents from higher plants. Methods Plant Biochem 1991;6:47-9.
   
2. Habtemariam S, Gray AI, Waterman PG. Flavonoids from three Ethiopian species of Premna. Z Naturforsc 1992;47:144-8.
   
3. Gupta MP, Arjas TD, Williams NH, Bos R, Tattje DHE. Safrole, the main component of the essential oil from Piper auritum Panamá. J Nat Prod 1985;48 : 330-6.
   
4. Garg SC, Jain R. Biological activity of the essential oil of Piper betle. J Essential Oil Res 1992;4:601-7.
   
5. Baby P, Alankararao GSJG, Prassad YR. Leaf oil of Piper betle L. The in vitro antimicrobial studies. Indian Perfumer 1993; 37:91-9.
   
6. Janssen AM, Scheffer JC, Ntezurubanza L, Baerheim AW. Antimicrobial activity of some Ocimum species grown in Rwanda. Ethnopharmacology 1988;26:57-61.
   
7. Ntezurubanza L, Scheffer JJC, Baerheim Svendsen A. Composition of the essential oil of Ocimum gratissimum grown in Rwanda. Planta Medica 1987;53:395-8.
   
8. Claeson P, Radstrom P, Skold O. Bactericidal effects of sesqiterpene T-cadinol on S. aureus. Phytoterapy Res 1992;6:94-7.
   
9. Duy Cuong N, Thi Xuyen T, Mott O, Stronsky K, Presslova J, Jelicková Z, et al. Antimicrobial properties of vietnamese Cajaput oil. J Essential Oil Res 1994;6:63-7.
   
10. Marotti M, Piccaglia R, Giovanelli E. Effects of variety and ontogenic stage on the essential oil composition and biological activity of Fennel (Foeniculum vulgare Mill). J Essential Oil Res 1994 6:57-61.
    
11. Nabney J, Robinson FV. Constituents of pimento berry oil (Pimenta dioica). Flavour Ind 1972;3: 50-5.
    
12. Lawrence BM, Hogg JW, Terhuene SJ, Pechitakue N. Essential oils and their constituents. IX. Oils of Ocimum tenuiflorum and Ocimum basilicum from Thailand. Flavour Ind 1972; 3:47-52.
    
13. Lis-Balchin M, Deans SG, Eaglesham E. Relationship between bioactivity and chemical composition of commercial essential oils. Flavour Frag J 1998;13:98-104.
    
14. Himejina M, Kubo I. Fungicidal activity of poligodial in combination with anethole and indole against Candida albicans. J Agric Food Chem 1993;41:1776-80.

Recibido: 26 de febrero del 2003. Aprobado: 31 de marzo del 2003.
Lic. Lizet Hernández Díaz. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM)
Ave. 26 No. 1605 entre Boyeros y Puentes Grandes, Plaza, Ciudad de La Habana.

1 Licenciada en Microbiología. Aspirante a Investigadora
2 Médico Microbiólogo. Investigadora Titular.
3 Master en Química. Investigadora Auxiliar.
4 Doctor en Ciencias Técnicas. Investigador Titular.