Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología

Evaluación de la toxicidad por administración única del producto QT2B21 en ratas Sprague Dawley

MSc. Juan Carlos Rodríguez Aurrecochea,1 MSc. Waldo Quesada Cepero,2 Lic. Rita María Pérez,3 Lic. Ana Digna Ávila,4 Lic. Ana María Guzmán5 y Lic. Grettell León Cruz6

Resumen

Se realizó un estudio de toxicidad aguda en ratas Sprague Dawley de ambos sexos mediante la administración oral única del producto QT2B21 obtenido a partir de la especie de helecho Nephrolepis cordifolia, para determinar su toxicidad. Fueron evaluados 3 niveles de dosis: 33,33, 133,32 y 533,28 mg/kg. Se determinaron algunos índices hematológicos sin encontrar efectos tóxicos atribuibles a la administración del producto. Se realizaron los estudios anatomopatológico (por inspección macroscópica) e histopatológico de los principales órganos. La inspección de estos no demostró alteraciones macroscópicas. Según el resultado del estudio histopatológico, sólo fueron observadas diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de peso relativo de los testículos en el grupo tratado con la dosis intermedia con respecto al grupo control. Este efecto no fue dependiente de la dosis. Se concluyó que la administración única por vía oral del producto QT2B21, no produjo alteraciones por toxicidad que pudieran ser atribuidas al mismo. Se consideró este producto como tolerable en ratas Sprague Dawley de ambos sexos en el rango de dosis desde 33,33 hasta 533,28 mg/kg de peso.

Palabras clave: Plantas medicinales/ toxicidad: extractos vegetales/ toxicidad; ratas sprague-dawley; modelos animales de enfermedad.

Las plantas medicinales constituyen una alternativa curativa utilizada por el hombre desde la antigüedad. La búsqueda y desarrollo de nuevos productos derivados de plantas medicinales con acción farmacológica y que carecen de efectos secundarios importantes, constituye un aspecto de gran importancia en la medicina, ya que amplía el arsenal terapéutico de la misma.1,2 Se recomienda que el empleo de las plantas medicinales tradicionales se efectúe sobre una base científica donde pueda ser validada su efectividad y la relativa inocuidad de las mismas.3

Todo producto para poder ser valorado como un nuevo medicamento, lleva implícito la realización de un conjunto de investigaciones previas, entre las cuales están incluidos los estudios toxicológicos. La toxicidad aguda de un producto puede ser definida como los efectos adversos de cualquier naturaleza que aparecen en un tiempo breve, posterior a la administración de dosis única de un producto o bien de dosis múltiples administradas en un período de 24 h (OECD. The Organization for Economic Cooperation and Development, 1981).

Las pruebas de toxicidad aguda constituyen las primeras investigaciones en el conocimiento de un producto. Estos ensayos tienen como objetivos: definir la toxicidad intrínseca del compuesto, identificar los órganos blancos, obtener datos acerca del riesgo que conlleva la exposición aguda del producto, así como proporcionar información para la designación y selección de los niveles de dosis para la conducción de estudios a largo término.4

A partir de la especie de helecho Nephrolepis cordifolia que crece en Cuba, se ha obtenido un extracto al que se le atribuyen efectos sobre la infertilidad en el hombre (Lic. Ana María Guzmán, Comunicación personal, 2001). Para conocer su posible efecto tóxico en el hombre, fue evaluada, por especialistas del Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología (INOR), la toxicidad aguda del extracto liofilizado del helecho Nephrolepis cordifolia, administrado por vía oral en ratas de ambos sexos de la línea Sprague Dawley.

Métodos

Especie animal y línea. Se utilizaron 40 ratas adultas (4-6 semanas) de ambos sexos de la línea Sprague Dawley, provenientes del Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Se garantizó el cumplimiento de las medidas establecidas en los procedimientos normalizados de operación sobre la atención de los animales de experimentación.5-8 Los animales fueron mantenidos en las condiciones normadas para esta especie9 a una temperatura entre 21 y 25 °C, humedad mantenida entre un 55 y 65 % y 10 cambios de aire por h. Los ciclos de luz fueron de 12 horas/día. Se administraron 500 mL de agua y 300 g de pienso por caja, para su consumo "ad libitum" y se controlaron ambos cada 3 días.

Diseño experimental. Los animales machos con pesos corporales entre 260 y 300 g, y las hembras con pesos corporales entre 200 y 230 g, fueron seleccionados y distribuidos al azar en 4 grupos experimentales (3 tratados y 1 control). Cada grupo estuvo conformado por 5 animales de cada sexo, cantidad suficiente para realizar los estudios al concluir la administración del producto y finalizar el período de observación.10

Preparación del producto para su evaluación. Las hojas del helecho Nephrolepis cordifolia fueron suministradas por la Lic. Ana María Guzmán. Las mismas fueron picadas en pequeños pedazos y el extracto fue preparado por decocción durante 5 min en agua destilada. El extracto fue liofilizado y codificado como QT2B21.

La planta fue identificada por el DrC. Carlos Sánchez Villaverde, especialista en helechos del jardín Botánico Nacional.

Selección de la dosis. La dosis del producto, según la forma en que se administrará a los pacientes es de aproximadamente unos 300 mg, que equivale a 200 mg/m2 de superficie corporal para un hombre normal. La dosis equivalente para la rata es de 33,33 mg/kg de peso.11 Fueron evaluados 3 niveles de dosis: el correspondiente al equivalente en el humano, 4 y 16 veces este valor, o sea, las dosis de ensayo fueron 33,3; 133,32 y 533,28 mg/kg de peso.

Administración del producto QT2B21. Al inicio del tratamiento los animales fueron pesados y calculada la media del peso corporal para cada grupo. La preparación de las suspensiones del producto QT2B21 en solución salina fisiológica para ser administradas a las dosis correspondientes, se realizó en base a la media del peso corporal de los animales en cada grupo. El producto fue administrado por vía oral, por ser esta la vía de preferencia en los humanos, mediante una cánula intragástrica. Al grupo control se le administró 1 mL de solución salina fisiológica.

Observaciones Clínicas. Las ratas fueron observadas durante las primeras horas y luego diariamente hasta cumplimentar 15 días posadministración del producto, con el propósito de registrar cualquier síntoma que pudiera indicar toxicidad o la aparición de muerte. El peso de los animales fue registrado al inicio y al final del experimento y se calculó la ganancia de peso por día (cociente entre la diferencia peso final e inicial de los animales y el tiempo de duración del experimento).

Terminado el período de observación, los animales fueron sacrificados con vista a evaluar algunos índices fisiológicos y las posibles alteraciones anatomopatológicas de las cavidades y órganos que pudieran manifestarse de forma macroscópica. Para esto, los animales fueron anestesiados con éter, desangrados y sometidos a necrosis. La sangre de cada animal fue recogida en tubos plásticos con anticoagulante para ensayos posteriores.

Determinación de los índices hematológicos. Las muestras de sangre de cada animal fueron utilizadas para determinar el valor de hematocrito, conteo global de leucocitos y diferencial.12

Análisis anatomopatológico. Durante las necropsias, se realizó la descripción macroscópica de cavidades y de los órganos extraídos y se registró el peso de los mismos. Se extrajeron el hígado, el bazo, los riñones, el corazón, los pulmones, además de los ovarios en el caso de las ratas hembras y la próstata, los testículos y el epidídimo en los machos. Las muestras extraídas de las necropsias fueron conservadas en formol al 10 %, incluidas en parafina y cortadas en un micrótomo, con un grosor de 4-5 mm. Se usó la técnica tradicional de coloración con hematoxilina-eosina para la realización de los estudios histopatológicos.

Durante la realización del ensayo, se observó el estricto cumplimiento de las Buenas Prácticas de Laboratorio y Garantía de la Calidad.13

Análisis estadístico. Se calcularon las medias aritméticas y las desviaciones estándar para los índices fisiológicos y las demás variables estudiadas. La comparación entre los grupos experimentales para la búsqueda de diferencias estadísticamente significativas, se realizó por medio de la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis con un nivel de significación de 95 %. En los casos de las variables en las que se encontró diferencias significativas se procedió a la aplicación de la prueba de U Mann y Whitney.

Resultados

La administración única del producto QT2B21 no demostró alteraciones en el comportamiento, ni en el examen físico de los animales tratados durante el período de experimentación, además de no producir mortalidad en ningún grupo experimental. El consumo de alimento y agua por los animales de ambos sexos se mantuvo similar tanto para el grupo control, como para los tratados con diferentes dosis del producto.

En la tabla 1 se observa que los animales de ambos sexo, tratados con la menor dosis del producto (33,33 mg/kg), mostraron un menor incremento del peso corporal por día con respecto a los demás grupos experimentales. Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p > 0,05).

TABLA 1. Variación del peso corporal de las ratas tratadas con diferentes dosis del producto QT2B21(media aritmética ± desviación estándar, n=5)

Ratas machos.
Dosis (mg/kg)	Peso inicial	Peso final	Ganancia de peso (gramos / día)
Control	300,62 ± 19,15	360,96 ± 2959	4,02 ± 1,97
33,33	278,12 ± 13,19	332,64 ± 7,58	3,63 ± 1,15
133,32	262,05 ± 16,03	325,61 ± 13,78	4,24 ± 1,41
533,28	296,96 ± 9,94	360,23 ± 16,12	4,22 ± 1,28
Ratas hembras.
Dosis (mg/kg)	Peso inicial	Peso final	Ganancia de peso (gramos / día)
Control	229,61 ± 9,21	247,81 ± 15,06	1,21 ± 1,00
33,33	210,80 ± 14,63	213,36 ± 16,99	0,38 ± 0,33
133,32	207,67 ± 13,33	232,09 ± 16,66	1,63 ± 0,44
533,28	207,67 ± 6,53	228,17 ± 14,53	1,29 ± 0,84

En la tabla 2 se observa que no hay diferencias estadísticamente significativas ( p > 0,05) entre los grupos tratados y el grupo control para ambos sexos en los índices hematológicos. Existió una tendencia a la elevación de los leucocitos con la dosis del producto.

TABLA 2. Índices hematológicos de ratas Sprague Dawley de ambos sexos tratadas con el producto QT2B21(media aritmética ± desviación estándar, n=5)

Ratas machos.
Dosis (mg/kg)	Hematocrito	Leucocitos x109	Eosinófilos	Linfocitos	Polimorfos	Monocitos
Control	0,47 ± 0,03	7,26 ± 2,02	0,01 ± 0,01	0,81 ± 0,07	0,16 ± 0,05	0,02 ± 0,02
33,33	0,44 ± 0,08	8,08 ± 3,14	0,00 ± 0,00	0,83 ± 0,09	0,16 ± 0,08	0,01 ± 0,01
133,2	0,49 ± 0,03	8,80 ± 2,95	0,01 ± 0,01	0,84 ± 0,06	0,15 ± 0,07	0,00 ± 0,00
533,28	0,51 ± 0,02	9,18 ± 2,7	0,03 ± 0,02	0,70 ± 0,09	0,26 ± 0,08	0,02 ± 0,01
Ratas hembras.
Dosis (mg/kg)	Hematocrito	Leucocitos x109	Eosinófilos	Linfocitos	Polimorfos	Monocitos
Control	0,43 ± 0,06	6,12 ± 1,9	0,02 ± 0.01	0,84 ± 0,07	0,12 ± 0,05	0,03 ± 0,02
33,33	0,41 ± 0,05	8,10 ± 1,29	0,01 ± 0.01	0,86 ± 0,05	0,12 ± 0,05	0,02 ± 0,02
133,32	0,42 ± 0,03	7,30 ± 4,56	0,00 ± 0.00	0,80 ± 0,07	0,18 ± 0,06	0,01 ± 0,01
533,28	0,44 ± 0,03	6,82 ± 0,77	0,01 ± 0.02	0,82 ± 0,05	0,14 ± 0,05	0,03 ± 0,02

El examen anatomopatológico correspondiente a la inspección externa y macroscópica de los órganos y cavidades, no mostró la existencia de alteraciones que pudieran relacionarse con el tratamiento con el producto QT2B21.

Durante el estudio histopatológico, se extrajeron los órganos de interés. El porcentaje de peso relativo (%PR) se presenta en la tabla 3. Sólo se observaron diferencias estadísticamente significativas en el % PR de las ratas machos del grupo tratado con la dosis intermedia (133,32 mg/kg) del producto con respecto al grupo control.

TABLA 3. Peso relativo de los órganos de las ratas de ambos sexos tratadas con diferentes dosis del producto QT2B21 (media aritmética ± desviación estándar, n=5).

Ratas machos.
Dosis (mg/kg)	Hígado	Bazo	Riñones	Corazón	Pulmones	Próstata	Testículos	Epidídimo
Control	4,24 ± 0,34	0,20 ± 0,02	0,93 ± 0,04	0,37 ± 0,03	0,49 ± 0,03	0.45 ± 0.04	0,84 ± 0,07	0,39 ± 0,05
33,33	3,98 ± 0,15	0,18 ± 0,04	0,96 ± 0,04	0,33 ± 0,02	0,51 ± 0,05	0.41 ± 0.09	0,92 ± 0,07	0,40 ± 0,03
133,32	3,69 ± 0,42	0,17 ± 0,02	1,00 ± 0,02	0,35 ± 0,02	0,52 ± 0,06	0.46 ± 0.06	0,99 ± 0,10	0,46 ± 0,05
533,28	4,08 ± 0,25	0,20 ± 0,02	0,93 ± 0,07	0,37 ± 0,05	0,49 ± 0,01	0.44 ± 0.02	0,84 ± 0,07	0,38 ± 0,04
Ratas hembras.
Dosis (mg/kg)	Hígado		Bazo	Riñones	Corazón	Pulmones	Ovarios
Control	4,25 ± 0,13		0,22 ± 0,03	0,87 ± 0,06	0,36 ± 0,04	0,54 ± 0,04	0,08 ± 0,02
33,33	3,61 ± 0,25		0,19 ± 0,02	0,92 ± 0,11	0,36 ± 0,03	0,57 ± 0,07	0,09 ± 0,00
133,32	3,99 ± 0,63		0,22 ± 0,02	0,84 ± 0,04	0,35 ± 0,03	0,61 ± 0,03	0,06 ± 0,01
533,28	4,25 ± 0,40		0,25 ± 0,04	0,87 ± 0,02	0,39 ± 0,03	0,57 ± 0,14	0,10 ± 0,01

Según los resultados obtenidos del examen histopatológico de los órganos estudiados, tampoco fueron observadas alteraciones que indicaran toxicidad ocasionada por el producto empleado.

Discusión

Aunque fue observado un aumento gradual de los leucocitos con respecto al incremento de la dosis del producto, en ninguno de los grupos el valor de esta variable fue superior al valor informado como normal para la especie, al igual que la fórmula hematopoyética, que siempre se mantuvo en valores normales.14 A los órganos extraídos durante la necropsia para su estudio: hígado, corazón, pulmones, bazo, riñones, próstata, testículos y epidídimo en el caso de los machos y ovarios en las hembras, se los determinó el % PR. El análisis de estos datos mostró, que en el caso de las ratas macho tratadas con las diferentes dosis del producto, hubo un ligero aumento en el % PR de los testículos comparados con el grupo control. Sin embargo, este incremento sólo fue estadísticamente significativo para la dosis intermedia (133,32 mg/kg) del producto. El hecho de que a la dosis máxima (533,28 mg/kg) no se hayan encontrado diferencias estadísticamente significativas con respecto al grupo control, hace pensar, que el efecto observado para la dosis media, puede ser debido a una acción farmacológica del producto (donde los testículos son los órganos dianas), y no en un efecto tóxico dependiente de la dosis.

En el caso de las ratas hembras también fueron observadas pequeñas diferencias en el % PR de los ovarios para los diferentes grupos experimentales, pero estas no fueron estadísticamente significativas en ninguno de los casos. Para el resto de los órganos no hubo diferencia estadísticamente significativa entre los grupos experimentales (p<0,05).

De acuerdo a los resultados obtenidos, se puede concluir que la administración única por vía oral del producto QT2B21 en ratas de la especie Sprague Dawley de ambos sexos, no indujo manifestaciones de toxicidad en los animales tratados, y los órganos estudiados no tuvieron alteraciones macroscópicas, ni microscópicas atribuibles al producto para las dosis empleadas (33,33, 133,32 y 533,28 mg/kg).

Agradecimientos

Agradecemos a los técnicos del laboratorio de Química y Toxicología María Luisa Acevedo, Lázara Wong y Josué Rodríguez Castro su participación en este trabajo.

Summary

A study of acute toxicity was conducted in Sprague Dawley rats of both sexes by the sole oral administration of the QT2B21 product obtained from the species of Nephrolepis cordifolia fern to determine its toxicity. 3 dose levels were evaluated: 33.33, 133.32, and 533.28 mg/Kg. Some hematologic indexes were determined without finding toxic effects attributable to the administration of the product. The anatomopathological (by macroscopic examination) and histopathological studies of the main organs were conducted. Their examination did not show macroscopic alterations. According to the result of the histopathological study, only statistically significant differences were observed in the percentage of relative weight of the testes in the group treated with the intermediate dose as regards the control group. This effect did not depend on the dose. It was concluded that the sole oral administration of the QT2B21 product did not bring about alterations due to toxicity that may be attributed to it. This product was considered as tolerable in Sprague Dawley rats of both sexes in the dose range from 33.33 to 533.28 mg/Kg of weight.

Subject headings: PLANTS, MEDICINAL/toxicity; PLANT EXTRACTS/toxicity; RATS, SPRAGUE-DAWLEY; DISEASE MODELS, ANIMAL.

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Recibido: 5 de diciembre de 2003. Aprobado: 21 de enero de 2004.
MSc. Waldo Quesada Cepero. Instituto de Oncología y Radiobiología. Calle 29 y E, Vedado. AP 10400, La Habana, Cuba. Telf: (53-7) 552589; FAX: [phone]; E-mail: [e-mail]

1Máster en Biomedicina. Médico Veterinario. Investigador Agregado.
2 Máster en Radioquímica. Aspirante a Investigador.
3Licenciada en Química. Investigadora Auxiliar.
4Licenciada en Química. Investigadora Agregada.
5 Licenciada en Biología.
6 Licenciada en Bioquímica.