Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

Efecto cicatrizante de la crema de extracto etanólico de cera de caña

DraC. Juana I. Tillán Capo,1 DraC. Irma Castro Méndez,2 Dra. Viviana Bueno Pavón,3 Téc. Carmen Carrillo Domínguez 4 y Tec. Melba Ortiz Infante4

Resumen

Objetivo: evaluar la actividad cicatrizante de formulaciones semisólidas elaboradas con diferentes concentraciones de extracto etanólico de cera de caña (2,5, 5, 10, 20, 30 y 40 %) en ratones con heridas en el área dorsal escapular. Se utilizó la crema de pantenol al 5 % como control positivo.
Métodos: se realizaron heridas de 2 cm2 en el área dorsal escapular de ratones de 30 g de peso corporal. La aplicación de la sustancia a evaluar se realizó diariamente durante un período de 21 días, y se observó, también en este período, el tiempo de aparición, caída de la costra y cicatrización del área. Al finalizar el tratamiento, los animales fueron sacrificados para la toma de fragmentos de piel regenerada y su posterior procesamiento y evaluación histológica, con lo cual se hizo una clasificación de la maduración de la dermis en 3 grados y 7 estadios a partir de la presencia de fibroblastos de mayor a menor grado relacionada con las fibras colágenas, vasos de neoformación, presencia o no de folículos pilosebáceos e infiltrado de células redondas. Los animales que alcanzaron clasificaciones de estadios 6 ó 7 fueron considerados como respuesta positiva para el cálculo de la dosis efectiva cincuenta.
Resultados: se encontró una relación dosis-efecto cicatrizante en el rango de concentraciones desde 2,5 hasta el 10 % del extracto etanólico de cera de caña en la formulación, no así para las cremas que contenían de 20 a 40 % donde la acción fue disminuyendo a medida que se incrementaba el extracto. La dosis efectiva cincuenta de la formulación fue de 5,1 %.
Conclusiones: las formulaciones de cremas que contenían 5 y 10 % de extracto etanólico de cera de caña mostraron los mejores efectos cicatrizantes de heridas en ratones, comparables a los alcanzados con la crema de pantenol al 5 %.

Palabras clave: Extracto etanólico de cera de caña, cicatrización, pantenol, cremas, ratones.

El extracto etanólico de cera de caña (EEC) es un producto natural, derivado de la industria azucarera; compuesto por una mezcla de ácidos grasos (mirísticos, palmítico, esteárico, aráquico, decosanoico), por alcoholes superiores (tetracosanol, hexacosanol, octacosanol, triocosanol) y por fitosteroles (stigmasterol, b-sistosterol). La actividad biológica de estas sustancias ha sido informada por algunos investigadores.1,2

En un screening realizado para evaluar la posible actividad cicatrizante que se le atribuía al aceite de cachaza y los extractos etanólicos de cera de caña se pudo observar que dicho efecto era propio de los extractos etanólicos. También trabajos realizados con cremas a las concentraciones de 5, 10 y 20 % de EEC en animales de experimentación quemados en el área dorsal, demostraron un efecto regenerador del tejido dañado, donde la actividad de las cremas con las diferentes concentraciones de EEC no mostró diferencias significativas, aunque se pudo apreciar una tendencia más favorable hacia las concentraciones bajas, quizás debido a que en los modelos de quemaduras se dificulta más lograr la homogeneidad de la lesión (Tillán Capó JI, Castro Méndez I, Bueno Pavón V. Acción cicatrizante de cremas de extracto etanólico de cera. I Simposio del CIDEM. La Habana; 1996). De aquí el interés de las autoras en conocer la efectividad de la crema EEC sobre heridas desarrolladas en animales de experimentación y definir las mejores dosis de aplicación terapéutica de la misma.

Métodos

Animales

Se utilizaron 30 ratones suizos machos por grupo de 32-35 g de peso corporal, procedentes del bioterio del laboratorio de Investigaciones Biológicas, alojados en jaulas individuales durante 21 días con temperatura controlada de 22 ± 2 °C, humedad de 40-60 % y ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h. Los animales se mantuvieron con libre acceso al agua y pienso peletizado CMO 100, suministrada por el Centro Nacional de Producción de Animales para Laboratorios (CENPALAB)

Se evaluaron las cremas formuladas por el departamento de Formas Terminadas del Centro de Investigaciones y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM) a las concentraciones de 2,5, 5, 10, 20, 30 y 40 % de EEC en heridas abiertas desarrolladas en animales de experimentación bajo el efecto anestésico de 30mg/kg de pentobarbital sódico. También se evaluó la crema placebo como control negativo y una crema de pantenol al 5 % como control positivo.

Procedimiento experimental

Todos los animales fueron depilados 24 h antes de realizarle el corte en la región escapular, en una área de 2 x 2 cm2, que incluyó piel y tejido celular subcutáneo.

La aplicación de la sustancia a evaluar se realizó diariamente durante un período de 21 días, se observó el tiempo de aparición y caída de la costra, cicatrización del área, durante todo el período experimental

Al finalizar el tratamiento, los animales fueron sacrificados mediante sobredosis de anestesia e inmediatamente se realizaron los cortes longitudinales de la piel regenerada, que incluyó parte de la piel sana tomada como referencia para las observaciones histológicas. Dichos fragmentos fueron fijados en formol neutro al 10 % y procesados para su inclusión en parafina. Las coloraciones se realizaron con hematoxilina eosina para su observación y evaluación histológica.

Posteriormente se realizaron las observaciones al microscopio y la clasificación de maduración de la dermis que permitieron hacer una evaluación del grado de cicatrización.3

Los grados a la vez fueron divididos en 7 estadíos diferentes; se tomó como criterio fundamental la presencia de fibroblastos de mayor a menor grado relacionada con las fibras colágenas en sentido inverso o sea de menor a mayor cantidad. También se valoró en la dermis: vasos de neoformación, presencia o no de folículos pilosebáceos e infiltrado de células redondas siguiendo la técnica propuesta por González-Quevedo.3

La determinación de la dosis efectiva cincuenta (DE50), se cálculo mediante un análisis de Probit4 y se consideró como respuesta positiva aquellos animales cuyos grados de cicatrización a la observación microscópica alcanzaron estadíos 6 ó 7.
La variable tiempo de cicatrización o cierre de la herida fue analizada mediante la prueba t de Student para muestras independientes y para el análisis de la maduración de la dermis se empleo la prueba estadística Chi-cuadrado.4

Resultados

Casi todos los animales comenzaron a presentar la formación de la costra entre los 3 y 4 días e inició su caída a partir del día 6 sin establecer diferencias entre los tratamientos. Al inicio del experimento murió un animal en el grupo tratado con 10 % de EEC y otro en el grupo de 20 %.
Se encontró diferencia significativa (p< 0,05) en el tiempo de cicatrización entre los animales del grupo placebo y los tratados con cremas que contenían 5, 10 % de EEC y pantenol al 5 %. Sin embargo, tratamientos con mayores concentraciones de EEC en las cremas (20, 30 y 40 %) no mostraron efecto cicatrizante en la observación macroscópica y su efecto fue muy similar al alcanzado con los animales tratados con placebo.

Fig.1. Porcentaje de animales que cicatrizaron antes de los 21 dias.

En la figura 2 se muestra el porcentaje de animales de cada grupo que alcanzaron los estadíos 6 y 7 (grupo III-dermis madura) correspondiendo los mayores valores al grupo tratado con EEC al 10 % y a los tratados con la crema de pantenol 5 %.

Fig. 2. Porcentaje de EEC en las cremas.

El análisis estadístico aplicado a los resultados de la evaluación microscópica indicó que el grupo tratado con las cremas de EEC al 5 y al 10 % se comportó de forma similar al pantenol al 5%, y no existieron diferencias significativas entre ellos. Sin embargo, estos grupos fueron diferentes del grupo tratado con placebo lo que demostró un efecto cicatrizante significativo en la evaluación histológica.

Los grupos de animales tratados con las cremas de 30 y 40 % de EEC no mostraron diferencias significativas con el grupo tratado con placebo. Esto corroboró los resultados obtenidos en la observación macroscópica.

El cálculo de la dosis efectiva cincuenta (DE50) se pudo realizar mediante un Probit, considerando la primera fase de la curva de la figura 2. Dicho valor fue de 5,1 % de EEC en la formulación (figura 3)

Fig. 3. Curva dosis respuesta. Dosis efectiva media de la crema 5,1 %.

Discusión

En la figura 1 se observa que los menores porcentajes de animales que cicatrizaron totalmente antes del día 21 correspondieron al grupo tratado con placebo y las formulaciones de cremas con EEC a las concentraciones de 20, 30 y 40 %; mientras que los mayores porcentajes de cicatrización, a los grupos tratados con pantenol al 5% y las formulaciones de cremas con EEC al 5 y 10 %. Estos resultados coincidieron con los hallazgos de Tillán y otros (Tillán Capó JI, Castro Méndez I Bueno Pavón V. Acción cicatrizante de cremas de extracto etanólico de cera. I Simposio del CIDEM. La Habana; 1996).

De acuerdo a las observaciones macroscópicas se pudo apreciar que los animales tratados con las cremas de 30 y 40 % de EEC formaban una costra muy gruesa que no se dispersaba bien en la zona aplicada y lejos de beneficiar la cicatrización impedía el buen desarrollo de la misma. Esto se asoció con una baja dispersión y penetración del EEC en los tejidos que limitó su acción de reepitelización y cicatrización de las heridas. Estas observaciones se correspondieron con las obtenidas en los estudios histológicos reflejados en los estadíos alcanzados para cada tratamiento (figura 2).

Los animales cuyas evaluaciones alcanzaron estadíos 6 y 7 de cicatrización fueron considerados como criterio de positividad en cuanto a calidad de regeneración del tejido (contenido de fibras colágenas, vasos de neoformación y presencia de folículos pilosos), lo que permitió realizar una curva dosis-respuesta (figura 2) donde se observa que en el rango de 2,5 a 10 % de EEC se corresponde con una curva dosis-respuesta de pendiente positiva, no así para el rango de dosis de 20 a 40 % de EEC en la formulación de crema en la cual se produjo una disminución del efecto dependiente del incremento de la dosis.

Los resultados alcanzados en el presente trabajo coincidieron con los obtenidos en el experimento de animales quemados, en el que a pesar de no existir diferencias significativas entre las dosis de 5, 10 y 20 %, se pudo apreciar una tendencia de mayor efectividad entre las 2 primeras dosis (Tillán Capó JI, Castro Méndez I, Bueno Pavón V. Acción cicatrizante de cremas de extracto etanólico de cera. I Simposio del CIDEM. La Habana; 1996).

Los resultados alcanzados con las cremas de EEC al 5 y 10 % en las observaciones microscópicas coincidieron con aquellos obtenidos con otras sustancias conocidas como cicatrizantes tales como el factor de crecimiento epidérmico, Aloe crema con y sin sulfadiazina de plata (Tillán Capó JI y otros. Actividad cicatrizante de la crema de Aloe con sulfadiazina de plata. Informe técnico. CIDEM, 1994), quitina y hasta el pantenol al 5 % utilizado en el presente trabajo. Estos resultados mostraron una gran diferencia con relación a los controles en las características de la regeneración y formación del nuevo tejido, alcanzando alguno de ellos la estructura total de piel normal en el período de observación. Fue interesante observar como el EEC a concentraciones de 5 y 10 % fue capaz de estimular la cicatrización tanto cuantitativa como cualitativamente, al producir una epitelización rápida y con estadío 7 en la maduración de la dermis, comparables a las logradas con la crema de pantenol al 5 %.

En el grupo placebo sólo el 9 % de los animales logró alcanzar un estadío 6 y sólo el 60 % de animales cicatrizaron antes de los 21 días.

La formación de colágenos alcanzada en los grupos tratados con EEC 5, 10 % y pantenol pudiera deberse, bien a una estimulación de su formación o a una acción inhibidora sobre la colagenasa lo que permitió, en este caso de heridas abiertas, que se destruyera menos cantidad de colágeno que lo habitual.3

Se puede concluir que la crema EEC al 5 y 10 % fue efectiva en la cicatrización de heridas desarrolladas en animales de experimentación.

Summary

Objective: To evaluate the cicatrizing activity of semisolid formulations prepared with different concentrations of ethanolic extract from sugar cane wax (2, 5, 10, 20, 30 and 40 %) in mice with wounds in the dorsal scapular area. Panternol cream 5 % was used as positive control. Methods: wounds of 2 cm2 were made in the scapular dorsal area of mice of 30 g of body weight. The substance to be evaluated was applied for 21 days. The time of appearance, the falling of the crust and the cicatrization of the area were also observed during that period. At the end of the treatment, the animals were sacrificed for taking fragments of regenerated skin and for its further processing and histological evaluation. Dermis maturation was classified into 3 degrees and 7 stages, starting from the presence of fibroblasts of greater or lesser degree related to the collagen fibers, neoformation vessels, presence or not of pilosebaceous follicles and round cell infiltrates. The animals that were given classfications of stages 6 or 7 , were considered as a positive response for the calculation of the fiftieth effective dose. Results: it was found a dose-cicatrizing effect relation in the range of concentrations from 2.4 to 10 % of the ethanolic extract from sugar cane wax in the formulation. It was not so for the creams containing from 20 to 40 %, where the action decreased as the extract increased. The fiftieth effective dose of the formulation was 5.1 %. Conclusions: the formulations of creams containing 5 and 10 % of ethanolic extract of sugar cane wax showed the best cicatrizing effects of wounds in mice, comparable with the attained with the cream pantenol 5 %.

Key words: Sugar cane wax ethanolic extract, cicatrization, pantenol, creams, mice

Referencias bibliográficas

1. Lishtvan I, Belkevich P, Dolidovich E, Sherenment L. Properties of Peat. Internac Peat J. 1987;165-78.
   
2. Belkevich P, Lishtvan I. Ceras de la turba y del carbón mineral. Instituto de la Turba de Minsk. La Habana: Editorial Ciencia y Técnica; 1989.
   
3. González-Quevedo Rodríguez M, Abin G, Wolt N, Batista M, Ramos I. Quemaduras dérmicas tratadas con una crema de Aloe barbadensis Miller cultivada en Cuba. Estudio Experimental. En: Compendio de investigaciones sobre Aloe barbadensis Miller. La Habana: ISMM, MINFAR;1990.p. 36-109.
   
4. Shayne G, Carrol W. Statistics for toxicologists. En: Wallace Hayes A, editor. Principles and methods of Toxicology. New York: Raven Press; 1989.p.435-83.

Recibido: 25 de mayo de 2000. Aprobado: 4 de junio de 2000.
DraC. Juana I. Tillán Capó. Ave 26 No. 1605 e/ Puentes Grandes y Ave Boyeros. Plaza. La Habana, Cuba. E-mail: [e-mail]

1 Doctora en Ciencias Veterinarias. Investigadora Auxiliar.
2 Doctora en Ciencias Químicas. Investigadora Titular.
3 Doctora en Medicina Veterinaria.
4 Técnico Medio en Farmacia.